全 文 ：第27卷 第6期
2015年6月
Vol. 27, No. 6
Jun., 2015
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2015)06-0755-06
DOI: 10.13376/j.cbls/2015104
译文简介 : F. Sanger于 1955年完成胰岛素全部氨基酸序列
分析，1958年获诺贝尔化学奖，又于 1978年发表双脱氧 DNA 序
列测定法，1980年再次获诺贝尔化学奖。 本译文节译自 Sanger的
回忆录 (Sanger F. Sequences, sequences and sequences. Ann Rev
Biochem, 1988, 57:1-28) 中测定胰岛素序列的一部分内容。
F. Sanger于 1943年获得博士学位 (25岁 )后就到剑桥大学
A.C. Chibnall教授领导的生物化学实验室工作。Chibnall 的研究
课题就是分析胰岛素的氨基酸组成及其化学结构。一开始，
Chibnall 就建议 Sanger测定胰岛素的自由氨基 (实际上就是 N-
末端氨基酸 )。此后，Sanger就一直从事胰岛素氨基酸的序列分析，
直到完成这个蛋白质的全部氨基酸序列的测定和其中三对二硫键
的定位。Sanger 非常感激 Chibnall引导他一开始工作就着手研究
胰岛素。他认为没有 Chibnall的建议，他可能会继续从事他的博
士论文——赖氨酸代谢方面的研究。他研究胰岛素 N-端氨基酸
的课题实际上是 Chibnall给他提出的，发表文章时 Chibnall让
Sanger单独署名，而 Sanger认为文章上 Chibnall应该署名。这
样的例子国内少见。
在研究胰岛素氨基酸序列中， a-氨基的显色标记是重要的
一步。Sanger在这个问题上花费了很多时间。另外，肽段的分离
也是非常关键的一步。 肽段分离不好就无法测定氨基酸序列。
在 20世纪 40年代中期Martin 和 Sygne就成功地发展了纸层析
和柱层析技术。这一点 Sanger感到非常幸运。用这些方法解决
了小肽和大肽的分离，也完成了测定肽段中的氨基酸序列。
测定胰岛素两条肽链的序列，Sanger的合作者主要是两个人，
即奥地利人 Tuppy和澳大利亚人 Thompson。Sanger对他们两个
都很满意。到 1953年胰岛素 A、B 链的氨基酸序列测定就靠他
们两个人基本上完成了。后来另有三位合作者与 Sanger 一起又
花费了两年时间解决了难度较大的二硫键定位问题。从 1943年
算起到 1955年测定出胰岛素全部氨基酸序列历时 12年，工作人
员先后只有 6人， 发表与此项工作直接有关的文章仅 11篇。
Sanger等开展的这项工作主要是在地下室中完成的。与他的
实验室为邻的是饲养大鼠的动物房。可想而知，地下走廊中散发
出难以忍受的臭味。但是，Sanger觉得在这间实验室度过的时间
是他最愉快的年华。他与同事们合作得很好，关系融洽。这时他
们完成了一项有重大科学意义的工作。Sanger也遇到过不高兴的
事。 他与生化界一位大人物有点分岐。欲知详情如何，且看译文
分解。
胰岛素结构的序列分析(节译)
F. 桑格(Frederick Sanger)
中国科学院生物化学与细胞生物学研究所　刘望夷 译
F. 桑格 (F. Sanger) (1918—2013)
英国科学家，曾于 1958年和 1980年
两次获 Nobel化学奖。
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1943年，我拿到博士学位时，Neuberger已经
离开实验室。 接着我得到机会到 A.C. Chibnall教
授实验室工作。他的研究组得到医学研究委员会
(Medical Research Council，MRC)基金的资助。 当
时，Chibnall刚继任 Hopkins的席位，被任命为生
物化学教授。 他和他的几位同事正忙于从伦敦皇家
学院搬到剑桥。那时他们的主要研究兴趣是分析蛋
白质，特别是胰岛素的氨基酸组成。他选择胰岛素
作研究材料是因为它的医学重要性，而且在当时是
少数几种能够买到的纯化的蛋白质。选择它似乎未
必是因为它的分子量小 (Mr 6 000)，因为当时并不
知道它这样小。当然，分子量小对我们今后的工作
是非常幸运的。在当时，氨基酸分析是一件艰难辛
苦的工作。 很多例子说明要得到准确的结果是困难
的。Chibnall组的氨基酸分析大概在当时是发表出
的最好结果。
当时，Bergmann和 Nieman的理论特别流行。
他们认为，蛋白质中特定的氨基酸残基沿多肽链有
规律地相间排列着， 而且每种氨基酸的含量有规则
地按公式：2m x 3n 的方式表现出来。 这种理论的一
个有益效果就是引起了人们对分析氨基酸的兴趣。
人们试图按照这个公式表述他们的实验结果，由于
缺少精确的实验方法，很少数据能够适用于这个公
式。 这是完全可以理解的，因为实际上不存在这种
规律。 Chibnall实验室的足够精确的实验结果使得
他们成为怀疑这个公式的第一个研究组。
这里的工作氛围对我是有益的。我开始的实验
就是这个研究组工作的合理继续。事实上就是
Chibnall建议我做胰岛素工作的。如果没有他的建
议，我可能还会继续我的赖氨酸代谢研究。Chibnall
等发现，胰岛素的自由氨基数目比计算出来的赖氨
酸含量还要多。 他们就认为多余的自由氨基是由于
出现了 a-氨基基团。这说明肽链比较短，因此，
特别适于化学研究。Chibnall建议，要我探索定量
测定并鉴定这些多出的自由 a-氨基究竟在哪些氨
基酸上。这就是我做胰岛素工作如何开始的。事实
上，胰岛素的工作可能开始得更早些。此前，
Neuberger曾经开始做过一些初步的胰岛素末端分
析工作。这大概是他的兴趣和经验传授给我了吧。
毫无疑问，当时和以后相当一段时间，我就开始并
一直在做胰岛素全序列的测定工作。仅在最后阶段
做某些实验，如定位二硫键和一个酰胺基团时，我
才真正感到有了压力。
根据我和别人过去写的综述文章记载，我那时
发展了一种使用二硝基氟苯 (FDNB)的化学试剂测
定蛋白质的末端基团 [1]。虽然这是事实，后来查看
了我的旧笔记本，我发现事情并非那么简单。当时
已经有几种标记自由氨基的方法，其中仅有一种方
法是鉴定 N-末端氨基酸的。早在 1935年，Jensen
和 Evans就用苯异腈酸酯 (phenylisocyanate)检测出
胰岛素的 N-末端是苯丙氨酸。 他们使用的这种试
剂比 Edamn试剂，苯异硫腈酸酯 (phenylisothio-
cyanate) 的活泼性在某种程度上要差一些。 我认为，
在任何蛋白质中，苯丙氨酸可能都是第一个被捡测
出的末端氨基酸。 而我们需要的一种能普遍使用的
试剂应该可以在温和条件下与氨基反应形成的衍生
物对酸水解是稳定的。 而且，使用比较简单的方法
能很容易分离和鉴定这种氨基酸衍生物也是很重要
的。 为了达到这个目的，我们很不安地使用了一种
新发现的分配层析 (Partition Chromatography)法。这
种方法比以前使用过的任何方法都好。G.R.Tristram
组己经用这种层析法很好地分离了乙酰氨基酸。
除了异腈酸酯外，可以使用的试剂还有磺酰氯
(sulfonyl chloride)及其衍生物苯磺酰氯 (benzene
sulfonyl chloride)。后者使用较多，市场上可以买到。
但其产物的溶解度似乎不那么理想。我试着使用的
第一种这类试剂是甲基磺酰氯 (methane sulfonyl
chloride)。选择它的主要原因是我希望甲基磺酰氨
基酸的层析行为与乙酰氨基酸衍生物相似。前面提
过已经有人很好地做过对后者的层析分离。但是，
我却没有得到任何清晰的结果。接着我们转向苯的
衍生物，即 2,4-二硝基氯苯 (2,4 dinitrochloroben-
zene)。Abderhalden和 Stix于 1923年曾经研究过这
种衍生物。但是，它仅在高温条件下才能发生反应。
在这种条件下，多肽键会有某种程度的水解。我用
这种试剂做出了一些二硝基苯 ( DNP) 氨基酸，发
现这种氨基酸衍生物在硅胶分配层析柱上分离得很
好。 一个很大的优点是这些 DNP-氨基酸衍生物呈
现黄色。那时，所说的层析 (Chromatography)真的
成了“有色”层析 (“Chroma”tography)了。不需
要可靠的部分收集器就可以直接在层析柱上看到黄
色条带。很明显，氯化物不够活泼。相对来说，氟
化物或者硝基化合物的活性是比较理想的。我也曾
做了 1,2,4-三硝基苯 (1,2,4 trinitrobenzene)。后来
Chibnall对我说，在附近化学实验室工作的 B.C.
Saunders博士非常友好地愿意提供给我一些氟化合
桑格：胰岛素结构的序列分析(节译)第6期 757
物。在冷的条件下，这些试剂与氨基酸的反应是令
人非常满意的。于是，我们就有一个很好的提供二
硝基氟苯 (2,4-dinitrofluorobenzene，FDNB)的地方
了，以后的工作中经常使用它。可是，我的第一个
实验结果是非常扫兴的。我试着用 FDNB与甘氨酸
反应，把产物上柱分离时，不幸的是产物不是预期
的一个黄色条带——DNP-甘氨基酸，而是两个产
量差不多的清晰条带。 第二个条带似乎就是含有两
个二硝基苯基团的甘氨酸 (diNDP-glycine)。 就是说
一个 a-N原子上有两个 DNP基团。我克服了相当
多的困难，总算解决了这个问题。事实上，甘氨酸
是个特例，其他氨基酸并没有太多的第二种产物。
把磷酸缓冲液换成碳酸缓冲液就完全消除了这个副
产品。
我用这个方法分析胰岛素的 N末端氨基酸，
得到了DNP-苯丙氨酸和DNP-甘氨酸 [1]。这样看来，
如果每个胰岛素分子量是Mr 6 000，应仅有一个 N
末端氨基酸衍生物。而那时我们认为胰岛素的分子
量是Mr 12 000。这就意味着胰岛素中有两类多肽
链。它们通过胱氨酸的二硫键连接在一起。用过甲
酸能够破坏这种二硫键，从而有可能将相应的两条
肽链分离开来 [2-3]。
就在这时 (1947年 )我有机会到瑞典的乌普萨
拉 (Uppsala)访问 A. Tiselius实验室。Tiselius是蛋
白质研究领域享有盛名的一位科学家。因为他发明
了分析电泳仪。这种仪器与他的名字连在一起，得
到了广泛应用。我前面指出，能用氧化方法破坏连
接两条链的二硫键，并试图找到一种方法将肽链分
开。当时真没有好的方法能分开这样大小的肽链。
Tiselius的同事们正在使用一种将蛋白质吸附在活
性碳柱上的层析系统。 看来这种方法似乎有点希望。
有人建议我到乌普萨拉花点时间使用这种方法试试
看结果如何。 对我来说，这似乎是一个激动人心机
不可失的好机会。 特别是战后的英国有点不景气，
百业待举。比较来说瑞典似乎是个世外桃源。
但是，后来我对活性碳柱层析的实验不是很满
意。检测层析柱底部出现的条带是一种根据折射系
数老的成熟方法。这个实验室的习惯一般是请有熟
练技术的助手进行实际操作的。一位女技术员在观
察层析柱的技术方面得心应手。我就请她帮我观察
柱上的条带。她连续做了几次实验。有一次她观察
到 4个条带。对此，我非常激动。因为有一个时期，
我们认为胰岛素的分子量是 12 000，有 4个肽链。
我将这个结果告诉了 Tiselius。他立即建议以他和
我的名义给Nature 杂志送去一封信 (文章 )，其中
包括我在剑桥已经做出的初步胰岛素氧化工作。我
当时感到颇为震惊，因为他对此项工作没有做过任
何贡献，我从来没有看到他在实验室里工作过。我
巧妙地设法说服他，我还没有准备好发表胰岛素的
氧化工作。作为他的客人，而且是一个职位很低的
工作者，我没有生硬地顶撞他，只同意发表一篇我
们约定的研究结果 [4]。幸运的是，发表的这篇是我
的一篇不怎么出名的文章。这真是一篇令我感到羞
耻的文章。(译注：因为后来证明，这篇文章的内
容是错误的 )
Tiselius确实是一位很友善、有魅力的人。我
当然感谢他过去和后来给我的许多支持。但是，通
过这件事使我认识到与Chibnall合作是多么的幸运。
他允许以我一个人的名义发表胰岛素 N-端氨基酸
的文章，而正是他启动了这项工作。他有理由把他
的名字写在上面。
访问瑞典还有一个收获是认识了 R.L.M. (Dick)
Synge (1952年诺贝尔化学奖得主 ) 。当时他在那里
工作，并且向我介绍了淀粉区带电泳。这种方法是
以后更加成功地做纸电泳或凝胶电泳的先驱。
完全酸水解胰岛素，再用 DNP标记，可以得
到各种 DNP-氨基酸。如果酸水解条件降到部分水
解胰岛素，可以得到一些 DNP-肽。研究胰岛素的
DNP-肽，我能够鉴定靠近 N端 4~5个氨基酸短的
序列 [5]。实际上，从胰岛素中只能得到两种 N端
DNP-氨基酸序列。老实说我当时就觉得胰岛素中
肯定有两条多肽链。更重要的是，这可能说明使用
酸部分水解法可以测定任何蛋白质的特定序列。这
些结果排除了怀疑蛋白质是单一结抅的化合物，仅
用有机化学方法就可以解决蛋白质结抅问题。后来
不论是研究蛋白质还是核酸，在大多数工作中，部
分水解是测序工作的一种普遍使用的方法。仅在近
晚期的 DNA测序工作中不使用这种方法。
我的胰岛素 N端氨基酸的第一篇文章曾广泛
被别人引用 [1]，而我本人对我的多肽文章更加激动
[5]。回想起来，我感到这篇多肽文章确实具有更加
伟大的意义。这是第一次阐明蛋白质分子中排列着
各种不同的氨基酸序列。由此，我们可以明确得出
结论：蛋白质不是简单的单一化合物。这篇多肽文
章是我自己的首创，而第一篇文章则更多地依赖于
Chibnall的鼓励。
生命科学 第27卷758
除了我的两位老师：Neuberger和 Chibnall，我
的第一位合作者是 Rodney Porter。虽然他的年龄比
我大点，他可是我的正式入室弟子 (博士研究生 )。
这是因为战争年代他在军队服役，而我一直在实验
室工作。Rodney不是那种容易驾驭的人，但他是
一位很好的合作者。我觉得，我从他那里学到的东
西比他从我这里学到的更多一些。他教我的主要是
对待研究工作要持乐观态度。 他这样开诚布公、心
表如一、推心置腹，大家都感到愉快。 他来我这里
时，我们已经开展了 DNP 的方法，正在把它扩大
到多肽和其他蛋白质研究上。Rodney曾对 γ-球蛋
白 (γ-globulin)发生兴趣，正想研究它的末端基团。
我劝告他说，这种蛋白质是一种复杂的混合物，不
值得探索它的末端结构。但是，我没能阻止他。 后
来，大家都感到很惊奇，他却得到了有见识的简单
结果。他对事业表现出 “运用之妙，存乎一心”，从
那时起，他就与 γ-球蛋白结下了不解之缘，对科学
作出了有价值的贡献。
这期间我们暂时栖身在地下室一间实验室里。
因为靠近饲养实验大鼠的动物房，尽管我们处于这
种气味不愉快的环境里，但这可能是我工作过的最
高兴的一个实验室。我们与 Kenneth Bailey和他的
博士研究生 S.V.(Sam) Perry合用这间实验室。Sam
在军队中服过役，还在利物浦大学 Porter那里呆过。
于是，Bailey和我这两个有后备席位并且严谨的科
学家与两个刚从军队转业下来的野孩子泡在一起。
我们当然知道， 他们经常会高声歌唱。Sam偏爱唱
的歌曲“巨大的山峰”是模仿 Paul Roberson的腔调。
而 Rodney则喜欢唱“无人知晓我见过的麻烦”。这
是一种乐不可支的和谐氛围，同时我们也完成了许
多工作。不料祸从天降，一个烧瓶突然在 Rodney
眼前爆炸并损伤了他的角膜。虽然没有完全失明，
可惜他那只眼睛再没有很好的视力了
虽然在以前工作的基础上 DNP方法有些改进，
而且重要的工作都是用它完成的，DNP方法仍有不
少缺点。最严重不足之处是在酸性条件下，DNP-
氨基酸不很稳定，还必须使用校正系数。不同的氨
基酸有不同的校正系数。 有些氨基酸 (比如甘氨酸 )
的系数是相当大的。事实上，在测定血红蛋白的末
端氨基酸中这个问题就产生很大的误差。因此，我
仍然对发展新方法很感兴趣。磺酰胺 (sulfonamide，
SO2NH)键比 DNP 更加稳定，所以使用磺酰氯可能
是一种改进。我也曾不安地试图探索颜色较深的试
剂来提高灵敏度。 我花了不少时间在一种试剂上，
就是二甲氨基叠氮苯磺酰氯 (dimethylamino pheny-
lazobenzene sulfonyl chloride) 或 称 甲 基 橙 酰 氯
(helianthy chloride)。甲基橙 -氨基酸在层析图谱上
呈现很鲜艳的深红色带。这种甲基橙 -氨基酸对酸
似乎很稳定。但是，当我们把这种试剂用于蛋白
质时，并没有得到很好的结果。这大概是因为叠
氮化合物产生某种没有预料的副反应。还有一个不
满意的理由，与我们同实验室的同事的生物制品都
变成了很光亮的红色。最后我们放弃了这种试剂。
后来，Hartley和 Gray使用其他的磺酰氯却获得成
功。他们的试剂是二甲氨基萘磺酰氯 (dimethylamino
naphthalene sulfonyl chloride , i.e. dansyl chloride)。
Dansyl-氨基酸的稳定性非常令人满意。强荧光标
记的氨基酸很容易检测，并且大大提高了灵敏度。
DNP法建立之后，使用相当广泛。但是，后
来完全被其他新方法特别是 Edman方法取而代之。
这种新方法的优点是，它不仅可以测定 N-末端氨
基酸，而且可以扩大到逐步降解来测定多肽链的序
列。有兴趣的是，Edman与 DNP两种方法的建立
和发展几乎是同时进行的，但是早期很少使用前者。
其主要原因大概是 DNP氨基酸可见的黄色容易观
察和操作，而且那时可靠的部分收集器和微量测定
方法尚不够过关。
从测定蛋白质全部序列的角度考虑，DNP法
是很有限的。因为这种方法仅能分析 N-末端少数
几个氨基酸序列。要测定蛋白质的全部序列必须先
部分水解蛋白顶。这里的主要技术问题是分离开水
解产生的复杂多肽混合物。 在全部序列分析工作中，
分离多肽链是一件关键性的工作。序列测定的进展
的确依赖于多肽链分离方法的进展。在测定胰岛素
序列工作中，我们再次感到非常幸运。因为Martin
和他的同事们正在建立纸层析方法，并且已经用于
测定了一个五肽——短杆菌肽 -S (gramicidins-S)的
序列。这种分离小肽的方法远远优于以前任何成功
分离其他化合物的方法。这似乎出现了奇迹，当时
很难对付的多肽产物却在一张简单的滤纸上彼此分
离得非常清晰。使用这个方法，我们能够从酸水解
产物中分离出小肽，从中可以经过片段重叠法而推
断出较大的肽 [6-7]的序列。然而单独使用酸水解法，
我们还不能测出胰岛素的全序列，因为我们必须得
到更长的多肽。因此，我们需要一种更加特殊的水
解方法。很明显，这就是蛋白水解酶。这个时候，
桑格：胰岛素结构的序列分析(节译)第6期 759
我们使用蛋白酶水解法感到很犹豫。因为一般认为，
蛋白水解酶可以水解肽键，同肘也可以合成肽键。
这样的话，蛋白质中的氨基酸序列就会发生重排现
象。众所周知，酶反应是可逆的。在蛋白水解酶合
成活性方面，人们已经做了很多工作。一般认为，
它可能与蛋白质生物合成有密切关系。尽管受到以
上的警告，我们决定冒险尝试一下。使用蛋白水解
酶水解胰岛素，最后终于完成了两条链的全部序列
分析 [8-9]。从酸水解结果中，以前我们已经知道了许
多氨基酸序列。 两种水解方法得出的结果没有发现
异常现象。 这使我们相信，并没有出现序列重排。
在此后的许多蛋白质序列分析工作中，都选择用蛋
白水解酶来水解蛋白质。 事实证明，重排现象却常
发生在酸水解蛋白质过程中 [10]。
胰岛素两条链的测序工作主要归功于我的两位
合作者：Tuppy和 Thompson。Hans Tuppy来自维
也纳，是我知道的最刻苦工作的学者之一。战争结
束不久，奥地利的研究条件是很有限的。他很高兴
来到一个设备较好的实验室。在这里，他能做的工
作很多，是没有底的。有一段时间，我们在收集胰
岛素水解液中的多肽。他收集比较长的苯丙氨酸肽
链。我除了忙于其他事情外，收集甘氨酸肽链。很
多工作要用纸层析，而层析室在地下室走廊的另一
端。那时经常看到 Tuppy拿着层析纸在走廊里快步
走来走去。他从来不跑，谁要想赶上他就得跑步。
他在这里只待一年，到年底苯丙氨酸肽链的测序工
作实际上已经完成了。甘氨基肽链的测序工作还必
须等待我的下一位合作者 E.O.P.(Ted) Thompson从
澳大利亚到来。我曾经和几位澳大利亚人一起工作
过，发现他们很容易合作。他们好像对研究工作实
际上有一个信条：“没有无意义的工作。” 他们的工
作态度就是这样。“如果有一个实验要做，那就做
下去！”，Ted也不例外。我们在一起工作感到非常
愉快。除其他事情外，我们完成了甘氨酸肽链的测
序工作。这项工作， 我认为比更长的苯丙氨酸肽链
的工作更难些，它解决了最后一个酰胺问题。他的
坚持是非常值得酬谢的。
我们测定出胰岛素两条肽链的全序列后，剩下
的一个唯一未解决的问题就是二硫键的位置如何安
排。解决这个问题特别困难，花费了很多时间，其
间的挫折比其他工作加在一起还要多。有一种想法
是水解胰岛素分子，分离胱氨酸 (cystine) 肽，再氧
化它们，看看能产生哪种磺基丙氨酸 (cysteic acid,
即半胱氨酸 cysteine)肽。实验结果是一塌糊涂。最
后大家都知道，在酸水解过程中，二硫键发生交换
反应 [11]。两条链间一个二硫键能用酶降解进行鉴定。
但是，没有酶能将甘氨酸肽链中 Cys-Cys二硫键撕
裂为半胱氨酸。在这个困难问题上可以说当年选择
胰岛素作研究材料确实使人感到很难对付。不过也
很难说，选择其他蛋白质，我们也会遇到同样的问
题。在这之前已经有很长时间我们在寻找条件避免
水解发生交换反应。 我们最终完成了胰岛素的全部
序列测定 [12]。
胰岛素是第一个测出氨基酸序列的蛋白质。但
是，它的肽链相对说是比较短的。如果使用上述成
熟的方法测定一个较大的多肽链 (蛋白质 )的序列，
它的成功是值得怀疑的。这需要有进一步更好的分
离多肽方法。其中最重要的一种是 Moore和 Stain
建立的离子交换层析法从蛋白酶水解液中分离出较
大的肽。他们还把离子交换柱层析发展成精确分析
氨基酸的方法。这种技术虽然需要具体的修正和改
进，在今天仍是一种可选择的使用方法。使用这些
技术，他们测定出核糖核酸水解酶的全序列 (120
个氨基酸 )。(译注：应是 124个氨基酸 )。此后的
蛋白质测序工作就更多地使用他们的方法，而不大
使用以前较少定量的测定胰岛素序列的方法。
致谢：衷心感谢岳东方女士为译稿打字。
[参　考　文　献]
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图1　胰岛素的全部氨基酸序列[12]
生命科学 第27卷760
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