全 文 ：植物学通报 2005, 22 (2): 190~197
Chinese Bulletin of Botany
①国家自然科学基金项目“油松雌配子体败育的分子生物学机制”( 3 9 9 7 0 6 0 2 )。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: zhengcx@bjfu.edu.cn
收稿日期：2003-07-23 接受日期：2004-02-27 责任编辑：孙冬花
技术与方法
油松雌性不育系球果蛋白质双向电泳
技术的建立①
丁坤善 郑彩霞② 包仁艳 姜春宁
(北京林业大学生物科学与技术学院 北京 100083)
摘要 本文建立了油松雌性不育系雌球果蛋白质组研究中的双向电泳技术。第一向采用固定pH值梯度
（IPG）胶条在IPGphorTM等电聚焦仪上进行等电聚焦，第二向在恒功率且恒温条件下于Ettan-DALTTMⅡ
高通量电泳仪上进行SDS-PAGE电泳，以银染和考马斯亮蓝两种方法染色。通过对全蛋白的提取、胶条
pH值和胶条肿胀等技术环节的优化和比较，得到了重复性很高，分离效果良好的蛋白质双向图谱。
关键词 蛋白质组，油松，雌性不育系，双向电泳
Improvement of Two-dimensional Gel Electrophoresis of
Proteins from Female Cones of the Female-sterile Pinus
tabulaeformis Carr.
DING Kun-Shan ZHENG Cai-Xia② BAO Ren-Yan JIANG Chun-Ning
(College of Biological Sciences and Technology, Beijing Forestry University, Beijing 100083)
Abstract This paper reported a improvement in 2-D gel electrophoresis of the proteome in
female cones of the female-sterile Pinus tabulaeformis Carr. An IPGphorTM unit with immobile pH
gradient strips was used in and the EttanTM DALT Ⅱ system under constant power and tempera-
ture in SDS-PAGE. The 2-D gel was stained by both methods of coomassie blue and silver.
Extraction of proteins, pH of the strips, rehydration of the strips and other parameters were
optimized and compared. Higher repeatability and better separating protein pattern could be
gained by this technique.
Key words Proteome, Pinus tabulaeformis Carr., Female sterile clone, Two-dimensional gel
electrophoresis
蛋白质组(proteome)是由Wilkins和Will-
iams于1994年提出的(Wasinger et al.,1995)。
随着后基因组时代的到来，蛋白质组学
(proteomics)已经成为生命科学研究的重心。
双向电泳是目前蛋白质组研究中的关键技
术。双向电泳技术主要包括样品中蛋白质的
提取、第一向等电聚焦(isoelectric focusing,
IEF)、第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-
1912005 丁坤善等: 油松雌性不育系球果蛋白质双向电泳技术的建立
PAGE)和凝胶染色等步骤。
自O’Farrell (1975)建立起双向电泳技术以
来，第一向已从载体两性电解质 p H 梯度
(carrier ampholytes pH gradients)等电聚焦发
展到固定 pH梯度(immobilized pH gradients,
IPG)等电聚焦; 第二向也发展到了能在恒功率
和恒温度条件下进行 SDS-PAGE，并且双向
电泳技术的分辨率和重复性已经有了很大的
提高(郭尧君，1999)，同时出现了高通量大
规模的蛋白质电泳系统。在蛋白质组的研究
中，主要是应用固定 pH值梯度等电聚焦和
高通量的 SDS-PAGE电泳系统。
在油松(Pinus tabulaeformis Carr.)雌性不
育系的蛋白质组研究中，通过双向电泳分析
油松雌性不育系和正常可育系蛋白质组间的
异同，寻找影响雌性育性的特异表达蛋白
质，从而可以有效地分离相关的基因。但油
松由于含有大量的严重影响等电聚焦、SDS-
PAGE和凝胶染色的物质，如酚类、脂类和
其他一些次生代谢物，油松蛋白质的双向电
泳有一定的难度，国内外未见相关的报道。
本文以二年生油松雌球果为材料，利用固定
pH胶条和高通量的电泳系统，初步建立起了
油松蛋白质组分离的双向电泳技术。
1 材料
1.1 设备
HITACHI SCR 20BC低温高速离心机(日
本，HITACHI), UV2100 紫外分光光度计(日
本，Shimadzu)，Amersham Bioscience公司
的IPGphorTM 等电聚焦系统、EttanTM DALT Ⅱ
垂直板电泳系统和灌胶模具。
1.2 试剂
pH 4~7线性固定 pH值(IPG)胶条(长 24
cm), pH3~10线性IPG胶条(长24 cm), 3-[(3-
胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸(CHAPS)，二
硫苏糖醇 ( D T T ) , 尿素，碘代乙酰胺
(idoacetam-ide), 矿物油，均购于Amersham
Biosciences公司。
1.3 溶液配方
样品提取试剂：1) 100 mL丙酮中加入10
g TCA(三氯乙酸，10%)和0.07 mL b-巯基乙
醇(0.07%); 2) 100 mL丙酮中加入0.07 mL b-
巯基乙醇(0.07%),-20 ℃保存。
裂解液：8 mol·L-1尿素, 4%(W/V)
CHAPS, 40 mmol·L-1 Tris-base, 双蒸水定容
至所需量，-20 ℃保存。
肿胀液：9 mol·L-1尿素，2%(W/V)
CHAPS, 2%(V/V) IPG buffer, 溴酚蓝适量，双蒸
水定容。使用前每2.5 mL肿胀液加入7 mg DTT。
平衡液：50 mmol·L-1 pH8.8 的 Tris-
HCl, 6 mol·L-1 尿素, 30%甘油(V/V), 2% SDS
(W/V),适量溴酚蓝，双蒸水定容,-20 ℃保
存。平衡液 A：使用前每 10 mL平衡液中加
100 mg DTT； 平衡液B：使用前每10 mL平
衡液中加入 250 mg碘代乙酰胺。
SDS凝胶缓冲液：1.5 mol·L-1 pH8.8的
Tris-HCl, 4 ℃保存。
SDS-PAGE 电极缓冲液(pH8.3)：2 5
mmol·L-1 Tris, 192 mmol·L-1甘氨酸，
0.1% (W/V) SDS。
替换液：50 mL甘油，25 mL凝胶缓冲
液，25 mL水，配制 100 mL。
考马斯亮蓝染色液 : 25% 考马斯亮蓝
R-250，45%乙醇，45%双蒸水，10%冰醋酸。
脱色液：7.5%冰乙酸，2.5%乙醇，90%
双蒸水。
琼脂糖封胶液：100 mL SDS-PAGE电极
缓冲液(pH 8.3)，低熔点琼脂糖 0.5%，溴酚
蓝 0.002%；加热溶解，以 2 mL为单位分装，
室温保存。
银染试剂参见郭尧君(1999)的方法。
2 实验方法
2.1 全蛋白质提取
油松‘28’号无性系发现于辽宁省兴城
192 22(2)
油松种子园，本实验取其雌球果作实验材
料，其雌球果在几十个游离核时期停止发
育，最终导致雌性不育。为研究与其雌性育
性相关的蛋白质组，采集几十个直径为1~2 cm
游离核时期的雌球果(二年生)，-70℃冻存。
依据 Imin等(2001)的方法加以改进。称
取冻存的油松雌球果0.4 g，加入适量的聚乙
烯聚吡咯烷酮(polyvinylpoly pyrrolidone,
PVPP)，于-20 ℃预冷的研钵中，常温下迅
速(1分钟内)研磨成细粉。转移至10 mL离心
管中，按 1:5(g FW.mL-1)的比例加入-20 ℃
预冷的样品提取试剂A，-20 ℃沉降 1小时。
4 ℃，15 000g离心 15分钟，弃上清液。沉
淀于-20 ℃预冷的提取试剂B中，-20 ℃悬
浮 2小时以上(或过夜)。4 ℃，15 000g离心
15 分钟，弃上清液。用冷丙酮重复洗沉淀
物 2次，每次-20 ℃沉降 5分钟后离心。
离心后弃去丙酮，沉淀于-20 ℃下挥发
丙酮，自然干燥成粉末。干粉转入 1.5 mL
eppendorf管中(可在-20 ℃下保存)，上样前
加入 600 mL裂解液，20 ℃下水浴保温 30分
钟(温度不可高于 30 ℃，否则尿素产生的异
氰酸盐会使蛋白质的氨基甲酰化)，然后以
15 000g，20℃离心 15分钟，取上清液(这一
步骤可重复 1次，以得到最多的蛋白质)。用
Bradford法进行蛋白质定量。
2.2 等电聚焦
本实验均采用24 cm长IPG胶条,考马斯亮
蓝染色法的蛋白质上样量分别为 1 mg与
1.5 mg，银染为 300 mg。依据定量的结果取
适量的蛋白质上清液，用肿胀液补足至
450 mL。混均后于 15 000g，20 ℃下离心 5
分钟，取上清液。将 IPG胶条从-20 ℃下取
出后在室温下平衡10分钟。先将含样品的肿
胀液加入 IPG胶条槽中，将胶条的胶面向下
放入槽内，除去胶面与肿胀液间的气泡，然
后滴加 1 mL硅油。盖上胶条槽的盖子。放
于 IPG等电聚焦仪上，以30 V低电压泡涨后
进行等电聚焦。泡涨与聚焦的参数见表 1。
实际聚焦过程中，电压在 Step 6很难一
开始就达到 8 000 v，所以应以电压与时间
的乘积数作为聚焦完成的标准。pH 4~7的
线性 IPG胶条，聚焦最终达到 65 000 v×
h；pH 3~10的线性 IPG胶条，聚焦最终达
到 55 000 v× h。
2.3 胶条平衡
聚焦完成后，将胶条放入塑料长管中加
入平衡液A于摇床上平衡15分钟，然后弃去
A液，用平衡液 B再平衡 15分钟。取出胶
条后用滤纸小心吸去残余平衡液，胶条可
于-70℃下保存。
2.4 SDS-PAGE凝胶制备
按表 2 中配方于灌胶模具上灌制凝胶，
当凝胶储液从玻璃板的下面向上流到合适的
位置时，用 100 mL替换液挤出模具下“V”
形槽中的储液，并用水饱和正丁醇封胶。凝
胶要聚合 1小时以上。凝胶中要避免产生气
泡，要在等电聚焦完成前将凝胶准备好。
2.5 胶条转移
将平衡好的胶条支持膜贴于凝胶的玻璃
板上，转移到聚合好的凝胶上。将 30 mL
低分子量标准蛋白于沸水中煮 5分钟，剪
一张约 0 .5 cm× 0 .5 cm的滤纸片，吸取
标准蛋白溶液放于胶条的酸性端，用封
胶液封住胶条和滤纸片，注意胶条与凝胶
间不能有气泡。
表 1 IEF参数(20 ℃,每一胶条最大电流 50 mA,
胶条长24 cm)
Table 1 The parameter of IEF (20 ℃, the maxi-
mum current of each strip is 50 mA, the length of
each strip is 24 cm)
Steps Voltage(v) Time (h)
Step 1(rehydration) 30 12
Step 2 200 1
Step 3 500 1
Step 4 1 000 1
Step 5 8 000(gradient) 0.5
Step 6 8 000 8
1932005 丁坤善等: 油松雌性不育系球果蛋白质双向电泳技术的建立
2.6 SDS-PAGE
将凝胶板插入EttanTM DALT Ⅱ的缓冲液
柜中，灌适量的电极缓冲液，用代用板插满
空位置。以表 3中的参数进行电泳，凝胶规
格为 25.5 cm× 20 cm× 1 mm。示踪溴酚蓝
迁移至距凝胶底边约 1.5 cm时停止电泳。
2.7 染色和脱色
电泳结束后，pH 3~10胶条采用考马斯
亮蓝染色后再银染的方法 (郭尧君，1999)。
pH4~7胶条采用考马斯亮蓝染色，凝胶于染
色液中染色至少 6小时后脱色。对蛋白质图
谱照相，并用 UMAX PowerLook 2100 型扫
描仪以 600 dpi进行扫描。
3 结果
分别采用pH 3~10与pH 4~7两种长24 cm
的线性 IPG胶条电泳相同的样品，实验结果
的重复性都很好。采用 pH 3~10的胶条，以
300 mg蛋白质上样，考马斯亮蓝染色并脱色
后，几乎得不到蛋白质点，银染也只能得到
约 160个点，而且背景很深。蛋白质点几乎
全部集中在pH 4~7的范围内，多为酸性蛋白
质，碱性蛋白质仅有 1~2个，而且在 pH值
4~5间有一部分蛋白质没有分开(图 1)。
采用 pH 4~7的线性胶条, 分离结果明显
改善，考马斯亮蓝染色法能得到近 500个蛋
白质点，而且蛋白质点较均匀的分布在整个
pH 梯度内，脱色后背景很浅(图 2，图 3)。
采用12%的凝胶进行SDS-PAGE时，蛋
白质点多集中于凝胶的下部(图 1 )。比较
13%、13.5%、14.5%和 15%凝胶的分离结
果，15%的凝胶能使蛋白质点均匀的分布于
整块胶上并且分离良好(图 2，图 3)。
考马斯亮蓝染色时，1 000 mg的蛋白质
上样量使蛋白质点的形状近似圆形，较理
想；而 1 500 mg的上样量使蛋白质点脱尾较
明显；以国产低分子量标准蛋白作为对照来
估算蛋白质的分子量(图 2，图 3)。
4 讨论
国内外蛋白质组学的研究多以动物组织
和微生物为材料，有关植物蛋白质组学的研
究报道较少。本文的研究材料是裸子植物中
的典型代表，相对于动物、微生物和草本植
物，油松蛋白质的双向电泳难度很大。
4.1 样品研磨与蛋白质沉降
油松雌球果中纤维含量较高，细胞壁较
厚，常用的液氮研磨法破碎细胞的同时将纤
维和珠鳞研成细粉，导致固体颗粒表面积过
大。加入一定量的裂解液离心后，得到的上
清液体积较少，其中的蛋白质浓度和数量达
不到要求，而且杂质含量较高。本文的方法
是从冰冻状态下取出材料后直接研磨，不加
液氮，在 1分钟内将材料中的细胞研细。由
于纤维和褐色的珠鳞相对较粗，所以珠鳞
中不利于IEF的杂质溶解到提取液中的量可
减至最少。液氮研磨法得到的蛋白量只有
表 2 15% SDS分离胶配方
Table 2 The volume of each component in the 15%
separating gel
Component Volume
29.2% acrylamide, 0.8% N, N- 40 mL
methylenebis acrylamide
Gel buffer 21.36 mL
10%SDS 0.80 mL
10% ammonium persulfate 0.54 mL
TEMED 53.4 mL
Double distilled water 17.8 mL
Final volume 80 mL
终体积适于灌注一块 25.5 cm× 20 cm× 1 mm的凝胶
The final liquid volume is enough to pour a gel whose size
is 25.5 cm× 20 cm× 1 mm
表 3 SDS-PAGE 参数
Table 3 The parameter of SDS-PAGE
Steps Constant Time Pump Temperature
power (W.gel-1) (℃)
Step 1 5 40 min Auto 15
Step 2 13 8 h Auto 15
194 22(2)
本方法的 60%。因为研磨的时间很短，材
料一直处于冰冻状态，而且研磨后马上加
入冷的 TCA-丙酮，蛋白酶的活性能得到有
效的抑制。
由于油松雌球果中含有大量的色素、脂
类、酚类和糖类等对等电聚焦有严重影响的
物质，目前最合适的全蛋白质提取方法还是
TCA-丙酮沉降法。该方法能将样品中的大部
分色素、脂类、核酸和盐等除去，并能抑
制蛋白酶的活性，特别是能浓缩特殊的碱性
蛋白质，如核糖体蛋白质，但由于沉降后部
分蛋白质不能重新溶解从而导致丢失(Görg et
al., 1997, 2000)。
4.2 蛋白质提取液
由于蛋白质表达的动态变化很大，并且
不同蛋白质的分子量、等电点和溶解性存在
很大的差异，细胞或组织中全蛋白的提取仍
是难点，至今没有一种能提取出材料中全部
蛋白质的提取液。目前国内外常用的蛋白质
提取液(9 mol·L-1 urea, 2%~4% CHAPS, 1%
DTT, 2% V/V carrier ampholytes)还是基于
OFarrell的尿素裂解液修改而成。Leimgruber
等(2002)报道采用不同提取成分组成的“鸡
尾酒”能有效的提取蛋白质并产生良好的
电泳兼容性。蛋白质经沉降后再用提取液
溶解比较适合于难以处理的油松雌球果, 但
它并不能提取所有的蛋白质，特别是膜蛋
白和疏水性蛋白，所谓的全蛋白质也是相
图 2 油松雌球果全蛋白质 2-D电泳图谱
pH4~7的 IPG胶条，上样蛋白量为 1 000 mg，凝胶
浓度 15%,考马斯亮蓝染色
Fig.2 2-D electrophoresis pattern of protein in the
female cone
The pH of IPG strip was 4-7, 1 000 mg protein was
loaded,15% gel and coomassie stain were used
图 3 油松雌球果全蛋白质 2-D电泳图谱
pH4~7的 IPG胶条，上样蛋白量为 1 500 mg，凝胶
浓度 1 5 %，考马斯亮蓝染色
Fig.3 2-D electrophoresis pattern of protein in the
female cone
The pH of IPG strip was 4-7, 1 500 mg protein was
loaded,15% gel and coomassie stain were used
图 1 油松雌球果全蛋白质 2-D电泳图谱
pH3~10的 IPG胶条，上样蛋白量为 300 mg，凝胶浓
度 1 2 %，银染
Fig.1 2-D electrophoresis pattern of protein in the
female cone
The pH of IPG strip was 3-10, 300 mg protein was loaded,
12% gel and silver stain were used
1952005 丁坤善等: 油松雌性不育系球果蛋白质双向电泳技术的建立
对的。
低拷贝的膜蛋白或碱性蛋白可以通过预
分级法制备。先用高速离心分离细胞器和质
膜碎片 (Görg et al., 2000)，接着用不同性质
的溶解缓冲液(如水溶液与乙醇及氯仿 /甲醇
等有机溶剂)和去污剂(Weiss et al . ,1992;
Herbert,1999)连续抽提。此外也可结合沉降
法(如TCA/丙酮法)、自由电泳和蛋白质亲合
纯化等方法提取。
提取液的成分不仅能够使样品中的蛋白
质最大程度的溶解，同时又不能对等电聚焦
和染色有影响，因此要求这些成分不能带电
荷。尿素是较理想的中性增溶剂，它能很好
的增加蛋白质的溶解度，破坏蛋白质的高级
结构，暴露出离子基团，8 mol·L-1以上
的尿素较适合于油松雌球果蛋白质的提取。
另一种增溶剂(2 mol·L-1 thiourea, 7 mol·
L-1 urea)硫脲(thiourea)可以部分地替代尿素，
在膜蛋白质的提取中应用很多(Rabilloud,1998;
Molloy et al.,1998)。IPG buffer(载体两性电
解质)，因其可以屏蔽蛋白质表面的疏水基
团，减少蛋白质间的相互结合，可以明显提
高蛋白质的溶解性。一般要求 IPG buffer的
pH要与胶条的 pH相一致。
提取液中加入适量阴离子去污剂 SDS，
可以有效地增加大多数蛋白质的溶解性并抑
制蛋白质酶的活性(Harder et al., 1999), 但它
严重影响 pH值梯度的形成，易导致聚焦失
败，必须用高浓度的尿素稀释并用两性离子
去污剂替换它(Görg et al., 2000)。新型两性
离子去污剂CHAPS已替代了NP-40和Triton
X-100，它能很好地提高蛋白质的溶解性，
又不影响IEF(Labugger et al., 2002; Candiano
et al., 2002; Henningsen et al., 2002)。本实验
曾试用过SDS，但稀释过程较繁琐且SDS的量
不易控制，无论银染还是考马斯亮蓝染色几乎
都得不到蛋白质点，而 CHAPS的效果很好。
聚焦过程中必须打开蛋白质的二硫键并
使之处于还原状态，以免产生假点。过去常
用的还原剂β-巯基乙醇已被DTT(20~100 m
mol·L-1)替代。正丁基三磷酸 ( t r ibu ty l
phosphine，TBP)作还原剂能提高蛋白质的
溶解性(Herbert et al., 1998)，但其溶解性差
且不稳定，可与 D T T 结合使用。
4.3 上样量
采用上述提取方法，1 g鲜重油松雌球果
约能提取3 mg蛋白质。考马斯亮蓝染色法的
上样量在 1 000~2 000 mg间，上样量增加使
蛋白质点有较明显的拖尾，但数目增加不明
显。有时较高的蛋白质上样量(1 500 mg以上)
得到的蛋白质点却比上样量低时的着色还
浅。除了染色的原因外，聚焦过程中蛋白质
因浓度过高而在胶条槽中沉降可能是主要原
因。银染的上样量以 300 mg较好，过高的
上样量会使染色背景过深，过低则得不到足
够的蛋白质点(图 1)。
4.4 等电聚焦与SDS-PAGE
双向电泳技术的进步集中体现在其重复
性和分辨率都有了很大的提高，贡献最大的
是采用了 IPG胶条，它具有 pH 梯度稳定、
重复性好、分辨率高、上样量大和操作简便
等特点。已有商品化的多种 pH梯度范围和
长度的胶条。本实验首先选用 pH 3~10的宽
范围 IPG胶条做预试验，依据结果改用 pH
4~7的 IPG胶条，2-D图谱得到明显的改善。
油松中碱性蛋白质较少可能是由材料本身的
特点决定的，因为 TCA-丙酮沉降法是有利
于碱性蛋白质提取的。
聚焦效果的好坏还受 IEF过程中聚焦体
系的电导一致性与稳定性的影响。异丙醇
(Malone et al., 2001; Hoving et al., 2002)、水
饱和异丁醇、异丙醇的混合物(Leimgruber et
al., 2002)以及乙醇(Görg et al., 1997)均能控制
体系中水的流动，防止 pH梯度被压缩和具
有较高等电点的蛋白质丢失；单独使用甲基
纤维素或与乙醇混合能控制电渗透。这些方
196 22(2)
参 考 文 献
法均能较好的提高聚焦效果。
本实验以垂直板电泳方式于高通量的
EttanTM DALTⅡ上完成SDS-PAGE，电泳过
程中保持恒功率和恒温，并且通过循环泵使
电极缓冲液不断的流动，克服了体系中各处
的温度不均，进一步提高了实验的重复性。
4.5 染色
具有高灵敏度、宽定量线性范围和良好
质谱兼容性的染色方法对蛋白质组的研究有
重要意义。用于 2-D蛋白质检测的常用方法
是考马斯亮蓝染色法、银染法和荧光染色
法。考马斯亮蓝染色灵敏度较低，检测限为
0.2~0.5 mg(郭尧君，1999)。银染灵敏度很
高，检测限为 0.1 ng，但重复性差、动态
范围有限且步骤繁杂，使用的戊二醛和甲醛
对蛋白质的质谱鉴定影响较大。荧光染色法
灵敏度稍低于银染，检测限在1~2 ng的范围
内(Görg et al., 2000)，重复性很好且操作简
单，但染料很贵。常用的荧光染料 SYPRO
Red、SYPRO Orange和SYPRO Ruby对蛋白
质的修饰很小，很适合蛋白质组学的下游技
术，如MALDI-TOF-MS分析(Görg et al.,
2000; Berggren et al.,2002)。
新的染色技术是采用荧光染料Cy2、Cy3
与Cy5 (cyanine dyes，花青素染料)的2-D荧
光差异凝胶电泳 (fluorescence difference 2-D
gel electrophoresis, 2-D DIGE)。这一技术可
以建立内标，利用反应颜色的不同能同时完
成蛋白质的多元标记，其灵敏度很高且动态
范围很好(Leimgruber et al., 2002; Yan et al.,
2002)，特别适合于高通量的蛋白质组研究。
本实验采用改进的银染法得到的 2-D图
谱背景仍然很深，主要是油松雌球果中一些
难以除去的物质和部分核酸导致的，同时由
于后续实验中要对蛋白质进行质谱鉴定，银
染会产生较大的误差，所以采用了重复性很
好的考马斯亮蓝染色法，得到的蛋白质 2-D
图谱很好。可以利用图像分析软件对图谱间
的差异进一步做各种分析，为与油松雌性育
性相关的蛋白质组研究工作打下了基础。
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