全 文 ：第26卷 第6期
2014年6月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 26, No. 6
Jun., 2014
文章编号：1004-0374(2014)06-0634-11
DOI: 10.13376/j.cbls/2014089
收稿日期：2014-05-22
基金项目：国家自然科学基金项目(91132307，20921004)；中国科学院战略性先导科技专项(XDB02050005)；科技部支撑计划
(2012BAI23B02)
#并列第一作者
*通信作者：E-mail: fuqiang.xu@wipm.ac.cn；Tel: 027-87197091
利用嗜神经病毒跨突触追踪神经网络研究进展
张志建1,2,3#，靳　森1,4#，朱续涛1,4，贾　凡1，王华东1，刘　青1，何晓斌1，徐富强1,2,3,4*
(1 中国科学院武汉物理与数学研究所，波谱与原子分子物理国家重点实验室，生物磁共振分析重点实验室，武汉 430071；
2 华中科技大学生命科学与技术学院，武汉 430071；
3 武汉光电国家实验室，武汉 430074；4 中国科学院大学，北京 100049)
摘　要：解析大脑神经网络的连接图谱是认识大脑功能的前提。发展追踪大脑神经环路结构的技术，已成
为神经科学研究中的迫切需求。基于嗜神经病毒发展而来的跨突触追踪技术，是揭示大脑神经网络结构的
最有效手段，也是神经科学研究中发展十分迅速的领域。不同的嗜神经病毒类型或毒株，都有其独特的分
子生物学特性、跨突触标记特性、改造方式。通过使用遗传重组改造的嗜神经病毒追踪神经环路，可以获
得特定区域或特定类型神经元多级输出网络、输入网络及单级输入或输出网络。主要介绍神经科学研究中
常用的神经病毒及相关的辅助工具病毒特性，及嗜神经病毒介导的各种神经回路标记技术。
关键词：嗜神经病毒；跨突触追踪；神经环路
中图分类号： Q42；Q939.4；R373.9 文献标志码：A
徐富强，中国科学院武汉物理与数学研究所研究员、博士生导师，
武汉光电国家实验室 (筹 )多模态小动物成像研究团队负责人，华中科技
大学生命科学学院兼职教授，中国神经科学会技术委员会副主任。先后
获中科院“百人计划”和“国家杰出青年科学基金 (外籍 )”支持。相继
承担了国家自然科学基金委重点项目“标记和研究记忆相关神经环路的
新技术新方法”，中科院战略性先导科技专项“神经回路示踪及其在感知
觉等联结图谱研究中的应用”等。本课题组综合不同层次和尺度的神经
生物学方法和技术，研究嗅觉及 AD动物模型的神经回路系统。在此基础
上，建立了分子生物学、神经环路示踪、微透析、电生理、光学成像、
磁共振成像、动物行为等技术和方法，尤其是近年来率先在国内开展了
嗜神经工具病毒的开发和运用研究。目前构建了各种工具病毒载体约 50
余种，建立了嗜神经工具病毒研究神经环路结构与功能的各类标记系统
和较完善的技术平台，已在与国内外数十家优秀实验室和著名医院的合
作中得到应用。为构建微观的分子 /细胞水平研究与宏观的系统 /行为水
平研究之间的桥梁，解决基础神经生物学问题及重大神经精神疾病相关
的神经环路等问题提供了有力的工具。
张志建，等：利用嗜神经病毒跨突触追踪神经网络研究进展第6期 635
Advancement in neurotropic virus-mediated trans-synaptic
neural circuit tracing
ZHANG Zhi-Jian1,2,3#, JIN Sen1,4#, ZHU Xu-Tao1,4, JIA Fan1, WANG Hua-Dong1, LIU Qing1,
HE Xiao-Bin1, XU Fu-Qiang1,2,3,4*
(1 Key Laboratory of Magnetic Resonance in Biological Systems, State Key Laboratory of Magnetic Resonance and
Atomic and Molecular Physics, Wuhan Institute of Physics and Mathematics, the Chinese Academy of Sciences, Wuhan
430071, China; 2 College of Life Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan
43007, China; 3 Wuhan National Laboratory for Optoelectronics, Wuhan 430074, China; 4 University of Chinese
Academy of Sciences, Beijing 100049, China)
Abstract: Developing the technology to dissect the brain circuits became urgent in neuroscience to understand the
brain functions. The technology for neurotropic virus-mediated trans-synaptic tracing has developed rapidly and
becomes the most effective technology for revealing the structure of the brain circuit to date. Various neurotropic
viruses have its own molecular features, trans-synaptic characteristic and strategy of recombination. The genetic
recombinants of the neurotropic viruses enable us to dissect the input and output circuits of specific brain region or
cell type of the neurons at multiple or single step of synaptic connections. This review summarizes the fundamental
characteristic of these neurotropic viruses and related helper viral vectors, as well as the recent advancement in
studies of neural circuits using these neurotropic viruses.
Key words: neurotropic virus; trans-synaptic tracing; neural circuits
大脑神经网络是由数目庞大，以及形态、特性
各异的神经元，通过突触连接构成的复杂结构，是
大脑行使认知、情感、记忆、想象等活动的结构基础。
揭示大脑神经网络的结构，是最终理解大脑处理信
息的机制的基本前提。传统的神经网络示踪方法，
如电镜、高尔基染色、染料、蛋白质和肽类标记物，
可以显示一个脑区神经元的形态及其对其他脑区的
投射；利用转基因小鼠也能显示大脑中特定细胞类
型神经元的形态；少数蛋白质类示踪剂，如WGA、
TTC等还可实现跨突触标记，但这些示踪方法具有
信号间接、方向不特异、跨突触后信号衰减严重等
问题。上述传统示踪方法促进了人们对大脑神经网
络结构的认识，但难以用于研究由多个脑区、多种
类型神经元通过突触连接形成的复杂神经网络，而
这类神经网络才是大脑处理特定信息所依赖的环
路。嗜神经病毒 (neurotropic virus)是一类能感染神
经细胞，且能沿神经环路传播增殖的病毒。利用嗜
神经病毒作为示踪工具，与传统的示踪剂相比有如
下特点：(1)可以跨突触传播； (2)跨突触方向可控，
可特异顺行或逆行传播；(3)病毒跨突触后可复制，
信号不衰减；(4)可携带多种标示物。嗜神经病毒
的上述特性使其在示踪大脑神经网络结构的研究中
显示出独特优势。本文将分类介绍嗜神经病毒的特
性及其在神经环路示踪中的研究进展，同时简要介
绍神经环路标记中常用的假病毒载体的特性，并总
结现有的嗜神经病毒实现特定神经环路标记的基本
策略。
1　嗜神经病毒的特性及其在神经环路示踪中
的研究进展
目前常用于神经环路示踪的嗜神经病毒，主
要是利用各种病毒的疫苗株发展而来。根据其遗传
信息、形态及生活史等特性，可分为两大类，分别
是 α疱疹病毒科 (α- herpes virus)的伪狂犬病毒
(pseudorabies virus, PRV)和 HSV-1-129以及弹状病
毒科 (rhabdoviruses)的狂犬病毒 (rabies virus, RV)
和水疱炎病毒 (vesicular stomatitis virus, VSV)等。
此外，神经环路示踪通常还需要一些不跨突触的
辅助病毒载体，包括腺相关病毒 (adeno-associated
virus, AAV)、逆转录病毒 (retrovirus) 和慢病毒
(lentivirus)等 (表 1)。随着分子病毒学的深入研究，
人们对这类病毒的结构特性、感染及复制机制的了
解也更为详尽。利用反向遗传学 (reversed genetics)
及同源重组 (homologous recombination)等手段，在
疫苗株的基础上，改造病毒基因组，敲除特定毒力
基因，插入荧光蛋白等外源基因，获得低毒力、使
用安全、携带标示物的重组示踪工具病毒 [1]。这类
重组示踪工具病毒依然具有定向跨突触及复制能
脑科学研究专刊 第26卷636
力，适宜标记神经网络结构。
1.1　单纯疱疹病毒
目前用于神经网络示踪的 PRV和 HSV-1-129
都属于 α疱疹病毒科，是有囊膜的球形双链 DNA
病毒，直径约 200~250 nm，基因组约 150 kb，编
码约 70个基因，在细胞核中复制，生活史周期复杂，
其基因表达分早期、中期和晚期基因，分别控制病
毒的 DNA复制、结构蛋白组装、调控病毒蛋白的
入核、宿主细胞基因转录调控等过程，更详细的生
活史及基因功能信息参见 Pomeranz等 [1]的综述。
1.1.1　伪狂犬病毒(PRV)
伪狂犬病毒是猪伪狂犬病 (Aujeszky’s disease)
的首要致病因子，通常引起被感染的猪出现发热、
精神异常等症状，并会导致流产和仔猪的高死亡率，
是对养猪业威胁最大的流行病。PRV可以感染猪、
牛、绵羊、山羊、猫、狗，但不能感染人和灵长类
动物。由于其宿主范围广、使用安全，所以被广泛
用于多种模式动物的神经环路追踪 [1]。
野生 PRV的分离株 (Becker株 )毒性较大，在
神经环路中传播时，既可以沿神经信息传递的相同
方向 (顺向，从突触前到突触后 )传播，又可以沿
神经信息传递的相反方向 (逆向，从突触后到突触
前 )传播。而疫苗株 Bartha毒性较低，且只能特异
性逆向跨突触传播。通过分析基因组发现，PRV-
Bartha基因组中 gE、gI和 US9基因的突变使其获
得上述特性。PRV的膜蛋白 US9能帮助 PRV转运
到轴突末端，gI能促进 PRV在轴突末端的出胞活动，
而 gE是 PRV主要的毒力基因，同时也可影响病毒
在细胞间的扩散。Kobiler等 [2]基于 PRV-Bartha构
建了一些重组病毒，包括携带各类荧光蛋白、β-半
乳糖苷酶 (β-galactosidase)、脑虹原件 (Brainbow)等
的重组病毒。Boldogkoi等 [3]在 gE、gI基因敲除的
Kaplan株上，也构建了多种表达荧光蛋白及钙探针
的重组病毒，可以实现对神经网络活动的研究及结
构的分级解析等。
重组的 PRV已被广泛用于外周及中枢神经环
路研究。Kerman等 [4]将 PRV-152和 PRV-Bablue分
别注射到腓肠肌 (gastrocnemius muscle)和肾上腺
(adrenal gland)，在脑干和中脑多个区域发现被标记
了的来自腓肠肌及肾上腺的双标神经元，提示这些
神经元协调控制情绪和运动功能。PRV标记还提供
了一种半定量追踪手段。Luo等 [5]向大鼠腹侧被盖
区 (ventral tegmental area, VTA)注射 PRV，结合药
理损伤其外侧隔核 (lateral septum, LS)，通过比较
PRV标记的海马 CA3神经元数量，发现 CA3通过
LS调控 VTA神经元的环路结构，揭示了情景记忆
影响情感的环路基础。PRV还可用于研究外周神经
系统的突触可塑性。Seiler等 [6]通过在接受视网膜
移植的大鼠上丘中注射 PRV-Bartha，发现 PRV能
在移植器官和宿主之间形成的突触中传递。
2001年，DeFalco等 [7]最早实现了利用嗜神经
病毒选择性标记特异类型神经元的输入环路，此技
术基于 Cre-LoxP系统对已有的 PRV-BaBlue病毒株
进行改造，使得重组的 PRV只能在某种特定类型
神经元中启动复制，因而只标记这类神经元的输入
环路 (图 1)。具体方法为，首先敲除 PRV复制所必
需的内源性胸苷激酶 (thymidine kinase, TK)基因，
然后在其基因组中插入一段表达元件 CMVP-LoxP-
STOP-LoxP-egfp-IRES-tk，其中 LoxP-STOP-LoxP
(LSL)是一段可被 Cre重组酶切除的转录终止序列，
可阻止其后的 EGFP及 TK的表达。该病毒株被命
名为 Ba2001。当被 Cre重组酶剪切后，GFP开始
表达，同时 TK的表达使病毒具备复制及进一步逆
向跨突触标记神经元的能力，从而实现对特定类型
表1　神经环路研究常用病毒的特性比较
病毒名称 基因组及大小 基因数量 有无囊 复制能力 跨突触能力
膜糖蛋白 及方向
单纯疱疹病毒 双链DNA病毒，约152 kb > 70 有 细胞核及细胞质 顺向跨突触
(HSV-1-129株)
伪狂犬病毒 双链DNA病毒，约150 kb > 70 有 细胞核及细胞质 逆向跨突触
(Bartha株)
狂犬病毒 负链RNA病毒，11.9 kb 5 有 细胞质 逆向跨突触
水疱炎病毒 负链RNA病毒，11~12 kb 5 有 细胞质 顺向跨突触
腺相关病毒 单链DNA病毒，4.7 kb 5 无 不复制 不跨突触
逆转录病毒及慢病毒 单链RNA病毒，9.3 kb 9 有 不复制 不跨突触
张志建，等：利用嗜神经病毒跨突触追踪神经网络研究进展第6期 637
神经元多级输入通路的逆向追踪。神经肽 Y
(neuropeptide Y, NPY)是下丘脑神经元分泌的促进
饮食的多肽， DeFalco等 [7]将 Ba2001注射入一种
NPY-Cre小鼠的下丘脑中，发现杏仁核、皮层及下
丘脑、嗅球等多个区域中的神经元被跨突触标记，
提示大脑多个区域都参与调节小鼠进食行为。基于
相似的策略，Yoon等 [8]研究了小鼠分泌促黄体生
成激素释放激素 (luteinizing hormone-releasing hormone,
LHRH)神经元的调控通路，揭示了大脑中多个脑区
的神经元都参与调控生育行为。当重组 PRV携带
brainbow元件，经 Cre酶剪切后产生多色组合，可
通过颜色差异区分上游神经网络的信息 [2]。Card等
[9-10]利用 PRV-brainbow对负责多区域输出的特定神
经元上游输入网络进行了差异比较分析。
1.1.2　重组HSV-1-129病毒
HSV-1-129株是一个顺行标记神经环路的工具
病毒，其原始毒株是 20世纪 70年代从脑炎患者脑
组织中分离得到的 [11]。在经典神经环路研究中发现，
HSV-1-129具有严格顺向跨突触的特性，适合标记
多级神经输出环路的结构 [12]，这种未改造的原始株
可被直接用于中枢及外周感觉神经环路的研究 [13-15]。
在灵长类动物的大脑中，HSV-1-129也具有同样的
顺向跨突触特性，使其成为极具潜力的示踪工具。
2011年，Lo和 Anderson[16]利用类似于 Ba2001
的构建策略，对 HSV-1-129病毒株进行了改造。他
们采用同源重组的方法，获得了被 Cre重组酶控制
荧光表达及跨突触的重组病毒——H129DTK-TT。
在转基因动物的大脑中，利用 H129DTK-TT分别
特异性地从视觉、嗅觉感受神经元及小脑浦肯野神
经元出发，顺向跨多突触追踪全脑输入信息的神经
网络，除了获得相关系统经典的输入通路信息外，
还发现了大量从未报道过的接收相关神经通路信
息输入的脑区。Dimitrov等 [17]利用 H129DTK-TT
研究了 Vgatires-Cre/+转基因小鼠中央杏仁核 (central
amygdala, CAmy)及后外侧下丘脑 ( posterior lateral
hypothalamic area, PLH) GABA能神经元对蓝斑核
A：敲除部分膜蛋白的PRV-Bartha缺失了顺向跨突触的能力，从而能够特异性逆向跨突触。B：向缺失了TK基因的PRV-Bartha
中插入LSL序列、绿色荧光蛋白基因eGFP及TK基因，只有被Cre重组酶剪切之后，重组病毒中LSL之后的基因序列才能启动
表达，从而使PRV-Ba2001具备复制及逆向跨突触的能力。
图1　经过重组改造的PRV[7]
脑科学研究专刊 第26卷638
去甲肾上腺素能神经元的调控网络。其研究结果证
实，CAmy及 PLH中的 GABA能神经元的确对蓝
斑核有投射，并与其中去甲肾上腺素能神经元形成
突触连接，实现对去甲肾上腺素系统活性的抑制性
调节。
1.1.3　局限性
在利用上述病毒进行神经环路追踪研究时，需
要注意这类工具病毒使用的局限性。PRV和 HSV-
1-129这类病毒均可以在神经元中复制，但即使是
疫苗株，也具有细胞毒性，在感染后一定时间内，
神经元会出现病变、死亡，并引起大脑炎症反应，
甚至在感染晚期，实验动物会死亡。因此，当动物
感染病毒出现早期症状时，跨突触标记的结果更接
近神经通路的真实结构。首先，这取决于所注射病
毒的毒力、滴度、注射体积及注射位置等；其次，
PRV和 HSV-1-129在中枢神经系统注射时，注射点
附近的神经纤维、轴突末端均有病毒进入，因此，
在做跨突触追踪实验时，应尽可能缩小注射创伤，
防止病毒在中途泄露，结合其他示踪剂确定病毒的
初始扩散范围；同时，对标记结果的翻译需谨慎，
并通过其他手段加以验证。PRV和 HSV-1-129均被
广泛用于跨多突触追踪，结合 Cre-LoxP系统实现
特定细胞类型的追踪，但是对所获得的结构网络的
连接级数无法确定；同时，对强的间接连接网络与
弱的直接调控网络也无法确定，通过控制病毒感染
时间，或者使用定时变色荧光蛋白等，可以提供部
分信息，但在翻译结果时仍需谨慎，需结合其他手
段进行验证。Ba2001源于 PRV-Batha，其对啮齿动
物神经元有较高的感染效率，但不能感染灵长类动
物，因此，不能用于灵长类的神经元环路标记；
H129DTK-TT源于 HSV-1-129，对啮齿类动物及灵
长类动物的神经元均有感染性，可用于灵长类神经
元环路的标记，但同时也具有侵染人类神经系统的
风险，因此，在使用时必须保证实验操作环境的安
全性，确保实验人员的安全。此外，感染 HSV-1-
129后，动物的存活时间具有更大的可变性和不可
预知性，也不能像 Ba2001那样可以通过控制感染时
程来实现控制所标记到的神经环路的跨突触级数。
1.2　弹状病毒
目前用于神经网络示踪的 RV和 VSV都属于
弹状病毒科，得名于其子弹状粒子的电镜图像，直
径约 80 nm，长约 180 nm，是有囊膜的负链 RNA
病毒，基因组约 12 kb，编码 5个基因，依次为核
蛋白 nucleoprotein (N)、磷酸化蛋白 phosphoprotein
(P)、基质蛋白matrix protein (M)、糖蛋白 glycoprotein
(G)和聚合酶 polymerase (L)。弹状病毒 RNA复制
是由病毒自身编码的 RNA聚合酶 L及 P形成复合
体完成。这类病毒在感染时由膜蛋白与细胞膜上的
受体作用，完成吸附后侧向移动，招募穿膜所需网
格蛋白，介导内吞作用穿膜；内吞小泡成熟后，在
低 pH环境中与病毒膜再发生融合，使得病毒粒子
释放到细胞质中，病毒 RNA聚合酶负责基因组
RNA和 mRNA 、后续病毒蛋白合成等，病毒组装、
成熟均在细胞质完成，详细介绍见 [18-19]。
1.2.1　重组RV在神经环路追踪中的应用
RV是人畜共患的狂犬病的致病因子，可以感
染包括各类野生动物，如狐、獾、狼、猛、蝙蝠和
其他野生食肉动物 [20-21]；在城镇中，携带病毒的犬、
猫成为人和家畜发生狂犬病的主要传染来源，对人
和动物均具有致死性 [22]。野生型 RV具有逆向跨突
触传播的特性，可以用于灵长类及啮齿类动物神经
解剖学的研究 [23]。利用 RV做示踪工具病毒有独特
优势，除特异性跨突触传播外，RV感染中枢系统后，
主要标记神经元，几乎不标记胶质细胞；对没有突
触连接的神经纤维不感染，毒性低，被感染的神经
元几乎不发生明显病变及裂解 [24]。随着反向遗传学
手段的成熟，目前构建出的复制缺陷型 RV具有较
低的毒性和较高的安全性，在神经环路研究中具有
巨大的潜力 [22,25]。
Wickersham等 [26]基于 RV疫苗株 Sad B-19感
染性克隆构建的重组狂犬病毒，其 G蛋白基因被敲
除，并携带 GFP、mCherry等荧光蛋白基因，可使
外源蛋白在神经元中高丰度表达，从而清晰地标记
神经元的精细形态。他们将禽类肉瘤病毒 (avian
sarcoma-leukosis virus, ASLV)囊膜糖蛋白 (EnvA)的
膜外区与 RV囊膜糖蛋白跨膜及胞内区融合，形成
重组的囊膜蛋白。因为 EnvA识别的受体蛋白 TVA
只分布在禽类细胞表面，利用重组囊膜蛋白包装
RV，产生的病毒粒子不能直接感染哺乳动物，若利
用 AAV、慢病毒、逆转录病毒等将 TVA表达在哺
乳动物的细胞膜上，则这种 RV可特异性识别并感
染表达了 TVA的神经元。由于这种 RV的 G蛋白
(RV-G)基因缺失，进入神经元后，可复制并表达外
源基因，但不能包装产生成熟的病毒粒子来感染上
一级神经元。如果同时在这类神经元中外源性补充
RV-G，即可在该类神经元中产生成熟的假病毒粒子，
可以用来跨突触感染上一级神经元。进入上一级神
经元后，RV-G缺失的病毒可以复制并表达外源基
张志建，等：利用嗜神经病毒跨突触追踪神经网络研究进展第6期 639
因，但不能继续跨突触感染。此过程使 RV可控地
逆向跨单级突触标记特异类型神经元的输入网络得
以实现 (图 2)[27]。
RV的细胞毒性及免疫原性较低，感染神经元
后一般有 5~12 d的窗口期，在此窗口期内外源基因
可被高效表达，而神经元的形态及功能不会受到明
显影响。超过此窗口期，被感染的神经元开始凋亡
或坏死，但动物个体的存活不受明显影响 [28]。目前，
利用反向遗传学技术，实现向 RV病毒基因组中装
载各种报告基因或功能基因，如荧光蛋白基因、钙
离子探针 (Gcamp)、谷氨酸探针 (iGluSnFR)、电压
敏感荧光蛋白 (VSFP、Arch)以及光敏感离子通道
蛋白 (ChR2)等。基于狂犬病毒跨单突触系统并进
行相应改造，可实现对特定神经环路进行标记的同
时检测或操控相应环路的功能。
1.2.2　重组VSV在神经环路追踪中的应用
VSV是水泡性口炎的重要致病因子，能感染
多种动物和昆虫。病毒主要感染皮肤系统，在深层
的皮肤棘细胞层更活跃，引起细胞溶解，有渗出液
形成水泡，最终被机体清除。基于这类病毒对人及
动物的低危害性，已经被广泛用于疫苗和基因载体
的开发 [19,29]。VSV作为嗜神经工具病毒，感染神经
元后，在极短时间内高丰度地表达目的蛋白。感染
细胞后，其第一批子代病毒最快只需 1.5 h即可被
释放出来。van den Pol等 [30]通过构建囊膜糖蛋白
缺失且携带 GFP报告基因的 dG-VSV，在病毒感染
细胞 1 h之后即可检测到报告基因的表达。
Beier等 [31]测试了 VSV对啮齿类大脑的感染
特性，发现其具有顺行跨突触能力，同时也具有神
经元感染的高度特异性，可被其他病毒的囊膜糖蛋
白包装而获得不同方向的跨突触能力。他们发现
VSV利用其本身的囊膜糖蛋白 (VSV-G)包装可顺
向跨突触感染神经环路；同时，用 RV的囊膜糖蛋
白 RV-G替换 VSV的囊膜糖蛋白 VSV-G之后，病
毒可获得逆向跨突触感染神经环路的特性。2013年，
Beier等 [32]又对 VSV进行了一系列的改造工作，
利用类似 RV跨单突触系统的设计方法，实现了基
于 VSV对特定神经网络进行跨单级和跨多级的顺
A：狂犬病毒的基因组成及重组改造。利用荧光蛋白等报告基因或其他功能基因替换狂犬病毒的G蛋白基因；B：将TVA、
G及GFP同时导入同一个起始神经元中，再用EnvA包装的携带红色荧光蛋白mCherry基因的EnvA-RV-mCherry感染起始神经
元，在起始神经元中组装成成熟的病毒粒子，感染上一级神经元。在上一级神经元中，只能进行RNA复制并表达外源蛋白，
但不能产生成熟的病毒粒子继续跨突触感染[27]。
图2　RV逆向标记单突触神经环路的示意图
脑科学研究专刊 第26卷640
向和逆向标记。
1.3　不跨突触的病毒系统
神经科学研究常用的腺相关病毒 (adeno-
associated virus, AAV)、逆转录病毒 (retrovirus)和慢
病毒 (Lentivirus)等属于不能复制的工具病毒，这类
病毒只具有病毒粒子形态，能够完成感染及介导外
源基因表达，但不具备复制能力及跨突触能力，一
般被用作表达外源基因的载体。
1.3.1　腺相关病毒
AAV是无囊膜的单链 DNA病毒，其基因组大
小约为 4.7 kb。已有研究综述对 AAV的分子特性做
了详细的介绍 [33]，此处仅对 AAV在神经环路标记
中的特性进行简要介绍。AAV转导神经系统引起的
免疫原性及毒副反应低，基因表达持久，在神经环
路标记及功能研究中的应用相当广泛 [34]。
AAV因衣壳蛋白血清型及相应的受体不同，
对神经元有不同的感染特性。神经科学研究中常用
的 AAV根据血清型可分为 2、5、8、9、DJ、1/2
型等，这些 AAV都有高效转导神经元的能力，其
中 8、9型具有比 2、5型更强的扩散范围 [35]；1/2
杂合型具有部分逆向转导特性；5型 AAV具有最强
的线性 DNA组装容量 [36]。AAV转导神经元需要宿
主细胞合成其基因的互补链，需要较多病毒粒子及
较长时间实现基因的高表达，而 scAAV包装互补
DNA, 介导更快更强的表达，但 DNA组装容量减
半 [37]。此外，AAV常用广谱启动子来实现外源基
因的高效表达，其中 CAG、EF1α等启动子的表达
活性较高；而基于其他特定启动子也能实现部分细
胞类型特异性转导，如利用 CamKII启动子可实现
对兴奋性神经元的转导等；同时，AAV利用 Cre-
LoxP可在转基因小鼠中实现细胞类型特异性的表
达，且应用较为广泛 [34]。
1.3.2　逆转录病毒及慢病毒
逆转录病毒可通过自身携带的逆转录酶将外源
基因逆转录为 cDNA，并整合到宿主细胞的染色体
中，长期稳定地表达 [38]。常用的逆转录病毒载体利
用鼠白血病病毒 (moloney murine leukemia virus,
MMLV)改造而来，只在可分裂的细胞中完成整合，
能介导外源基因在可分裂的神经干细胞中表达，多
被用于研究神经元的发育；而基于 HIV改造而来的
慢病毒，对分裂及非分裂细胞均有较高的转导效率，
故常用于研究经典神经元的功能 [39]。
逆转录病毒与慢病毒均可利用特异性启动子实
现在特定细胞类型中表达外源基因 [39]；也有报道用
DIO原件及 Cre-LoxP特异性识别剪切实现其选择
性标记 [40]。另外，利用不同来源的病毒囊膜糖蛋白
包装慢病毒，也可使慢病毒载体具有不同的细胞感
染特性，如用 VSV-G包装的慢病毒具有从胞体侵
染神经元，顺向标记神经元轴突投射的特性，而利
用 RV-G包装的慢病毒具有从轴突感染神经元，逆
向标记神经元胞体分布的特性 [41]。
1.4　其他可能用于神经环路标记的嗜神经病毒
理论上来讲，只要病毒能感染神经系统，就具
备开发为工具病毒的潜力，如乙型脑炎病毒、猴巨
细胞病毒、带状疱疹病毒和畸翅病毒等，这些病毒
可以感染人、非人灵长类、非灵长类动物、啮齿类、
鱼类、昆虫 [42]等。通过分子生物学技术和病毒反
向遗传学手段，控制其毒力、复制属性、携带外源
基因，可能获得一些新的重组嗜神经病毒。同时，
对这些新型病毒在神经系统的感染特性进行评估，
如在细胞水平 (体外 )和动物整体水平 (体内 )明
确该病毒感染神经细胞的特性 (进入位点、出芽位
点等 )、传播方向、毒力大小等，最终可以获得具
有新属性的嗜神经示踪工具病毒，扩展现有嗜神经
工具病毒库，从更多角度去解析神经网络的信息。
2　利用嗜神经病毒解析神经网络的问题及方法
神经网络的结构复杂，需要组合利用多种病毒
及模型资源，建立适合的跨突触标记策略。每种嗜
神经病毒都有其跨突触标记特性和局限性，在用于
标记各类神经网络结构时，需要根据其连接方式、
连接级数、细胞组成类型等信息，对神经网络进行
分割，得到神经网络的基本组成单元特性。在此基
础上，综合利用多种病毒及转基因小鼠的特性，建
立最合理的标记策略。基于现有的嗜神经工具病毒
库，可以实现如下一些标记策略。
2.1　单一嗜神经病毒可抽提如下信息
2.1.1　特定区域的单级输入或输出网络
向实验动物特定脑区注射可表达 TVA、RV-G
及荧光蛋白的辅助病毒，两周之后向同一区域注射
EnvA包装的 RV (RV-G基因缺失，带有另一种荧光
蛋白标签 )，RV病毒感染一周之后可标记到该注射
区域的单级输入神经网络。若补偿 VSV-G且利用
EnvA包装的 VSV (VSV-G 缺失 )，则实现标记该注
射区域的单级输出神经网络。
2.1.2　特定区域的多级输入网络
向实验动物特定脑区注射 PRV或者 RV等，感
染数天之后，通过控制不同的感染时程，可标记该
张志建，等：利用嗜神经病毒跨突触追踪神经网络研究进展第6期 641
注射区域不同级数的输入神经网络。
2.1.3　特定区域的多级输出网络
通过向实验动物特定脑区注射 HSV-1-129或
VSV，病毒感染数天之后，通过控制不同的感染时
程，可标记该注射区域不同级数的输出神经网络。
2.1.4　特定区域特定类型神经元的单级输入或输出
网络
首先，需要获得在特定类型神经元中表达 Cre
酶的转基因动物品系；然后，向该动物目标脑区中
注射 AAV，此 AAV 可在 Cre 酶的剪切下表达
TVA、RV-G及某种荧光蛋白；两周之后在同一位
点注射 EnvA包装的 RV-G基因缺失的 RV (表达另
一荧光蛋白 )，EnvA-RV感染一周后，可标记该注
射区域特定类型神经元的单级输入网络。同理可得
到单级输出网络。
2.1.5　特定区域特定类型神经元的多级输入网络
首先需要获得在特定类型神经元中表达 Cre重
组酶的转基因动物品系，向目标区域注射 PRV-
Ba2001等 Cre驱动表达及复制的重组 PRV，通过
控制不同的感染时程，可标记该区域特定类型神经
元不同级数的输入网络。
2.1.6　特定区域特定类型神经元的多级输出网络
向在特定类型神经元中表达 Cre酶的转基因品
系动物的目标脑区中注射 H129∆TK-TT等 Cre驱动
表达及复制的重组 HSV-1-129，通过控制不同的感
染时程，可标记该区域特定类型神经元不同级数的
输出网络。
2.2　两种嗜神经病毒组合可抽提如下信息
2.2.1　特定脑区同一神经元对多个区域的协同控制
通过向实验动物两个不同的脑区中分别注射不
同颜色的 PRV，感染数天后，检测荧光蛋白在特定
脑区中的表达分布。若目标区域有被双色荧光共标
记的神经元，则说明该神经元参与对这两个脑区的
协同调控。例如，本实验室在 C57/BL小鼠两侧嗅
球分别注射 PRV152 (GFP)及 PRV614 (RFP)，可以
在嗅觉相关脑区观察到被两种颜色病毒共同标记的
神经元，说明这些神经元参与调控两侧嗅球的信息
处理 (图 3，未发表 )。
用双色RV追踪嗅球和前梨状皮层的调控环路，
结果发现前嗅核、下丘脑、杏仁核皮层区、腹侧海
马及内嗅皮层等都有神经元同时被红色和绿色荧光
蛋白标记 [43]，提示这些神经元同时参与调控嗅球和
前梨状皮层的功能 (图 4，未发表 )。
2.2.2　特定脑区接受多个区域的协同调控模式
通过向实验动物两个脑区分别注射伪狂犬病毒
PRV267 (表达Cre酶，A神经元 )和PRV263 (Brainbow，
B神经元 )，病毒感染数天之后，被两种 PRV跨突
触共同感染的神经元会表现出多种荧光的融合色 (C
神经元 )，这些 C神经元是协同调控脑区 A和 B神
经活动的神经元。PRV263 (Brainbow)在这些 C神
经元被剪切后，进一步逆行跨突触标记更上游的神
经元 (D、E神经元 )。由于 PRV病毒基因组复制具
A、B：蓝斑核同一区域分别被红色和绿色荧光蛋白标记；C：经过放大的蓝斑核共标记神经元。标尺为200 μm。
图3　C57小鼠两侧嗅球分别注射PRV152及PRV614，在蓝斑核观察到共标记的神经元
脑科学研究专刊 第26卷642
有竞争特性，在这些更上游的 D和 E神经元中，早
期跨突触感染的 PRV具有复制优势，从而以不同
的单色标记 D和 E神经元，从而提示 D和 E可通
过不同的通路控制 C神经元，协同调控 A和 B神
经元的活动 [9]。
2.3　利用嗜神经病毒追踪神经网络的基本思路与步骤
通过跨突触标记，可以获得特定神经网络结构
的基本信息，在此基础上，可结合多种技术手段，
如免疫组化、全脑光学成像及重建 (MOST)[44]光遗
传学、电生理、行为学、磁共振成像、微透析等技术，
从多层次、多角度揭示特定神经网络的功能信息
(图 5)。
3　总结
揭示大脑神经网络结构是理解大脑功能的前提
和基础。利用嗜神经病毒跨突触标记策略，是目前
揭示神经网络结构的最有效的手段之一；但是目前
常用的嗜神经病毒会导致神经元的病变，部分病毒
甚至可导致被感染实验动物死亡，也对环境和实验
人员带来潜在危险。根据世界通用生物安全标准分
类，上述嗜神经病毒都属于二级生物安全实验室病
毒 (biosafety level II, BSL2)，为了保证实验人员安
全及防止病毒对外界环境造成生物污染，涉及病毒
制备、注射、带毒动物饲养、灌流及活体成像等实
验均需要在二级生物安全实验室中进行。
现有的嗜神经工具病毒仍然有其局限性，有许
多重要问题需要进一步回答。例如，其跨突触机制
并不清楚，病毒跨突触的过程及其对各类型突触结
构的选择性；神经活动是否影响嗜神经病毒跨突触
标记的网络；如何通过神经活动控制嗜神经病毒跨
突触的特异性；跨多突触标记的神经网络如何区分
连接级数；能否在标记神经网络神经元结构的同时，
标记上下游神经元连接的突触；嗜神经病毒能否进
一步用于神经网络活动的检测及控制嗜神经病毒跨
突触标记策略；如何评价各类精神疾病动物模型等。
要充分发挥嗜神经病毒在研究神经网络结构中
将携带红色及绿色荧光蛋白基因的RV (RV-G包装)分别注射到大鼠的前梨状皮层及嗅球，病毒感染一周后在其前嗅核(图A)、
杏仁核皮层区(图B)、腹侧海马(图C)及下丘脑(图D)都观察到被红绿色荧光蛋白共标的神经元，说明这些神经元可协调控制嗅
球和前梨状皮层的活动。
图4　嗅觉调控神经元的共标记
张志建，等：利用嗜神经病毒跨突触追踪神经网络研究进展第6期 643
的优势，首先需要对现有系列嗜神经工具病毒及辅
助病毒进行完善，包括将各种分子探针、功能蛋白
及基因操作手段整合到神经工具病毒系统中，只有
充分了解各种嗜神经工具病毒的性质，认识其各自
的优势及局限性，并整合现有的资源，针对不同的
科学问题选择合适的嗜神经工具病毒，才能满足当
前神经科学研究的各类需求。同时，需要针对上述
重要问题，建立适合的研究模型，适于观测病毒粒
子的神经元培养模型与观测系统，嗜神经病毒感染
相关的蛋白质组学，病毒重组改造，对嗜神经病毒
感染、传播及跨突触机制展开研究，进一步改造和
控制这类嗜神经病毒的感染特性，获得毒性更低，
感染、传播、跨突触机制明确的新型嗜神经病毒。
利用这些新型的嗜神经病毒，将获得意义更为明确，
信息更充分可信的神经环路结构，为脑科学研究提
供更好的支撑作用。
[参　考　文　献]
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