全 文 ：收稿日期:2006-04-27
基金项目:国家杰出青年基金(30225026);国家青年科学基金(30300298)资助
作者简介:张秉强,男,36岁,主治医师,博士生,研究方向:乙肝病毒的基因治疗。E-mail:zhbingqiang@163.com,Tel:023-68485230
通讯作者:黄爱龙,男,40岁,博士生导师,E-mail:ahuang@public.cta.cq.cn
抗乙肝病毒shRNA表达载体转染条件的优化
张秉强 吴莹 黄英 张君 张建军 唐霓 黄爱龙
(感染性疾病分子生物学教育部重点实验室 重庆医科大学病毒性肝炎研究所,重庆 400016)
摘 要: 目的 优化抗乙肝病毒(HBV)短发夹样RNA(shorthairpin RNA,shRNA)表达载体转染条件,从而克服
过量转染所致细胞大批死亡的弊端,以便更客观地反映RNA干扰抗乙肝病毒的效率、方法,通过脂质体介导,将HBV真核
表达载体pHBV1.3与我们以前研究确定为能有效抗乙肝病毒的shRNA表达载体pTZU6-C共同转染肝癌细胞HepG2,将
共转染的两种质粒及所需的脂质体设立成不同浓度和比例,以pHBV1.3与不表达shRNA的空载体pTZU6的共转染作为
未干扰阴性对照,转染36h后收集细胞,通过Southern杂交来观察乙肝病毒DNA明显复制和显著受抑时,所需pHBV1.3与
pTZU6-C的最适剂量和比例,以及相应脂质体的用量;同时,通过Western杂交来观察HBV蛋白表达的变化。结果 通过
southern杂交,发现当将pHBV1.3(μg):pTZU6-C(μg)固定为6:1,脂质体(μl):质粒(μg)为1:1时,对于100ml培养瓶中
90%以上融合的细胞,用3.5μl的脂质体共转染0.5μg pHBV1.3和3μg pTZU6-C,即可检测出HBV DNA的表达,此
时,存活细胞总数不受任何影响;随着pHBV1.3量的增多,HBV DNA的表达亦增多;当pHBV1.3增至4μg时,虽然表达
量增多,但存活的细胞总数却开始明显减少,存活细胞约为70%～80%;当用8μg时,存活的细胞不足40%～50%,检测水平
反而下降。当pHBV1.3(μg):pTZU6-C(μg)为1:1时,即可观察到乙肝病毒DNA表达的明显抑制作用,其抑制率为71%;
当两者的比例为1:2时,其抑制率为70%;比例为1:6时,抑制率为84%。Western杂交的结果亦证实,共转染 0.5μg
pHBV1.3和3μg pTZU6-C,即可检测出HBV蛋白的表达;但转染36h后,尚未能观察到HBV表面抗原(HBsAg)表达明
显受抑的情况。结论 抗乙肝病毒shRNA表达载体的转染条件需要优化,对于100ml培养瓶中90%以上融合的细胞,用
6μl的脂质体共转染2μgpHBV1.3和4μg pTZU6-C,即可观察到明显的HBV表达和显著的RNA干扰抑制效果,本研
究结果为下一步针对乙肝病毒不同靶区shRNA表达载体的转染奠定了坚实的基础。
关键词: 细胞转染 RNA干扰 乙肝病毒(HBV)
TheOptimizationofTransfectingHBVSpecificshRNA
ExpressionVectorinVitro
ZhangBingqiang WuYing HuangYing ZhangJun ZhangJianjun TangNiHuangAilong
(InstituteforViralHepatitis,KeyLaboratoryofMolecularBiologyonInfectiousDiseases,MinistryofEducation,Chongqing
UniversityofMedicalSciences,Chongqing400016)
Abstract: ObjectiveTooptimizethetransfectionofHBVspecificshorthairpinRNA(shRNA)expresionvector
intoculturecels,sothattheinvestigationoftheRNA interferenceoninhibitingHBV expresioncanbeperformed
objectively.MethodsCo-transfectingHBV expresionvector(pHBV1.3)andshRNA expresionvector(pTZU6-C)into
HepG2celbylipofectamine,andinvestigatingthedoesofvectorsandlipofectaminebywhichitcanbegotahigh
expresionanddeepinhibitionofHBV DNA inSouthernbloting.ResultswefoundthatHBV DNA-replicative
intermediatescouldbedetectedinSouthernbloting36hoursposttransfectionwhenusing6μloflipofectamineto
co-transfect0.5μgofpHBV1.3and3μgofpTZU6-Cto100mlofculturevesels,andtheexpresionofHBVDNA
wilbeincreasedwiththeamountofpHBV1.3enhancedwhentheirratiofixedto1:6,however,thealivecelswas
decreasedto70to80percentwhen4μgofpHBV1.3wasused,andwouldbeonly40to50percentleftwhen8μg
ofpHBV1.3wasperformed,meanwhile,theexpresionofHBV DNA washardlycutdown.TheefectofRNA
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第6期·研究报告·
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第6期
RNA干扰是一种新型的基因沉默技术,现已广泛应用于功能基因组学、基因靶向治疗、遗传规律和生长发
育等多领域的研究中,被认为是一种快速、高效抑制基因表达的新型生物技术。以载体的方式在体内表达
shRNA是一种能快速、经济、高效和持久发挥RNA干扰作用的方式[1],但由于RNA干扰作用存在剂量依赖性和
受载体上启动子转录活性的影响,故必需大量转染shRNA表达载体才能获得较为满意的抑制效率。然而,由于
所提取质粒中所残留着细菌细胞壁的内毒素成份,以及质粒本身表达的其它外源性蛋白所具有的细胞毒性,加
之为实现有效转染而所需的大剂量对细胞有毒性的脂质体,而使得在被转染后,短时间内即有大量细胞死亡,
尤其当外源靶基因亦需共转染时,更是如此。由于死亡的细胞过多,使RNA干扰作用的观察非常困难,并且不
易区分靶基因表达水平的减低是RNA干扰的作用,还是大量细胞死亡之故。为此,很有必要对具体的转染条件
进行优化,以找出获取满意效果的最佳转染剂量,以便更客观真实地分析RNA干扰的作用。
1 材料与方法
1.1 主要材料
肝癌细胞HepG2为本实验室冻存,细胞培养用血清为杭州四季青生物工程材料有限公司新生牛血清,1
640培养基为本室提供。pTZU6+1载体由美国DavidEngelke博士惠赠[2],内含有人U6启动子,能在体内将启动
子后的DNA序列转录成RNA。抗乙肝病毒shRNA表达载体pTZU6-C由本室构建,其靶基因为HBVayw型核
心区2052～2070,其构建方法的按我们的前期工作进行[3],即DNA寡核苷酸的退火过程在含 200mMNaCl的退
火缓冲液中完成,通过4℃下5%琼脂糖凝胶电泳判断退火效率。1.3倍HBV基因的真核表达载体pHBV1.3由
本室构建[4]。质粒提取采用Qiagen公司的去内毒素大量提取试剂盒进行,转染试剂为美国Invitrogen公司的脂质
体LipofectamineTM2000,其稀释液为Opti-MEM。琼脂糖购于上海百威科技公司,电泳仪采用北京六一公司的产
品,Southern杂交所用 DNA标记和检测采用英国 AmershamPharmacia生物技术公司的 GeneImageTM
AlkphesDirectTM试剂盒,尼龙膜为德国Roche公司的HybondTMN+尼龙膜,探针为HBVX区片段,长度为465bp。
核酸定量采用美国Beckman公司DUSeries600分光光度仪进行,凝胶成像、发光后曝光和图像分析采用英国
剑桥Synoptics有限公司生物影像系统中的GeneGenius、Genome和GeneTools软件(版本3.05)进行。West杂交
检测HBsAg所用的一抗为抗HBsAg阳性的人血清,二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG;检测actin表
达所用的一抗为北京中杉公司的小鼠抗人actin单克隆抗体,二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgG,辣根
过氧化物酶的底物为美国Pierce公司的SuperSignalWestpico发光底物,封闭液为Pierce公司的SuperBlock。
硝酸纤维膜为德国Roche公司的产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞HBV和shRNA瞬时表达 用脂质体将pHBV1.3和pTZU6-C共转染入HepG2细胞,使其产生瞬时
HBV和 shRNA表达[4,5],以不表达shRNA的空载体 pTZU6与 pHBV1.3的共转染作为未干扰阴性对照,转染方
式按LipofectaminTM2000说明书进行,即当细胞90%以上融合时进行转染,先用稀释液 Opti-MEM 将质粒和脂
质体稀释,再将二者混合,室温孵育20min后,直接加于含血清但不含抗生素的细胞培养基中即可。转染后36h
用胰酶消化并收集细胞。
1.2.2 细胞死亡总数的计算和生长情况判断 在转染24h后,随机计数5个20倍视野下的悬浮细胞总数,作
interferencecanbefoundwhenpHBV1.3:pTZU6-C ratiowasonly1to1:1,theinhibitionratesofHBV DNAare
71,70,and84percentwhenpHBV1.3:pTZU6-C ratiowas1:1,1:2and1:6,respectively.Westblotingshow thatthe
proteinexpresionofHBVcanbedetectedwhenco-transfecting0.5μgofpHBV1.3and3μgofpTZU6-C,however,
theinhibitionrateofHBVproteinexpresionwasnotsohighasthatofHBVDNA.ConclusionWhenusing6μlof
lipofectaminetoco-transfect2μgofpHBV1.3and6μgofpTZU6-Cto100mlofculturevesels,therecanbefounda
highexpresionofHBVandadeepinhibitionofRNAi.
Keywords: Transfection HepatitisBvirus(HBV) RNAinterference
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为转染后细胞死亡情况判断的指标;同时,通过观察细胞形态、细胞密度和培养基的透光度来反映细胞的生长
情况。
1.2.3 细胞总DNA提取 采用分子克隆(第三版)中的方法操作,即细胞收集后加 500μl细胞裂解液再悬,用
蛋白酶K消化3h,以等体积Tris饱和酚(pH8.0)抽提两次,氯仿抽提一次,100%乙醇、乙酸钠沉淀,70%乙醇漂
洗,风干后,TE溶解细胞总DNA,用分光光度仪进行DNA定量。
1.2.4 HBVSouthern杂交 采用向下转移法进行凝胶转膜[6],即最上面是一纱布条,下面依次是滤纸、琼脂糖凝
胶、尼龙膜、滤纸和吸水纸,纱布条两端浸于10×SSC中,转膜时间为3h。探针选HBVDNA的X区片段,长度为
465bp,先通过PCR扩增,再装入PGEM-T载体,经测序证实序列正确,使用时经酶切、胶回收而获得。用 Gene
ImageTMAlkphesDirectTM试剂盒对X区片段进行标记,操作按说明书进行,标记后的探针再与向下转移方式得到
的尼龙膜进行过夜杂交,洗膜后,加检测试剂,在 Genome曝光仪中检测并成像,用 GeneTools软件进行图像分
析。
1.2.5 细胞HBVDNA表达最低检出限的确定 当将pHBV1.3(μg):pTZU6-C(μg)固定为 1:6,脂质体(μl):质
粒(μg)为1:1时,设立 0.5、1、2、4和8μg共5个浓度梯度,观察 Southern杂交能够检测出细胞 HBVDNA表达
所需的最低pHBV1.3转染量。具体剂量见表1。
1.2.6 RNA干扰作用剂量依赖性的判断 设立pHBV1.3(μg):pTZU6-C(μg)为1:1、1:2和1:6共三个梯度,观
察乙肝病毒DNA复制受抑与pHBV1.3和pTZU6-C比例的关系。
1.2.7 West杂交 按常规操作执行,即煮沸变性的细胞总蛋白经12%变性聚丙烯凝胶电泳后,20伏电压过夜
电转于硝酸纤维膜上,用SuperBlock封闭液封闭15min后,加入抗HBsAg阳性患者血清,稀释率为 1:200,4℃
孵育过夜,PBS洗膜后,放入用封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG中,室温2h,用TBS洗膜后,
加入SuperSignalWestpico发光底物,静置10min后,于Genome曝光仪中曝光1～2min成像,图像用GeneTools
软件进行分析。杂交后的膜再用PBS洗三次,放入封闭液稀释的小鼠抗人actin单克隆抗体中,室温下进行二次
杂交,PBS洗膜后,加二抗孵育,再用TBS洗膜,最后加SuperSignalWestpico发光底物,于Genome曝光仪中曝
光并成像。
2 结果
2.1 细胞死亡情况
当pHBV1.3和pTZU6-C的比例为1:6,转染24h后的细胞死亡及生长情况见表1,结果显示,当用低剂量
的质粒和脂质体时,存活细胞总数不受影响;随着pHBV1.3量的增多,悬浮细胞开始增多,细胞生长受到抑制;
用4μgpHBV1.3时,存活细胞约为70%～80%;用8μg时,存活的细胞不足40%～50%。
2.2 细胞HBVDNA表达检出限的确定
从图 1可以看出,当共转染 0.5μgpHBV1.3,即可检测出 HBVDNA的表达;随着 pHBV1.3量的增高到 1～
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2μg,HBVDNA的表达亦增高;当pHBV1.3增至4μg时,表达量最高,但存活的细胞总数却开始明显减少,所提
取的细胞总 DNA较少;当用 8μg时,存活的细胞不足 40%～50%,所提取的细胞总 DNA明显减少,使 Southern
检测水平反而下降(这两项结果未列出)。
2.4 Western杂交结果
从图3可以看出,共转染0.5μgpHBV1.3和3μgpTZU6-C,即可通过West杂交检测出HBsAg的表达;但转
染36h后,尚未能观察到HBsAg表达明显受抑的情况。
3 讨论
RNA干扰是一种转录后基因沉默的技术,它可以使靶基因表达水平减低,但不能使其完全消失,因此在基
因治疗中被称为敲低(knockdown),而不是基因敲除(knockout)。虽然在研究线虫、果蝇和植物中发现长片段外
源双链RNA可以被切割成许多小的双链RNA(siRNA),siRNA可以作为引物在体内经PCR扩增,使RNA干扰
的效率放大,但以化学合成和载体表达形式产生的siRNA和shRNA其抑制靶基因效率却存在明显的剂量依赖
2.3 RNA干扰剂量依赖性的判断
见图2,当pHBV1.3(μg):pTZU6-C(μg)为1:1时,即可观察到乙肝病毒DNA表达的明显抑制作用,其抑制
率为71%;当两者的比例为1:2时,其抑制率为70%;比例为1:6时,抑制率为84%。
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性,为此,势必增大siRNA和shRNA表达载体的量才能得到满意的抑制效果。以脂质体为媒介的体外转染虽然
价格昂贵,但由于其转染效率较高、操作简便,不需要过多人为干预,因此,仍然是目前的主要转染方式之一。它
的原理是先将质粒DNA用脂质体包裹,再与细胞混合,带阳离子的脂质体与细胞膜结合并与之融合,从而使质
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粒进入细胞内。然而,要想将大量质粒转染于细胞内,势必需要大量的脂质体来包裹,由于脂质体本身具有一定
的细胞毒性、从细菌中分离得来的质粒携带有细菌的内毒素,以及大量质粒本身表达的一些细胞毒性蛋白均可
导致细胞迅速死亡,这就影响了RNA干扰结果的分析,为此,有必要通过优化转染条件来寻找满意的转染剂量
和明显的RNA干扰抑制效果。关于RNA干扰抗HBV的研究,国外曾报导使用4μgHBV表达质粒和4、8及
15μgshRNA表达质粒,观察到15μgshRNA表达质粒的抑制作用较明显[7]。我们曾报导用免疫荧光观察1:5,1:
10和1:20的抗HBV效果,发现1:20的抑制效果最强[5],但死亡细胞数也越多;故后来用1:6比例进行观察,即
用 4μgpHBV1.3和 24μgpTZU6-C,发现能观察到明显的抑制效果,但细胞死亡数仍多,下游分析的标本过少,
Southern杂交检测困难,而且不易排除死亡因素的影响。我们此次应用经典的southern杂交,以总DNA电泳时的
量为细胞数的参照,以使RNA干扰结果更为可靠,而且大胆地将质粒、脂质体是量和比例进行显著削减,从结
果上来看,用6μl脂质体共转染2μgpHBV1.3和4μgshRNA表达质粒,即可获得明显的HBVDNA表达和显著
的RNA干扰抑制作用,其所用的脂质体和质粒的量远远少于说明书推荐的剂量(40μl脂质体和16μg质粒),下
游分析所需的细胞数充足,易于同时进行多项指标检测,因此,这一优化结果,为下一步众多针对不同靶区
shRNA表达载体的转染奠定了坚实的基础。
我们也曾通过酶联免疫法对乙肝病毒抗原表达的检测来反映RNA干扰抗乙肝病毒的效率,但由于其中没
有相应内参检测作为细胞数的衡定,故不能良好地反映其抑制作用,为此,我们此次仅用 Southern杂交来进行
评估,并以上样量作为内参来衡定细胞总数,这样就可以更真实地反映RNA干扰的效果。由于RNA干扰是转
录后基因沉默,故对已表达的蛋白质没有抑制作用,因此,我们未能在转染36h后即观察到其对蛋白表达明显
的抑制作用,这一作用需在转染后的48～72h,才能被观察到。
参考 文献
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