全 文 ：向下转膜法在乙肝病毒 Southern杂交中的应用
张秉强 吴莹 唐霓 郭进军 黄英 汤华 黄爱龙*
(重庆医科大学病毒性肝炎研究所 感染性疾病分子生物学教育部重点实验室,重庆 400016)
摘 要: 目的 评价向下转膜法在乙肝病毒( H BV ) Southern 杂交中的应用效果。方法 用带有 1. 3 倍 HBV
基因的真核表达载体转染 H epG2 细胞, 使其产生瞬时 HBV 表达, 72 小时收集细胞并提取细胞总 DNA,琼脂糖凝
胶电泳后,以向上和向下两种方式转移在尼龙膜上;用化学发光标记和检测试剂盒将乙肝病毒基因片段标记成探
针,再与向上和向下转膜后的尼龙膜进行杂交, 判断产生明显 HBV 杂交条带所需的细胞总 DNA 量, 从而验证向下
转膜法在乙肝病毒 Southern 杂交中的应用效果。结果 发现向下转膜后,检测 HBV 表达所需的细胞总 DNA 量极
少,灵敏度高, 0. 5g 细胞总 DNA 电泳后转膜,即可检测出 HBV DNA 的表达,凝胶中仅有 8%的 DNA 残留;而向
上转膜所需的总 DNA 量大,灵敏度低, 25g 的细胞总 DNA 电泳后转膜,仅能检测出弱的条带。结论 向下转膜法
是一种较好的转膜方式,适于对乙肝病毒的 Southern 杂交,值得推广应用。
关键词: 向下转移 乙肝病毒 ( H BV ) Southern 杂交
The Application of Downward Capillary Transfer
in the Southern Blotting of HBV
Zhang Bingqiang Wu Ying T ang Ni Guo Jinjun Huang Ying Tang Hua H uang A ilong
( T he Inst itut e f or Vi ral H ep ati t is , K ey L aborator y of M olecular B iolog y on I nf ec tiou s Di seases ,
M ini str y of E ducation , Chong qing Univ er sit y of Med ical S cie nces , Ch ong qing 400016)
Abstract: Objective To investig ate the effect o f dow nward capillary t ransfer in the Southern blo tting o f H BV.
Methods T ransfecting the plasmid w hich conta ins 1. 3- fold-over length genome of HBV to HepG2 cells so as to g et
the expression of H BV , ex tr act ing to tal g enome DNA o f cells by common protoco l and loading on agaro se gel elec-
tr ophoresis, transfering the DNA o f the agaro se gel to Nylon membranes by both the dow nw ard and upw ard capi-l
lary transfer; labelling H BV DNA probe w ith the Gene Image A lkpho s Dir ect labelling sy st em and hybridizing w ith
the t otal DNA o f cells on the Nylon membranes, compar ing the sensitiv ity of upw ard w ith dow nward capillary tr ans-
fer s in the Sout hern blo tting of H BV . Results We found that the sensit ivity of dow nw ard capillar y tr ansfer is higher
than that o f upward in the Southern blotting of HBV , 0. 5g o f t otal DNA of cells can be detected the DNA expres-
sion o f HBV , there ar e only 8 percent of tot al DNA left in the agar ose gel after transferr ed by downw ard capillary
transfer; conversely , 25g of tota l DNA of cells can only be detected low DNA expression of H BV in upw ard capi-l
lary transfer. Conclusion T he dow nw ard capillar y transfer is better than that of upwa rd in the Southern blott ing o f
HBV, and should be applied broadly.
Key words: Dow nward capillar y transfer H epat itis B virus ( HBV) Southern blot ting
Southern杂交是一种经典的杂交方式[ 1 ] ,它可以特异地检测 DNA的水平,已被广泛应用于功能基组学
的研究中,被认为是一种最直观和最可靠的检测指标。经典的凝胶转膜方式为 Southern 提出的向上转移
法,它操作简便,可以方便地更换吸水纸,但由于它是靠毛细管虹吸现象来完成的,故必需在吸水纸上增加重
基金项目:国家杰出青年基金( 30228026)和国家青年科学基金( 30300298)资助
作者简介:张秉强,男, 36岁,主治医师,博士生, E-mail: z hbingqiang@ 163. com. T el: 023-68485230
* 通讯作者:黄爱龙,男, 40岁,博士生导师 地址:重庆医科大学 109号信箱( 400016) E-m ail : ahu ang@ pub lic. cta. cq. cn
生物技术通报
研究报告 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 2期
量,以提高毛细管的虹吸力,然而, 这样却会使凝胶受压并脱水而变薄,变薄后的凝胶其孔径会更小,此时,即
使延长转移时间也不能使大分子量的 DNA 转移出去; 再者, 由于向上的虹吸力与重力的方向相反, 故尚需
克服重力的影响,因此,向上转移法不能良好地完成 DNA 的转移。当用向下转移法时 [ 2~ 4] , 不需在吸水纸
上增加重量, 故凝胶基本不变形; 加之吸水纸的吸力与水受到的重力方向一致, 故可以良好地完成 DNA 的
转移。为探讨向下转膜法在 HBV Southern 杂交中的应用效果,特做此研究。
1 材料与方法
1. 1 主要材料
1. 3倍 HBV 基因的真核表达载体, 由本室构建 [ 5]。转染试剂为 Inv it ro gen的 Lipofectamin 2 000。琼
脂糖购于上海百威科技公司, 电泳仪采用北京六一公司的产品, DNA 标记和检测采用英国 Amersham Phar-
macia生物技术公司的 Gene ImageTMAlkphesDirect TM试剂盒,尼龙膜为德国 Roche公司的 HybondTM N + 尼
龙膜。核酸定量采用美国 Beckman公司 DU Series 600分光光度仪进行,凝胶成像、发光后曝光和图像分析
采用英国剑桥 Synopt ics有限公司生物影像系统中的 GeneGenius、Genome 和 GeneT ools 软件(版本 3. 05)
进行。
1. 2 方法
1. 2. 1 细胞 HBV 瞬时表达 用 pHBV1. 3转染 H epG2细胞,使其产生瞬时 HBV 表达[ 5] ,转染方式按说
明书进行,细胞 90%以上融合时进行转染, 100ml培养瓶中加质粒 4g,脂质体 8l。
1. 2. 2 细胞总 DNA 提取 采用分子克隆(第三版)中的方法操作,即细胞收集后加细胞裂解液 500l再悬,
蛋白酶 K消化后, 以等体积酚、氯仿、异戊醇混合液抽提两次,氯仿抽提一次, 100%乙醇、乙酸钠沉淀, 70%
乙醇漂洗,风干后, TE 溶解细胞总 DNA,用分光光度仪进行 DNA 定量。
1. 2. 3 向上和向下转膜 均采用分子克隆(第三版)中介绍的方法操作,向下转膜时,最上面是一纱布条,下
面依次是滤纸、琼脂糖凝胶、尼龙膜、滤纸、吸水纸,纱布条两端浸于 10 SSC中, 转膜时间均为 16小时。
1. 2. 4 探针标记及检测 用 Gene ImageTM AlkphesDirect TM试剂盒对乙肝病毒 DNA 进行标记, 操作按说
明书进行, 标记后的探针再与不同转移方式得到的尼龙膜进行过夜杂交,洗膜后,加检测试剂, 在 Genome曝
光仪中检测并成像, 用 GeneT oo ls软件进行图像分析。
图 1 向下转膜法凝胶电泳和杂交后曝光结果
1、细胞总 DNA( 0. 5g)
2、细胞总 DNA( 0. 5g)
3、细胞总 DNA( 3g)
从图上可以看出,向下法转膜时,细胞总 DNA 为 0. 5g、曝光 2 小时, 即可检测出
HBV 的 DNA 表达(第 1、2泳道 ) ;当细胞总 DNA 增大至 3g 时,杂交信号非常强
(曝光 2~ 4小时)。
2 结果
发现通过向下转移法进行的 South-
ern杂交, 其灵敏度高,所需上样电泳的细
胞总 DNA 量极少,如图 1 所示, 0. 5g 细
胞总 DNA 上样电泳后经向下法转膜, 即
可检测出 HBV DNA 的表达(第 1、2 泳
道,曝光 2~ 4小时) ;当细胞总 DNA 增大
至 3g 时, 杂交信号非常强(第 3泳道,曝
光 2~ 4小时)。通过 Geneto ol软件分析
发现,在向下转移法中, 凝胶中残留 DNA
的量仅占上样电泳总量的8%(图 2) , 说明
向下转移法的凝胶转出率较高。而通过
向上转移法进行的 Southern杂交, 其灵敏
度低,需大量细胞总 DNA 上样电泳,才能
检测出 HBV DNA 表达, 如 18g 细胞总
272005年第 2期 张秉强等:向下转膜法在乙肝病毒 Souther n杂交中的应用
DNA 上样电泳后经向上法转膜,尚不能看出明显的杂交条带(第 3 泳道, 曝光 4小时) ; 25g 时仅能检测出
弱的杂交信号(第 2泳道,曝光 4小时) , 80g 时,才能出现明显的杂交条带( A、B、C 泳道, 曝光 4小时)。由
于向上转膜时凝胶脱水变薄, 故通过 Genetoo l软件分析发现,在向上转移法中,凝胶中残留大分子 DNA 的
亮度甚至可以超过原上样 DNA的亮度(结果未列出) ,说明向上转移法的凝胶转出率较低。
图 2 Genetool软件分析向下转膜效率结果
1、HBV1. 3酶切片段 4. 2和 3. 2kb( 80ng)
2、细胞总 DNA( 025g)
3、细胞总 DNA( 18g)
A、B、C:细胞总 DNA( 80g)
从图上可以看出,向上转膜时, 25g 细胞总 DNA、曝光 4 小
时,才能看出弱的HBV杂交条带(第 2泳道) ; 18g 时、曝光
4小时尚不能看出明显的杂交条带 ( 第 3 泳道 ) ; 增大至
80g 时,才出现明显的杂交条带( A、B、C泳道)
3 讨论
乙肝病毒感染细胞模型的建立与评价目前仍然是一个
难题,由于细胞模型中乙肝病毒表达水平低,故对 HBV 检测
的 Southern杂交就更为困难。虽然在斑点杂交时, 通过曝
光的放大效应可以检测出 0. 1pg 的 DNA, 但在 Southern杂
交时,如果转膜不完全, 大量 DNA 被残留在凝胶中,则势必
严重影响其灵敏度,因此, 有必要在 Southern杂交的转膜方
式上下功夫(有研究者甚至试图直接在凝胶上进行杂交, 但
未能成功)。由于 DNA 的转移效率与凝胶的变形程度直接
相关,故必需在凝胶受压变形前完成转移全过程。经典的向
上转移法会使凝胶短时间内变薄,此时即使延长转移时间至
24小时以上,也不能使大分子 DNA 良好地转移出去,因此,
向上转移法不能良好地完成 DNA 的转移。由于膜与 DNA
的结合是靠高盐浓度来实现的, 尤其对于硝酸纤维膜更是如
此, 因此,转膜方式中的电转方式和半干转移法往往不被首
选, 因为它们都要求很低的盐浓度;真空转移法与向下转移
法有许多相似的地方, 但尚需购买特殊的仪器,并需注意调
整负压吸引的力度,以防凝胶破裂; 向下转移时,由于不需在
吸水纸上增加重量, 凝胶基本不变形;加之吸水纸的吸力与
水受到的重力方向一致,故可以良好地完成 DNA的转移,它
不需要特殊的仪器,转移速度较快,转移效率高 [ 2~ 4] ,值得推
广应用。结合我们的经验,向下转移时, 需要注意以下几点:
1、转移液的水平面应略低于凝胶的水平面。如果转移液的水平面高于凝胶,则短时间内会有大量液体聚集
在凝胶上,并直接从侧面流失;如果转移液的水平面过分低于凝胶,则影响纱布的吸水力,使转移效率下降。
2、吸水纸吸水后易变形, 会使吸水纸与滤纸间产生空隙,从而降低吸水纸的吸水效率,故应及时更换吸水纸。
3、过夜转移时, 应及时添加转移液,以防吸干。4、样本丰度高时,转移时间可以缩短至 1小时,但此时凝胶上
仍可见大分子量 DNA 的残留,故当样本丰度低时,可以延长转移时间。5、纱布上不要加盖重物, 以防凝胶
受压变薄,影响转移效率。
参 考 文 献
1 S outhern EM . J. M ol . Biol. Detect ion of sp ecif ic sequences among DNA fragments separated by Gel E lect rophores is, 1975, 98: 503~ 17.
2 C homczyn ski, P. Biochem, 1992, 201: 134~ 9.
3 C homczyn ski P, Mack ey K. An al Biochem, 1994, 221( 2) : 303~ 5.
4 M ing YZ, Di X, Gom ez-Sanchez EP. Biotechniqu es, 1994, 16( 1) : 58~ 9.
5 唐霓,黄爱龙,张秉强.中华肝脏病学杂志, 2003, 11(8) : 464~ 6.
28 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 2期