全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 29(5)：669— 672 2009年 9月
拟南芥光敏色素A反义 RNA载体的构建及转化
王 海1～2 3，王小兰2，周玉萍2，段 俊 ，田长恩2
(1．中国科学院 华南植物园，广州 510650；2．广州大学 植物抗逆基因功能研究广州市重点实验室，
广州 510006；3．中国科学院 研究生院 ，北京 100049)
摘 要 ：光敏色素 A是植物远红光信号的关键受体，在植物光信号转导途径中起重要作用。一些具有重要功
能的基因(如生长素反应因子 8：auxin response ctor 8，ARF8)受到 PhyA调控。本实验拟通过构建 PhyA
基因反义株系，研究 PhyA调控 ARF8等重要功能基因表达的机理 。以培养 7 d的拟南芥幼苗为材料提取
RNA，利用 RT—PCR技术扩增 出PhyA的全长 CDS，将其反向插入表达载体 pMD1得到反义表达载体pMD1一
PhyA CDSR，并通过农杆菌介导转化拟南芥，经卡那霉素抗性平板筛选和 PCR鉴定得到 l3个 P^ 转基因株
系。pMD1一PhyA CDSR及其转基因株系的获得为研究 PhyA调控 ARF8等基因表达的机理奠定了材料基础。
关键词 ：光敏色素 A；反义表达载体；拟南芥 ；生长素反应因子 8
中图分类号：Q789 文献标识码：A 文章编号：1000-3l42(2009)05-0669—04
Construction and transformation of antisense RNA
expression vector of Arabidopsis phytochrome A
Ⅵ NG Hail，2，u，Ⅵ NG Xiao-Lan2，ZHOU Yu-Pingz，
DUAN JunI．TIAN Chang-En2
(1．South China Botanical Garden，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510650．China；2．Guangzhou Key
Laboratory for Functional Study On Plant Stress—Resistant Genes，Guangzhou University．Guangzhou 5 10006，
China；3．Graduate University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China)
Abstract：Phytochrome A(PhyA)is the specific photoreceptor which receives far—red light in plants．Many critical
genes，including auxin response
．factor 8(ARF8)，are regulated by PhyA．Therefore，it is necessary to construct the
P ^A—antisence transgenic lines for revealing the mechanism underlying phyA—regulated genes expression
． The
Ph A CDS was amplified from Arabidopsis total RNA by RT-PCR method．Then，it was inserted reversely into
pMD1 to get the antisence expression vector pMD1—。PhyA CDSIL The transgenic lines were acquired by agrobacteri—
um—mediated method．13 transgenic lines have been acquired by Kmr screening and PCR analysis．The vector pMD1一
yA CDSR and the transgenic lines wil be useful to study how the genes，such as ARF8，are regulated by PhyA
．
Key words：phytochrome A；antisense expression vector；Arabidopsis；auxin response factor 8
光是一个调控植物生长发育的重要外界因子，参
与大量植物基因的表达调控 (Lorain等，2006)。高
等植物具完善 的光信号感受系统，包括：光敏色素
(phytochrome)、隐 花 色 素 (cryptochrorne)、向 光 素
(phototropin)和 uV_B受体 等(Schafer& Wagy，
2006)。通过对光受体突变体的研究已证实光敏色素
参与了种子萌发、幼苗光形态建成、避荫反应、成花诱
导和生物钟等过程的调控(Quail，2002；Yanovsky&
Kay，2003；Franklin& Whitelam，2004)。
光敏色素A(phytochrome A，PhyA)是拟南芥接受
收稿日期：2008—01—28 ．I回日期 ：2009—0卜O7
基金项目：教育部留学归国人员科研启动基金([2。O 11527)[Supported by the Scientific Research Foun&tion for the Retumed Overseas Chinese
Scholars，China(2004—527)3
作者简介：王海(1981一)，男，山F,~gA，硕士研究生．从事植物光信号转导研究．(E-mail)wanghai
一 9773@qq．COm。
通讯作者(Author for correspondence，E—mail：changentian@yahoo．corn．cn)
67O 广 西 植 物 29卷
远红光的主要受体(Wang 8L Deng，2003)。拟南芥
妒 基因的全长 CDS为 3 369 bp，编码 l 122个氨基
酸(NM_100828，Dehesh等，1993)。关于 Ph A介导的
光信号转导网络的研究取得较多突破性进展(王伟等，
1999)，发现 了 PhyA 信号通 路 中的部 分组分，包括
FHYl，FHY3，FHY4，FIN2，SPAl，FIN219，PATl，EIDl
等；也发现部分与 Ph A直接作用的转录因子，如 HFR
等(Wang& Deng，2003)。利用 phyA无义突变体进行
基因芯片的研究表明远红光影响了大量基因的表达
(Tepperman等，2001)。生 长素 反应 因子 (auxin re—
sponse factors，ARFs)是一类转录因子 ，拟南芥共有 23
个 ARF基因，在生长素调控基因表达网络中起关键作
用(Woodward Bartel，2005)。本研究发现拟南芥生
长素反应因子 8(auxin response facto,-8，ARFS)的表达
受远红光影响(Tian等，2004)，推测其可能是 PhyA信
号转导与生长素信号转导网络交叉整合的一个关键组
分，证据尚不充分。研究一系列不同程度 PhyA反义
株系中ARF8的表达情况，无疑可为揭示 PhyA调控
ARF8的表达提供进一步的证据。石东乔等(2001)证
实转同一反义表达载体的不同植株的相关基因表达
水平往往不同。本实验拟通过构建 P^ 基因的反
义表达载 体，转 化野 生 型 拟南 芥 植株 ，以期 得到
P^ 妒 表达水平不同的转基因株系，为揭示 PhyA调
控 ARF8等基因的表达机理提供材料基础。
1 材料与方法
1．1材 料
植物材料：哥伦比亚生态型拟南芥(Arabidopsis
thaliana)种植于温室(23℃)，持续光照培养。菌株
和质粒：根癌农杆菌GV3101由北京农业大学叶德教
授惠赠，大肠杆菌 DH5a，质粒 pMDI由本实验室保
存；质粒 pMDT18simple购于宝生物工程(大连)有限
公司。酶与试剂 ：One Step RT-PCR Kit，各种限制性
内切酶及工具酶均购于宝生物工程(大连)有限公司；
UNIQ-lO柱式 Trizol总 RNA抽提试剂盒，质粒提取
试剂盒，胶回收试剂盒，PCR产物纯化试剂盒及常规
试剂均购于上海生工生物技术服务有限公司。
1．2反义表达载体的构建
根 据 http：／／wⅥnv．Arabidopsis．org／公 布 的
PhyA序列和 pMD1的多克隆位点设计分别加有SalI
和 BamHI酶切位点的特异引物，利用 RT-PCR扩增
出全长 P^ CDS，然后连接到 pMDT18simple上，外
送广州拓谱基因技术有限公司测序。利用限制性内
切酶 SalI和 BamHI双酶切扩增产物 P^ CDS和
质粒 pMD1，分别纯化 ，然后用 T4 DNA连接酶将扩
增产物与线性化质粒连接得到反义表达载体 pMD1一
PhyA CDSR(图 1)，最 后 采用 冻 融法 (张学文 等，
2001)将反义表达载体转人农杆菌 GV3101中。
图 1 PhyA反义表达载体的构建示意图
Fig．1 Construction of the antisence expression
vector of Ph，A gene
1．3转基因植株的筛选与鉴定
采用刘乐承等(2005)的方法转化拟南芥。收获的
TO代种子经表面消毒接种到加有 Km50 mg／L+
Cef200 mg／L(Krn，Cef分别表示卡那霉素和头孢霉素)
的1／2MS培养基筛选阳性转化株系。提取转化株总
DNA进行分子鉴定。方法：植物材料液氮速冻后充分
研磨，加 500~tLDNA提取缓冲液(0．2 tool／LIris—HC1
pH9．0，0．4 mol／L LiC1，25 mmol／L EDTA，l SDS)混
匀，再加入 500 L的酚／氯仿／异戊醇(25：24：1)，涡
漩 10 S，12 000 r／min室温离心 10 min，取上相，加入等
体积(约 500 L)异丙醇，颠倒混匀，12 000 r／min离心
10 min，沉淀即为 DNA，最后加入约 2O L的 l／2TE溶
解 DNA。鉴定引物选用 35S F和 PHYA F1。
1．4引物及其说明
P^ A CDS扩增 引物为：PHYA F 5，_AT—
AGTCGACATGTCAGGCTCTAGGCCGACT—
CAG一3 (下划线为 SalI)；PHYA R 5-CGCG—
GATCCACTACTTGTTTGCTGCAGCGAGTT一3
(下划线为 BarnHI)。内部鉴定引物为：PHYA F1
5 一TGCTGGTGCCTTACAATC一3 ；PHYA Rl
5期 王海等：拟南芥光敏色素 A反义 RNA载体的构建及转化 671
5-CTGCGTCCCAAATACTTC一3 ；phya—t F
5 一GCACAGCTGCCATTTGCAGTACAT一3 ；
phya—t R 5 一CATGCAAACTATCAGTGCT—
CAAAC一3 ：35S F 5 一AACCCACTATCCTTCG—
CAAGACC一3 。
2 结果与分析
2．1 PhyA CDS的获得
以利用 UNIQ一10柱式 Trizol总 RNA抽提试
剂盒提取的拟南芥(7 d苗)总 RNA作模板，用引物
PHYA F和 PHYA R进行 RT—PCR扩增，将扩增
片段通过 TA克隆插入 pMDT18simple，进行测序
验证 ，证实所得片段为预期的 P^ A全长 CDS。
2．2反义表达载体 pMD1-PhyA CDSR的构建
对经测 序证 实的 PhyA CDS和 pMD1进行
SalI和 Bt1171HI双酶切，分离纯化所需的酶切产物 ，
用 T4连接酶连接得到 pMD1 Ph A CDSR(图 1)，
转化大肠杆菌DH5u。从阳性大肠杆菌提取表达载
体，采用 Sal和BamHI对构建好的植物双元反义
表达载体 pMD1一PhyA CDSR进行双酶切鉴定 ，结
果显示载体被切割成约 11 kb和 3．3 kb两条带，前
者符合 pMD1线性化 质粒 大小，后 者 符合 PhyA
CDS大小(图 2)；同时用三对 内部鉴定引物(35S F
+ PHYA F1；phya—t F+ phya—t R：PHYA F1+
PHYA R1)均可以扩增出与理论值大小相符的条带
(2 100 bp；515 bp；l 836 bp，图 3)。上述结果均表
明反义表达载体pMD1一PhyA CDSR构建成功。
1 2 —t ～ M
■■ -2000bp
一
-
7
1
5
0
0b
00
。
bp
i -500bP
■ -250bp
- I OObo
图 2 反义表达载体的双酶切鉴定
Fig．2 Identification of the constructed antisense expression
vector through double restricted enzyme digestion
M：marker DL 2000(下同)；1：pMD1一PhyA CDSR digested
with BarnHI+SalI；2：pMD1 digested with BarnHI+ SaID
2．3拟南芥转化及转基因植株的筛选与鉴定
通过冻融法将构建好的表达载体转化农杆菌
GV3101，对抗生素抗性筛选平板上长出的菌落用引
2 3 M
- 一一2O0b
囊曩一-71 500b
每 、女鬻 - 500bP
- 250bP
一 ’OObp
图 3 PhyA反义表达载体的 PCR鉴定
Fig．3 PCR analysis for the constructed
antisense expression vector
1；PHYAF1+PHYAR1；2；phya_tF+phya—tR；3：35S F+P}fYA F1
物 35SF+PHYA F1进行PCR，扩增出与理论值大
小(2 100 bp)相符的条带(图 4)，证明反义表达载体
已成功转入农杆菌 GV3101。选取其中的 5号菌落
摇菌，通过花蕾浸泡法转化拟南芥。
将转化后获得的种子播种于含卡那霉素和头孢
霉素的培养基上进行抗生素筛选，共获得 13个转基
因株系(图 6)，移栽培养，四周后，剪取其中长势良
好的8个 TO代株系部分莲座叶(约 lOOmg)提取基
因组DNA，用引物 35S F+PHYA F1进行 PCR扩
增，均扩增出了大小与理论值(2100 bp)相符的条带
(图 5)，说明目的基因已成功转入拟南芥。
图 4 PhyA反义表达载体转化农杆菌
GV3101的菌落PCR鉴定
Fig．4 PCR analysis of Agroba~trium turnefadens GV3101 tran-
sformed with antisense expression vector(1 9：doneS with Kmr)
3 讨论
2O世纪 8O年代初，人们在研究反义核酸对原核
和真核基因表达调控的基础上，发明了反义技术(an—
tisense technology)。反义技术是根据核酸杂交原理，
通过在基因水平上设计表达特异反义 tLNA片段，选
择性抑制特定基因复制、转录或翻译，从而抑制特定
基因表达的一类基因沉默或表达下调技术(许本波
672 广 西 植 物 29卷
图 5 TO代转基因株系的 PCR鉴定
Fig．5 PCR analysis in TO transgenic plants
col：Arabidopsisthaliana Columbia；1—8：Line1一Line 8
图 6 转基 因植株 的抗生 素筛选
Fig．6 Screening for the transgenic plant with antibiotic resistance
等，2003；陈国庆等，2005)。反义技术包括反义寡核
苷酸、反义 RNA及核酶三大技术领域(柴晓杰等，
2004)。在构建高效反义 RNA基因时，可以选用全长
eDNA也可 以选用其 中的一个 片段(张学文等，
2001)。本实验在扩增得到 P^ 全长CDS并经测序
与报道的序列一致的基础上，将 P 的全长 CDS
反向插入表达载体 pMD1，成功构建反义表达载体
pMD1一P^ CDSR。理论上讲，所得的该反义表达载
体可以用来沉默或下调 PhyA基因的表达。目前，转
基因植物中 PblA的表达分析正在进行 中。
利用花蕾浸泡法将外源基因转入拟南芥是一种
简便易行且高效的转化方法。本实验采用该方法进
行转化，收获的 TO代种子经卡那霉素筛选阳性率
达 0．8‰，共得到 13个转基因株系，对其中 8株进
行了PCR鉴定，结果表明卡那霉素筛选假阳性比例
为0。因此，卡那霉素抗性是拟南芥转基因植株筛
选的一个很好选择。目前，在 8个 PCR鉴定的株系
中已有 3个株系得到 T1代种子。可以预期，在进
一 步筛选获得转基因纯合子的基础上，通过基因表
达分析，筛选出不同表达水平的 PhyA转基因株
系，将为研究 P ^A调控包括 ARF8在内的基因表
达的机理奠定 良好的材料基础 。
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