全 文 ：植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (4): 434-441, w w w .chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2009.04.004
收稿日期 : 2009-05-14; 接受日期 : 2009-06-07
基金项目 : 教育部留学归国人员科研启动基金 (No.[2004]527)
* 通讯作者。E-mail: changentian@yahoo.com.cn
.研究报告.
破坏光敏色素 A改变生长素反应因子 8的表达谱
王海 1, 2 , 周玉萍1, 王小兰 1 , 林芳 3 , 段俊 2, 田长恩 1, 3 *
1广州大学植物抗逆基因功能研究广州市重点实验室 , 广州 510006
2中国科学院华南植物园 , 广州 510650; 3广州大学生命科学学院 广州 510006
摘要 拟南芥生长素反应因子8(auxin response factor 8, ARF8)受光诱导表达, 涉及光信号转导。为阐明光信号通过光受
体传递给ARF8的过程和机理, 首先利用半定量RT-PCR分析发现, PhyA的突变促进幼苗中ARF8的表达, 而PhyB、Cry1和Cry2
的突变对ARF8的表达没有明显影响。进而, 利用GUS染色以及半定量和定量RT-PCR方法, 系统分析PhyA基因的突变对ARF8
基因表达的影响。结果表明, 在黑暗、白光和远红光条件下, PhyA突变均明显提高拟南芥(Arabidopsis thal iana)幼苗子叶和叶
片中ARF8的表达水平, 并且明显降低其在幼苗下胚轴、茎尖和根尖中的表达水平。上述结果说明, PhyA基因的突变组成型地改
变了ARF8基因的表达谱。然而, ARF8的突变并未明显改变PhyA的表达。说明在远红光信号通路中, ARF8位于PhyA的下游。
关键词 生长素反应因子8, 远红光信号 , 基因表达 , 基因突变 , 光敏色素A
王海 , 周玉萍 , 王小兰 , 林芳 , 段俊 , 田长恩 (2009). 破坏光敏色素 A改变生长素反应因子 8的表达谱 . 植物学报 44, 434-441.
光是影响植物生长发育的重要环境因素, 而生长
素则是植物体内调节生长发育的重要激素。生长素
参与植物的下胚轴伸长(Gray et al., 1998)、避阴反
应(Morell and Ruber t i , 2000)和去黄化(Swarup,
2002)等光控发育过程的调节。然而, 其分子机理尚
不清楚。
作为转录因子 , 生长素反应因子(auxin response
factor, ARF)在调控生长素所诱导的基因表达中起着
中心作用(Hagen and Guilfoy le, 2002; Wei et al., 2006;
Guilfoy le and Hagen, 2007)。在拟南芥(Arab idopsis
thaliana)中, ARF8抑制下胚轴伸长、削弱顶端优势
(Tian et al. , 2004)、促进茉莉酸生成和花成熟(Nagpal
et al., 2005; Ru et al., 2006)、调控雄蕊和果实发育
(Tian et al., 2005; Goetz et al. , 2006, 2007)。在白光
下, ARF8基因的突变体 arf8-1的幼苗呈现长下胚轴
表型, 其超量表达转基因幼苗则呈现短下胚轴表型
(Tian et al., 2004), 说明 ARF8抑制白光下下胚轴伸
长。进一步研究发现 , ARF8受光的诱导在下胚轴中
强烈表达, 进而促进某些 GH3(Gretchen Hagen 3)基
因的表达, 而 GH3蛋白又催化生长素从游离态转变
为结合态, 降低了组织内游离生长素的含量 , 最终导
致下胚轴伸长受抑制(Tian et al., 2004; Wang et al.,
2008)。在水稻(Oryza sativa)中, Yang等(2006)发现
了 microRNA167-ARF8-GH3的信号通路。但是, 光
信号经光受体传递给 ARF8的过程和机理尚不清楚。
拟南芥具有完善的光信号感受系统 , 主要包括:
远红光受体光敏色素A(phytochrome A, PhyA); 红光
受体主要为光敏色素B(phytochrome B, PhyB), 还包
括 PhyA、C、D、E; 蓝光 /紫外光 A受体隐花色素 1
(cryptochrome 1, Cry1)、隐花色素2(cryptochrome 2,
Cry2)、隐花色素 3(cryptochrome 3, Cry3)、向光素
1(phototropin 1, Photo1)和向光素 2(phototropin 2,
Photo2)以及 UV-B 受体等(Tepperman et al. , 2001;
Schäfer and Nagy, 2006; Lorrain et al. , 2006)。PhyA
是迄今所知拟南芥中唯一的远红光受体, 介导远红光
极低辐照度反应(very low fluence response, VLFR)和
高辐照度反应 (h igh i rradi ance respons e, HIR)
(Schepens et al., 2004), 其功能缺失突变体 phyA 在
435王海等: 破坏光敏色素A改变生长素反应因子 8的表达谱
远红光下呈现子叶小且闭合、具弯钩、下胚轴显著
伸长的表型(Dehesh et al. , 1993; Reed et al. , 1994;
Sharrock and Clack, 2002)。
目前已有许多 PhyA 信号通路成分被分离和鉴
定, 如 FHY1和 FHY3(Whitelam et al. , 1993)、SPA1
(Hoecker et al., 1998)、FIN219(Hsieh et al., 2000)、
PAT1(Bolle et al. , 2000)、EID1(Buche et al. , 2000)、
FHY4(Fry et al. , 2002)、FIN2(Jung et al., 2005)等;
部分与 PhyA 直接作用的转录因子也已被发现 , 如
HFR(Fairchild et al. , 2000)等。但是有关生长素反应
因子涉及 Phy A 介导的信号转导的研究报道极少。
Stowe-Evans等(2001)根据在有限的光条件下 , nph4
即 ARF7的突变体缺乏基本的依赖向光素和 PhyA的
向光性增强反应的现象 , 提出了 PhyA通过调控包括
ARF7在内的转录复合物活性而实现对向光性增强反
应调控的假说, 但至今仍然没有找到支持该假说的充
分证据。ARF8与 ARF7具有很高的同源性(Hagen
and Guilfoyle, 2002), PhyA是否影响 ARF8的表达尚
属未知。本文利用 GUS染色以及半定量和定量 RT-
PCR等分析方法, 系统研究拟南芥 PhyA基因的突变
对 ARF8基因表达的影响 , 以确定PhyA与ARF8在远
红光信号通路中的上下游关系 , 阐明ARF8参与植物
对远红光反应的作用机理。
1 材料与方法
1.1 植物材料与培养条件
拟南芥 (A rab i d ops i s t ha l i ana L . )野生型 Co l
(Columbia)、Ws(Wass ilewskija)和 Ler (Landsberg
erecta)由本实验室保存; 突变体phyA-209(Reed et al.,
1994)和phyB-5 (Neff and Chory, 1998)由日本北海道
大学Yamamoto教授提供; cry1-104(Mao et al., 2005)
由上海交通大学杨洪全教授提供 ; cry2-1(Lin et al. ,
1998)由美国加利福尼亚大学洛杉矶分校的林晨涛教
授提供; PARF8:GUS由 Tian等(2004)构建并在本实验
室保存。
双突变体 phyA PARF8:GUS 是将 PARF8:GUS 与
phyA-209杂交, 从F2代中筛选获得的 , 具体过程见本
文 2.2节。
培养条件 : 将表面消毒的拟南芥种子接种到 1 /
2MS培养基上, 4°C放置 72小时, 转至(23±1)°C、白光
(16 J.s-1.m-2)培养 1天, 继续留在白光下培养或再分
别转入不同光条件下于(23±1)°C培养至所要求的天
数。其中, 远红光(740±25) nm、红光(650±20) nm光
强分别为 25和13.2 mmol.m-2.s-1; 蓝光(450±20) nm光
强有 2种: 22 mmol.m-2.s-1用于 cry1-104及野生型的
处理, 5.5 mmol.m-2.s-1用于 cry2-1及野生型的处理。
1.2 GUS染色
取各种光条件下培养 3天的幼苗, 按照 Tian等(2004)
的方法进行 GUS染色和观察。
1.3 总RNA的提取及DNase I消化处理
取不同材料采用 Trizol法提取总 RNA。由于 RT-PCR
分析要求使用没有 DNA污染的高纯度的 RNA, 所以
有必要对所提取的总 RNA进行 DNase I消化。消化
反应在 37°C下进行30分钟, 继而用常规方法去除酶
等杂质, 最后进行电泳和 RT-PCR检测, 以确认 DNA
是否除尽。
1.4 半定量RT-PCR
用 PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit (宝生物工程
有限公司)进行半定量 RT-PCR。反应结束后, 进行常
规琼脂糖(琼脂糖浓度为 1%)凝胶电泳, 并用凝胶成
像系统(AlphamagerTM)观察并照相。使用的基因专一
引物如下: Ac tin2-F, 5-TGACTACGAGCAGGAGAT-
GGAA-3; Actin2-R, 5-CAAACGAGGGCTGGAACAA-
3; ARF8-F, 5-ATTGAGCCTCTGACTACCTTTCCT-3;
ARF8-R, 5-TTCCCAAATCACCCCTTCC-3; PHYA-F,
5-TGCTGGTGCCTTACAATC-3; PHYA-R, 5-CTGCG-
TCCCAAATACTTC-3。
1.5 定量RT-PCR分析
使用宝生物工程有限公司的 O ne S t ep S Y B R ®
436 植物学报 44(4) 2009
PrimeScriptTM RT-PCR kit (Perfect Real Time), 相关
耗材使用 Applied Biosystems(ABI)公司的产品。所
用基因专一引物同半定量RT-PCR, 模板浓度为1 ng.
mL-1, 每个样品设 4次重复。选用表达相对稳定的
Actin2作为内参基因 , 以野生型 Col的相对表达量作
为参照因子(即 1倍)。采用 DDCt 法进行基因表达的
相对定量分析 , 即利用2-DDCt公式计算目标基因与内
参基因的相差倍数(样品的 DCt=ARF8Ct-Act in2Ct,
DDCt=突变体 DCt-对照 DCt)。
2 结果与讨论
2.1 主要光受体基因突变对ARF8基因表达的影响
在白光、蓝光、红光和远红光的诱导下 , ARF8基因
在下胚轴中均强烈表达; 其功能缺失突变体 arf8-1在
上述光条件下均呈长下胚轴表型; 超量表达突变体在
白光下呈短下胚轴表型(Tian et al., 2004)。ARF8涉及
光信号转导, 据此推测 ARF8在光信号通路中处于光
受体的下游。因此, 首先利用 RT-PCR技术, 分析不同
光受体突变体中 ARF8基因的表达情况, 以判断ARF8
在转录水平是否受到某一个或几个光受体的调控。
从图1中可以看出, 在主要蓝光受体基因Cry1和
Cry2的突变体 cry1-104和 cry2-1以及主要红光受体
基因 PhyB的突变体 phyB-5中, ARF8的表达量与相
应的野生型相差不大 ; 而在远红光受体基因 PhyA的
突变体phyA-209中, ARF8的表达量明显低于相应的
野生型。说明 PhyA的突变促进了 ARF8的表达。
2.2 phyA-209 PARF 8:GUS的筛选与鉴定
为了探讨 phyA 突变对 ARF8表达的影响, 我们通过
杂交将 PARF8: GUS导入 phyA-209, 经筛选成功获得
了 phyA-209 PARF8:GUS。筛选过程如下 : 将由 phyA-
209与 PARF8:GUS杂交所获得的 F2 代在远红光条件
下培养, 其中 9棵幼苗呈现长下胚轴表型 , 分别剪取
这些幼苗的根尖进行 GUS染色观察。将根尖染色的
幼苗移栽, 成熟后单株收集 F3代种子。phyA-209为
隐性突变体(Reed et al. ,1994), 因此, 这 9棵植株应
该是 phyA的纯合体; PARF8:GUS是显性的, 只有单株
F3代的所有幼苗的根尖 GUS染色全部呈阳性 , 才能
确定该植株是 GUS纯合体。9个株系中 2个株系所
有幼苗的根尖 GUS 染色全部呈蓝色, 即 phyA-209
PARF8:GUS纯合双突变体。
2.3 白光条件下不同株系幼苗的GUS染色
在白光中生长 3天, PARF8:GUS幼苗的子叶未染色, 茎
顶端生长点、下胚轴和根尖染色深(图2A, B); 而phyA-
209 PARF8:GUS幼苗的子叶染色深, 茎顶端生长点和下
胚轴未染色, 且根尖染色极浅(图 2C, D)。培养 10天,
PARF8:GUS 幼苗的真叶未染色(图 2E); 而 phyA-209
PARF8:GUS幼苗的真叶与子叶相似, 染色深(图 2F)。
2.4 远红光条件下不同株系幼苗的GUS染色
在远红光中生长3天, PARF8:GUS幼苗的子叶未染色 ,
茎顶端生长点、下胚轴和根尖染色深(图 3A, B); 而
phyA-209 PARF8:GUS幼苗的子叶染色深 , 茎顶端生长
点和下胚轴未染色 , 且根尖染色较浅(图 3C, D)。
2.5 黑暗条件下不同株系幼苗的GUS染色
在黑暗中生长 3天, PARF8:GUS幼苗的子叶和下胚轴
图 1 不同光受体突变体下胚轴中 ARF8表达的半定量 RT-
PCR分析
蓝光 1: 450±20 nm, 22 mmol.m-2.s-1 ; 蓝光 2: 450±20 nm, 5.5
mmol.m-2.s-1; 红光 : 650±20 nm, 13.2 mmol.m-2.s-1; 远红光:
740±25 nm, 25 mmol.m-2.s-1
WT: 野生型
Figur e 1 The semiquantitative analysis of the expression of
ARF8 in diff erent photoreceptor mutants by RT-PCR
Blue light 1: 450±20 nm, 22 mmol.m-2.s-1; Blue light 2: 450±20
nm, 5.5 mmol.m-2.s-1; Red light: 650±20 nm, 13.2 mmol.m-2.s-1 ;
Far-red light: 740±25 nm, 25 mmol.m-2.s-1
WT: Wild type
437王海等: 破坏光敏色素A改变生长素反应因子 8的表达谱
未染色, 茎顶端生长点和根尖染色深 (图 4A-C); 而
phyA-209 PARF8:GUS幼苗的子叶染色深 , 但茎顶端生
长点、下胚轴未染色 , 且根尖染色较浅(图 4D-F)。
总之, 无论是在白光、远红光还是黑暗条件下 ,
与 PARF8:GUS 相比, phyA-209 PARF8:GUS 的子叶着
色较深, 顶端生长点、下胚轴和根尖着色较浅。这些
结果说明, PhyA在地上部分(子叶中)抑制 ARF8基因
的表达, 而在地下部分 (下胚轴和根尖中)促进 ARF8
基因的表达。并且, 这种表达模式的改变是组成型
的, 与外界光照条件无关。
2.6 GUS染色结果的分子验证
幼苗 GUS染色分析表明 , PhyA突变改变 ARF8的表
达, 并具有器官特异性 , 且不受光照条件的影响。因
此, 取一种光条件下培养的材料, 即可用于 PhyA 突
变改变ARF8表达的进一步分析。白光下生长的幼苗
子叶较大, 便于取材。于是, 分别以白光条件下生长
的幼苗整体、子叶和剩余部分(即下胚轴和根)为材料
提取 RNA进行半定量和定量 RT-PCR分析。半定量
RT-PCR检测结果显示, 在幼苗整株水平, phyA-209
中 ARF8的表达增强; 在相同器官水平, 突变体子叶
图 2 白光条件下(16 J.s-1.m-2)PARF8:GUS(A,B,E)和 phyA-209
PARF8:GUS(C,D,F)幼苗的 GUS染色
(A)-(D) 3天苗龄 ; (E),(F) 10天苗龄 ; (A),(C),(E) ,(F) 幼苗 ; (B),
(D) 根尖
Figure 2 The GUS s taining in 3 d- and 10 d-old seedlings of
PARF8:GUS (A,B,E) and phyA-209 PARF8:GUS (C,D,F) grow n
under w hite light (16 J.s-1.m-2).
(A)-(D) 3 d-old seedling; (E),(F) 10 d-old seedling; (A),(C),(E),
(F) Seedling; (B),(D) Root t ip
图 3 远红光条件下 (740±25 nm, 25 mmol.m-2.s-1 )PARF8:GUS
(A,B)和 phyA-209 PARF8:GUS(C,D)幼苗的 GUS染色
(A),(C) 幼苗(3天苗龄); (B),(D) 根尖
Figur e 3 The GUS s taining in 3 d-old seedlings of PARF8:GUS
(A, B) and phyA-209 PARF8:GUS (C, D) seedling grow n in far-
red light (740±25 nm, 25 mmol.m-2.s-1)
(A),(C) 3 d-old seedling; (B),(D) Root t ip
图 4 黑暗条件下 PARF8 :GUS(A-C)和 phyA-209 PARF8 :GUS
(D-F)幼苗的 GUS染色
(A),(D) 幼苗(3天苗龄); (B) ,(E) 子叶 ; (C),(F) 根尖
Figur e 4 The GUS staining in 3 d-old seedlings of PARF8:GUS
(A-C) and phyA-209 PARF8:GUS (D-F) seedlings grow n in dark
(A),(D) 3 d-old seedling; (B),(E) Coty ledon; (C),(F) Root t ip
438 植物学报 44(4) 2009
2.8 分析与讨论
本研究采用 GUS染色、半定量及定量 RT-PCR技术
研究了 PhyA与 ARF8在远红光信号通路中上下游的
关系, 发现了一个非常重要的现象: PhyA突变在子叶
中提高 ARF8的表达水平, 而在下胚轴、茎尖和根尖
中降低 ARF8的表达水平, 说明在转录水平 PhyA对
ARF8的表达调控呈现出明显的器官特异性(图 2-图
5)。然而 ARF8突变并不影响 PhyA的表达(图 6), 说
明在转录水平 ARF8对 PhyA的表达没有明显的调控
作用。上述结果说明 , PhyA在所涉及的信号通路中
位于ARF8的上游, 在转录水平调控ARF8的表达, 且
在不同器官中调控ARF8表达的机理不同。这提示光
信号经 PhyA传递给 ARF8的通路在不同器官中存在
差异。值得一提的是 , 在植物组织中 PhyA 以 PhyA
和 PhyA两种形式存在 , 且不同形式的 PhyA可能因
驱动不同通路的信号转导而具有不同的功能
(Sineshchekov, 2004)。本研究所描述的现象可能是
由于这两种不同形式的 PhyA 在不同器官中的分布
不同, 亦或还有其它原因导致 , 值得进一步研究。
作为转录因子 , ARF 8能促进 GH3s 家族成员
AtDFL1和 AtGH3a基因的表达(Tian et al. , 2004)。这
2个基因的编码产物又能催化游离态 IAA与氨基酸的
结合, 从而调节植物体内游离 IAA的含量(Staswick
et al., 2002, 2005)。因此, ARF8可能参与了植物体
内过量游离 IAA的失活反应(Tian et al. , 2004; Wang
图 5 phyA-209幼苗中 ARF8表达的半定量 (A)和定量(B)RT-
PCR分析
1: 幼苗 ; 2: 子叶 ; 3: 下胚轴和根
Figur e 5 The semiquantitative (A) and quantitative (B) analy-
sis of the expression of ARF8 in phyA-209 seedlings by RT-
PCR
1: Seedling; 2: Coty ledon; 3: Hypocotyl and root
图 6 ar f8-1幼苗(3天苗龄)中 PhyA表达的半定量 RT-PCR分
析
1: Col; 2: Ws; 3: ar f8-1
Figur e 6 The semiquantitative analysis of the expression of
PhyA in 3 d-old ar f8-1 seedlings by RT-PCR
1: Col; 2: Ws; 3: ar f8-1
中 ARF8的表达增强, 下胚轴和根 ARF8的表达减弱
(图 5A)。定量 RT-PCR分析结果表明 , phyA-209整株
幼苗和子叶 ARF8的表达增强, 分别为对照(Col)的
1.7和 2.8倍; phyA-209根与下胚轴 ARF8的表达减
弱, 是对照(Col)的 0.4倍(图 5B)。这些结果与GUS染
色分析结果一致。
2.7 arf8-1中PhyA的表达分析
GUS 染色、半定量和定量 RT-P CR分析结果表明 ,
PhyA在涉及的信号通路中位于 ARF8的上游。为了
得到进一步的证据, 我们分析了 arf8-1突变体(遗传
背景为 Ws)中 PhyA表达的情况。以白光下培养 3天
的幼苗中提取的 RNA为模板, 进行 RT-PCR分析。结
果显示, arf8-1中PhyA的表达量与野生型相似(图6),
说明 ARF8的突变不影响 PhyA的表达。上述结果表
明, 在所涉及的信号通路中 PhyA位于ARF8的上游。
439王海等: 破坏光敏色素A改变生长素反应因子 8的表达谱
et al. , 2008)。FIN219基因的表达受生长素的诱导 ,
其编码蛋白能够抑制COP1的表达, 且位于远红光信
号通路 PhyA的下游, 它是迄今发现的唯一特异性地
介导远红光信号转导的 GH3家族成员(Hs ieh et al. ,
2000; Chen et al. , 2007)。可见, 有必要确定 FIN219
与 ARF8是各自独立的位于 PhyA的下游, 还是处于
同一信号通路中。相关研究的开展 , 将有助于全面认
识 ARF8和 PhyA的功能, 并最终揭示远红光与生长
素信号交叉整合的本质。
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441王海等: 破坏光敏色素A改变生长素反应因子 8的表达谱
Disruption of Phytochrome A Changes Expression Pattern of Auxin
Response Factor 8
Hai Wang1, 2, Yuping Zhou1, Xiaolan Wang1, Fang Lin3, Jun Duan2, Changen Tian1, 3 *
1 Guan gzho u Key Lab oratory fo r Funct ion al Stu dy o n S tre ss-Resi sta nt Gene s i n P lan ts, Gua ngzhou Uni versit y, Guan gzh ou
51 000 6, Chi na; 2So uth Chi na Botani cal Garden , Chin ese Aca demy o f Scien ces, Guang zho u 5 106 50, Chi na; 3Schoo l of Li fe
Scien ces, Gu ang zho u Universi ty, Gu ang zho u 5 1000 6, Chi na
Abstract The expression of A rabidops is aux in response f ac tor 8 (ARF8) can be promoted by light and is involved in light
signaling. How ever, little is know n about the pathw ay and mechanism under lying s ignal transduction from photoreceptors to ARF8.
Semi-quantitative RT-PCR analys is revealed that mutation of PhyA elevated the expression of ARF8, but that of PhyB, Cry1 or Cry2
did not change the express ion of ARF8 markedly. GUS staining, semi-quantitative RT-PCR and real- time RT-PCR w ere used to
analyze how PhyA systemically aff ected the express ion of ARF8. GUS staining in related GUS lines sugges ted that mutation of
PhyA affects the mRNA expression of ARF8 in an organ-spec if ic manner. In coty ledons , PARF8:GUS show ed w eak s taining but
phyA-209 PARF8:GUS show ed strong staining. In the shoot apical mer istem, hypocotyl and root t ip, phyA-209 PARF8:GUS show ed
w eaker s taining than did PARF8:GUS. The same expression patterns of ARF8 resulting from dis ruption of PhyA w ere observed in
dark, w hite light and f ar- red light conditions. This expression pattern w as further conf irmed by semi-quantitative and real-time RT-
PCR analysis . How ever, the expression of PhyA in arf8-1 w as almost the same as in the w ild type, w hich sugges ts that disruption
of ARF8 does not change the express ion of PhyA. Our results suggest that A RF8 ac ts dow ns tream of PhyA in far- red light
signaling.
Ke y w ords au xin respon se factor 8, far-re d li ght si gna ling , g ene expre ssio n, gen e m utat ion , p hytochrome A
Wang H, Zhou YP, Wa ng XL, Lin F, Duan J , Tian CE (2 009). Di srup tio n of phytoch rome A ch ange s exp ression patte rn o f auxin respo nse
factor 8. Ch in Bull Bo t 44 , 43 4-44 1.
* Author for correspondence. E-mail: changentian@yahoo.com.cn
(责任编辑: 白羽红)