全 文 ：植物抗病基因工程的研究进展及前景展望
刘彦锋 刘瑛 李娜
(北京林业大学生物科学与技术学院,北京 100083)
摘 要: 近年来, 随着植物抗病基因(尤其是抗病毒基因)的分离, 植物抗病机制的分子生物学和植物抗病基
因工程的研究轰轰烈烈地展开并取得重大突破。本文针对植物抗病基因工程的原理、抗病基因、转化方法等方面
的进展进行了综述,并对抗病基因工程的应用前景做了展望。
关键词: 植物 抗病 基因工程
Research Progress and Prospects on Plant
DiseaseResistance Genetic Engineering
Liu Yanfeng Liu Ying Li Na
( col leg e of biolog ical sci ences and technolog y , B ei j ing f or est ry univ ersi ty , Bei j ing 100083)
Abstract: The isolation of resistance genes, t he molecular bio lo gy of diseaser esist ance and the investigation
on diseaseresistance genet ic eng ineering in plant s ar e developed rapidly in recent y ears and gr eat br eakthr ough have
been made. The paper summarized the pr inciple, diseaseresistance genes, t ranslation methods o f plant diseasere
sistance genetic eng ineering . The approaches in t he future and the possible applications ar e a lso pro spected.
Key words: Plant Diseaser esistance genes Genetic eng ineering
引言
植物病害给人类带来严重的危害, 因而人类与
植物病害的斗争贯穿于农业的发展与进步之中。兴
起于 20 世纪初期的经典遗传学使人们能够通过杂
交育种成功地培育出新抗病品种,大幅度地提高粮
食产量。近年来,分子生物学理论和技术的不断发
展完善,使人们不但能够从分子水平上进一步研究
植物与病原菌的相互作用机制, 而且还可以通过基
因工程这一现代生物技术直接、快速和高效地培育
抗病作物品种。
1 植物抗病基因工程的原理
植物抗病基因工程指的是用基因工程(遗传转
化)的手段提高植物的抗病能力,获得转基因植物的
方法。植物抗病基因工程主要包括以下内容: 抗病
及其他相关基因的分离和克隆; 与合适的载体及标
记基因构成适于转化的重组质粒;用不同的转化方
法向受体植物导入重组质粒;筛选转化子并鉴定转
基因植株。此外, 还有一种可以获得抗病转基因植
物的方法是将具有抗病能力的植物或微生物的
DNA 直接导入受体植物,从后代中筛选具有抗病能
力的个体,经过稳定得到转基因抗病植株[ 1~ 4]
2 利用基因沉默技术培育抗病作物
据美国加利福尼亚大学戴维斯分校 ( UC Da
vis)的科学家宣称, 利用基因沉默技术, 可以培育
抗细菌病害的作物品种, 使很多种多年生果树和坚
果树包括核桃、苹果和葡萄等,免于催患细菌性根癌
病。U C Davis果树学系的科学家 Abhaya Dankek
ar和 Matthew EsCovbar 发现, 基因沉默技术可用
于抑制细菌性根癌病时的肿瘤形成。果树基因工
程权威 Dandeka: 教授说: 基因沉默是当前植物科
学中最吸引人的技术之一。 细菌性根癌病是由常
见的土壤细菌根癌土壤杆菌 ( 根癌农杆菌 )
收稿日期: 20050422
作者简介:刘彦锋( 1983 ) ,男,陕西省永寿县人,北京林业大学在读本科生,研究方向:生物技术
联系电话: 01082839806, Email: shanxil iuyf@ 163. com
通讯联系人:李娜,北京林业大学 806信箱, 100083
生物技术通报
综述与专论 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 5期
( A grobacter ium tumef aciens)引起的。这种细菌具
有通过水平基因转移过程,将其自身的 DNA 转移于
其所感染的植物的 DNA 的独特能力。通过这种特
殊的寄生方式, 根癌土壤杆菌可使受感染的植物形
成根癌。科学家们用番茄和拟南芥为实验材料。通
过中断或抑制目标基因的活性, 达到基因沉默。
选定的目标是两种可导致植物生长激素过度产生的
细菌基因,因为植物生长激素的过度产生, 可导致细
胞无控制地增殖和根癌形成。
利用基因沉默技术育成的基因工程植物, 虽
可被根癌土壤杆菌感染, 但不会产生导致根癌形成
的激素。已证明,与对照比较,基因工程番茄和拟南
芥植株中根癌的形成减少了 90%以上。但这些基因
工程植物,除了不会产生根癌外, 其他方面与其非转
基因对照完全相同。基因沉默技术可用于利用砧
木进行嫁接的果树。
3 用于植物抗病基因工程的目的基因
3. 1 植物抗病基因
狭义上的抗病基因 R( r esi stance gene )是指寄主
体内能特异性识别病原并激发抗病反应的基因, 它
与病原菌的无毒基因 Avr ( avirulence gene)互补。
编码胞外和胞内两种类型的受体蛋白, 是抗病反应
信号转导链的起始组份, 当与病原菌的无毒基因直
接或间接编码产物(配体)互补结合后,启动并传导
信号,激发如过敏反应 HR( hypersensit ive osponse)
和系统获得抗性 SAR( Sy stem acquired resistance)
的抗病反应。由于 R基因是一类诱导表达的不知产
物和性质的基因, 传统的基因分离方法不再适合。
因此分离 R 基因一直是个难题。第一个植物 R基
因 Hml是 1992年 Johal等用转座子标签法( t rans
poson tagging)克隆到的[ 19] 。近年来随着图位克隆
( po sit ional cloning)等方法在 R 基因分离上的成功
应用,已先后分离出近 20个抗病基因 [ 20, 21] 。
3. 2 病原体无毒基因
目前无毒基因在植物抗病基因工程上的实际应
用远比植物本身的抗病基因广, 且有良好的应用前
景,因此对无毒基因的克隆具有重要的意义[ 22]。克
隆无毒基因主要有: ( l)基因库互补法。通过细菌交
配实验,将一个病原菌小种基因文库的克隆互补到
另一个小种菌株中, 从而使后者的寄主特异性发生
改变而进行克隆; ( 2)产物导向法。根据无毒基因编
码的产物性质, 先分离无毒基因的转录产物合成寡
核苷酸探针,然后从病原菌基因组文库或 cDNA 文
库中筛选无毒基因克隆。Avr4和 A vr9便是用此方
法克隆到的; ( 3)转座子标签法。与 R基因转座子标
签法克隆方法类似, 只是所用的是原核生物转座子
如 Tn5[ 21]。
3. 3 植物防卫反应基因
植物的防卫机制极其复杂, 包括水解酶和病程
相关蛋白( PR蛋白)的产生、植物保卫素的合成和积
累、细胞壁的木质化作用以及富含轻脯氨酸糖蛋白
在细胞壁的积累等许多方面。这里主要介绍植物产
生的水解酶和 PR蛋白[ 23] 。
3. 3. 1 几丁质酶基因和葡聚糖酶基因 几丁质酶
chitinase和葡聚糖酶在正常情况下只在植物体内有
低水平的组成型表达。但病原菌侵染、诱导物处理
及各种伤害可诱导产生高水平的 chit inase 和葡聚糖
酶.这两种酶的作用底物在植物中不存在, 但存在于
大多数真菌的细胞壁中。纯化的几丁质酶和葡聚糖
酶单独或同时存在, 都能抑制病原真菌的生长。自
1986年 schlumbaum 等首次报道提纯的菜豆几丁质
酶具有抗真菌活性以来,已经相继从菜豆、水稻、烟
草、油菜、马铃薯、小麦、玉米和甜菜等多种植物中克
隆到了几丁质酶基因,对立枯丝菌等 20多种真菌表
现出体外抑菌活性。一些葡聚糖酶基因也从大豆、
大麦、烟草等作物中分离,与合适的启动子构建重组
质粒后转化植物获得了转基因植物。
3. 3. 2 溶菌酶基因 溶菌酶具有几丁质酶和葡聚
糖酶的双重活性, 对植物病原菌表现出很强的裂解
活性。在已获得的 T4 噬菌体溶菌酶基因的转基因
马铃薯中,虽然只有低水平的合成表达,但能有效地
分泌到胞间隙中,明显提高对马铃薯黑胫病的抗性。
3. 3. 3 抗菌蛋白基因 抗菌蛋白基因具杀死病原
细菌的活性。从某些植物、昆虫、微生物中均分离到
抗菌蛋白, 也有报道成功地克隆了美洲商陆的抗菌
蛋白基因, 但还没有获得转抗病蛋白基因的转基因
抗病植株。不过, 用人工合成的裂解肤基因转化烟
草,获得的转基因烟草对青枯病菌感染表现出抗
性[ 5, 6]。
8 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 5期
3. 4 降解或抑制病原物致病因子的基因
在病原菌侵染致病过程中, 病原菌产生的细胞
壁降解酶和致病毒素起重要作用。例如, 多聚半乳
糖酸酶( polyg alacturonase PG)是一种细胞壁降解
酶, 在一些双子叶植物中发现有多聚半乳糖酸酶抑
制蛋白( PGIPS) , PGIPS 能有效地抑制植物病原菌
的 PG 活性, 提高植物的抗病能力。菜豆和梨的
PGIPs基因已被分离克隆,正在进行转基因研究[ 7] 。
致病毒素是重要的致病因子, 如果植物能降解
病原菌在侵染过程中产生的毒素, 那么植物就可以
有效地对抗病原菌的进一步侵染, 从而提高抗病的
能力。病原菌具有自我保护作用的毒素降解酶系,
从病原菌中分离克隆毒素降解基因并导入植物, 就
能提高植物的抗病性 [ 8]。
尖抱镰刀菌使许多植物患枯萎病, 该菌产生的
镰刀菌酸毒素在致病过程中起重要作用, 已从 lee
biella oxytoca HY1菌株中分离到了能降解镰刀菌
酸的基因, 并得到转基因番茄, 其对 F. oxyspo rum
的抗性研究在进行中。而 Moffat 报道已经克隆了
编码降解镰刀菌酸的基因,转基因植株对玉米枯萎
病表现出抗性[ 9] 。
4 转化方法
1983年第一例转基因植物获得成功以来,国内
外科学家设计发明了多种转化方法用于植物基因工
程。其中,农杆菌介导的基因转移占绝大多数,在成
功的例子中占 80%。基因枪法也是主要的转化方
法,其他的转化方法也都成功地得到了转基因植株,
各具特点。
4. 1 农杆菌介导法
第一例转基因植物就是用农杆菌介导法完成
的。根癌农杆菌和发根农杆菌属革兰氏阴性菌, 对
双子叶植物侵染广泛, 在某些条件下对单子叶植物
也有一定的感染性。根癌农杆菌含有 Ti质粒, T i质
粒上的TDNA可以插入到植物基因组中,诱导在宿
主植物中瘤状物的形成。因此, 将外源目的基因插
入到 TDNA 中,借助 T i质粒的载体作用,使目的基
因在宿主植物中整合、表达。农杆菌介导法又可根
据其受体材料不同分为原生质体共培养法、叶盘法
和创伤植物感染法, 其中叶盘法在许多植物上得到
广泛应用。汤浩茹等通过农杆菌介导法将哈兹木霉
几丁质酶基因导入核桃。有人将含 TI 基因和抗菌
肤 B, D 基因的双抗载体以及抗黄瓜花叶病毒的基
因转入西瓜,得到了 Kan 抗性植株, 但未发现含 T I
和抗菌肤 B, D基因或者是抗病毒的转化后代[ 10]。
4. 2 基因枪法
又称微弹法、粒子轰击法等, 是利用放电加速的
金属粒子携带外源 DNA 打入植物细胞或组织中进
行基因转移的一种方法, 1987年由美国康奈尔大学
的 J. c. sanford发明。基因枪法的操作对象可以是
完整的细胞或组织, 突破了基因转移的物种界限,也
不必制备原生质体, 实验步骤比较简单易行, 具有相
当广泛的应用范围[ 11] 。
4. 3 其他方法
离子束介导法, 利用离子束对细胞壁的溅射和
刻蚀作用,在细胞表面形成许多微孔道,为外源基因
进入细胞提供了路径。倪大虎等用该法将将抗菌肤
shiva基因导入到水稻恢复系的成熟胚中, 经愈伤诱
导和绿苗再生, PCR检测分析证明外源基因已整合
到再生植株的基因组中。吴丽芳等将水稻几丁质酶
基因 RcHS用离子束介导法转入三个小麦品种中,
分别得到了转基因植株, 经分子检测证实了 RcH8
基因的整合, 再生植株的叶片提取物表现出对小麦
赤霉病的抑制作用。脂质体法, 用人工合成的、类似
生物膜结构功能特性的脂类化学物质(脂质体) , 将
DNA 包裹成球体,通过植物原生质体的吞噬或融合
作用把 DNA 转入受体细胞 [ 12]。激光微束法, 利用
激光微束精确的定向性和损伤小的特点, 将激光聚
焦成微米级的微束去照射细胞, 在细胞膜上可形成
能自我愈合的微孔, 使外源 DNA 易进入细胞实现基
因的转移[ 10] 。超声波法, 利用低声强脉冲超声波的
物理作用, 击穿细胞膜造成通道, 使外源 DNA 进入
细胞[ 10] 。
5 植物抗病基因工程的前景展望
植物基因工程是细胞水平和分子水平上的遗传
操作, 其最大优点是能最大限度地利用人们所感兴
趣地外源基因以及使工作更具目的性, 给植物抗病
育种提供了一条十分有效和有用的途径。在抗病育
种方面,科学家可以通过基因工程技术将抗病毒、抗
细菌和抗真菌的基因引入植物中, 从而提高植物的
抗病性。而且, 用转基因的方法比常规的杂交育种
92005年第 5期 刘彦锋等:植物抗病基因工程的研究进展及前景展望
方法,在育种周期上要缩短 3~ 4 年, 展示了植物抗
病基因工程在育种上的应用前景[ 13, 14] 。
然而植物基因工程本身存在很多问题: 外源基
因能否稳定高效地表达转基因植物本身的优良性状
是否受到影响而且目前可用于转化的抗性基因太
少,转移的基因存在基因沉默的现象,都限制了植物
抗病基因工程的发展 [ 15]。
因此植物抗病基因工程要获得深入发展, 加强
相应的基础研究是十分重要的。比如对植物个体遗
传发育规律的研究; 对植物体内基因表达调控的研
究; 对植物与病原物之间的特异性作用及其机理研
究;对抗性基因的筛选、克隆研究等等[ 16]。在上述研
究的基础上,将合适的抗性基因进行巧妙的加工,通
过合适的转化方法, 按预定位置插入植物基因组中,
并使之在一定的时间和器官中稳定表达, 就可以获
得大量的抗病转基因植物品种。可以预见, 用转基
因方法选育抗病植物品种将成为农作物抗病育种中
最有效、最常用的手段[ 17, 18]。
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10 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 5期