全 文 ： 技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年增刊
微卫星遗传标记及其在昆虫种群遗传学中的应用
王永模 沈佐锐
(中国农业大学农学与生物技术学院, 北京 100094 )
摘 要: 微卫星是一类短串联重复的寡核苷酸序列, 广泛地分散于各类真核生物基因组中, 它具有多态性
高、检测结果稳定可靠等特点,是目前较为理想的群体遗传研究的分子标记之一。该文阐述了微卫星 DNA构成及
特点, 多态性形成机制、位点获得途径,列举了微卫星遗传标记在昆虫种群遗传学研究中的应用实例, 并展望了该
技术的应用前景。
关键词: 微卫星 遗传标记 昆虫 种群遗传学
M icrosatelliteDNA and Their Application in Insect Population Genetics
W ang Yongmo Shen Zuoru i
(C ollege of agronomy and biotechnology, China agriculture university, Beijing 100094)
Abstrac:t M icrosatellite DNA are a kind o f short tandem repea ted nucleotide sequences, w ide ly scattering in the
who le genom e of eukaryotes. F or h igh ly polym orph ic and re liab le conclus ion in ana lyzing, they are w ide ly used in popu la-
tion genetics and other area. In th is paper, we m a inly focus on m icrosate llite DNA s structu re, character istic, conform a-
tion, obta ining m ethods and applica tions in insect population gene tics, furthe rmo re, their futurew ere forecasted.
Key words: M icrosate llite Geneticm arke r Insect Popu la tion genetics
作者简介:王永模 ( 1976-) , 男, 博士研究生, E-m ai:l w ym hzsg@ 163. com,电话: 010-62733015
遗传标记 ( genet ic marker)是指用来区分不同
的个体或群体,能够稳定遗传的物质或性状,是研究
生物的遗传、进化及生态特性的重要工具。最早的
遗传标记是形态标记,但这种标记表型变异很少,与
基因型的关系不甚明确。 20世纪 60年代 Lewontin,
Hubby和 H arris等发明了等位酶电泳技术 [ 1, 2] , 极大
地推进了遗传标记技术。然而, 这种标记仍是表达
型标记,易受环境条件和发育阶段的影响, 可利用
的多态性位点仍不能满足需要。从 20世纪 80年代
开始, 遗传标记的研究重点转向遗传信息的载体 -
DNA分子,出现了多种多样的分子遗传标记 ( molec-
u lar genetic marker)。分子遗传标记突破了表达型
标记的局限性,其变异只来源于基因 DNA序列的差
异,具有稳定性高、受环境条件的影响较小等优点,
因而成为遗传标记中又一强有力的工具。常用的
DNA分子标记技术有: DNA限制性酶切长度多态
性 ( RFLP); 数量可变的串联重复序列 ( VNTR) (主
要包括微卫星、小卫星 ) ; 基于 PCR 的随机扩增
DNA 多态性 ( RAPD )、扩增片段长度多态性
( AFLP)和单链构象多态性 ( SSCP)、以重复序列为
基础的微卫星标记 ( STR)。与其他遗传标记相比,
微卫星标记具有稳定性高、信息含量高、种群中分布
广泛等优点, 正日益受到人们的重视。
1 微卫星遗传标记概况
1. 1 微卫星 DNA的构成
20世纪 70年代, 研究发现经过机械剪切的
DNA在 CsC l2或 C sSO4中梯度离心时, 在 DNA总
带外还有一条完全不同的特有带, 因而, 这种带被
称作卫星 DNA ( Satellite DNA )。对卫星 DNA的进
一步研究显示, 这些 DNA是由一组大小不等的重
复单元构成, 这些重复单元长度从几百到几千碱
基, 重复次数从几百到几千次。上世纪 80年代初,
Jeffreys等检测到重复单元比卫星 DNA要小的多的
一系列串联重复单元, 被称为小卫星 DNA ( M in-i
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2006年增刊
sate llite DNA )
[ 3 ]。在 1987年 Nakamura等检测到重
复单元比小卫星更小的串联重复序列, 被称为微卫
星 DNA (M icrosate llite DNA ) [ 4] , 又称为短串联重
复序列 ( Sho rt tandem repea,t STR) , 或简单序列
重复 ( S imple sequence repea,t SSR )。其实早在
1974年, Skinner就在寄居蟹中发现了这种序列,
自 1986年 A li等人首次用合成的寡核苷酸串联重
复作为探针用于人的 DNA指纹分析之后, 微卫星
DNA分析才受到重视。
后来研究还发现微卫星 DNA是一类广泛分布
于真核生物基因组中的短串联重复序列, 其具有突
变速率快、多态性高等特点。常见的微卫星以二、
三、四核苷酸为重复单元, 约占真核基因组的 5% ,
多位于编码区附近,也可位于基因内的间隔区、外显
子、内含子和调控区域,且分布均匀。根据微卫星的
重复类型可以把微卫星分为三类:即完全、不完全和
复合型微卫星。微卫星在基因组中数目巨大,据估
计,真核基因组中平均每 6kb就存在一个微卫星序
列 [ 5]。人类基因组中约有 5 104 ~ 105个 ( CA )重
复,重复次数一般为 15~ 60次, 重复单位相同,其长
度一般小于 200bp, 但也有更长 [ 5]。
1. 2 微卫星 DNA的特点
每个特定位点的微卫星 DNA位点均由两部分
构成: 中间的核心区和外围的侧翼区。核心区含有
一个以上的称为 重复 的短序列, 一般该重复单元
的碱基对数目不变, 而串联在一起的重复单元数目
是随机改变的, 串联重复单元的外围即是侧翼区。
同种动物个体可以表现为侧翼区相同而串联重复单
位的数目不同,也可为有相同数目的重复单位但侧
翼区所在染色体位置不同, 或者两者均不同。对侧
翼序列研究表明,微卫星侧翼序列突变少,一般为单
拷贝序列,因此单拷贝的侧翼序列可以将微卫星特
异定位于染色体的某一部位,这样,该特定微卫星位
点的等位基因差异主要来自不同数目的串联重
复 [ 6]。
微卫星是目前发展最快的一类分子标记。与其
他标记技术相比,具有以下特点: ( 1)保守性, 微卫
星位点在种内是高度保守的,在近似种间也有一定
和保守性; ( 2) 共显性遗传,微卫星标记的等位基因
符合孟德尔遗传定律,呈共显性遗传; ( 3)丰富的多
态性,即微卫星重复序列的数目在某一群体中是高
度可变的; ( 4)具有遗传连锁不平衡现象; ( 6)在不
同的位点上的微卫星 DNA的重复顺序可以不同也
可以相同; ( 7)择中性,即微卫星位点的等位基因频
率不受自然选择作用的影响; ( 8)微卫星采用单位
点 DNA指纹技术检测,重复性较好。
1. 3 微卫星的形成机制
普遍认为微卫星重复顺序的产生的原因主要是
三点: DNA复制过程中滑动; DNA复制和修复
时滑动链与互补链碱基错配; 在减数分裂中的不
等交换,导致一个或几个重复单位的插入或缺失,使
这些重复序列的拷贝数发生了变化,从而形成群体
内个体间的多样性即多态性 [ 3]。到目前为止, 微卫
星的功能尚不清楚。已发现微卫星能参与遗传物质
的结构改变、基因调控及细胞分化等过程,有自身特
异结合蛋白,尚能直接编码蛋白质,是一种非常活跃
的碱基序列。目前较公认的是微卫星参与了基因重
组,是基因重组和基因变异的来源。
1. 4 微卫星位点的获取途径
研究者通过实验可以分离、筛选某一物种的微
卫星位点,也可通过 G enB ank或文献检索已发表的
位点。分离微卫星 DNA的大致步骤为: 提取基因组
DNA, 用限制性内切酶将基因组 DNA切割, 凝胶电
泳回收大小约 300~ 500bp的片段。将回收的片段
克隆、放大,用标记的探针进行杂交,筛选出含重复
序列的克隆,测序证实其重复序列的存在。然后在
该重复序列片段的两端设计引物, 进行扩增验证。
理想的微卫星 DNA标记应具备完整的重复序列, 有
一定长度的侧翼区 (至少在 15bp以上 ) , 以适合引
物设计的需要。微卫星位点的筛选首先是进行
PCR扩增, 然后通过聚丙酰胺凝胶电泳鉴定其多态
性。一个位点所提供的信息量随重复单元中数目和
完整性的增加而增加。但在群体遗传分析中, 选取
多态性最高的位点也存在一定问题,因为对位点的
选择依赖于群体中该等位基因的分布, 为避免偏差,
含有较少重复单元的位点也应该包括在内。过去,
阻碍微卫星 DNA分析的一个主要因素是对每个物
种都要开发出所需的 PCR引物。微卫星 DNA及其
两侧区域在近似种间相对保守的发现极大地促进了
其应用范围。
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2006年增刊 王永模等: 微卫星遗传标记及其在昆虫种群遗传学中的应用
2 在昆虫种群遗传结构分析中的应用
微卫星 DNA自从被引入,很快就融入了生态学
家和进化生物学家的技术宝库,成为一种流行标记,
用于解决诸如系统发育、群体遗传结构、行为生态和
亲缘关系等问题 [ 7~ 9]。最初,微卫星 DNA分析主要
用于行为生态学研究,如: 父系测定判断雄性交配是
否成功、群体的社会组织和精子竞争等,但目前已被
越来越多地应用于各物种的群体遗传学研究。对自
然群体的遗传研究依赖于多态的中性标记, 微卫星
DNA与同工酶一样, 是离散的共显性信息, 且微卫
星 DNA具有更多的多态性, 受选择性作用更小,尽
管微卫星 DNA确切的进化样式和可能的进化压力
还有些不确定的地方, 仍可被看作是一个接近于中
性的标记, 可以测定哈迪 - 温伯格平衡、连锁不平
衡、遗传漂变、迁移和有效群体大小等多个群体遗传
结构参数。
冈比亚按蚊 Anopheles gambiae是疟原虫的寄
主, 20世纪 80年代初圣多美和普林西比举国开展
灭蚊运动以降低疟疾的传播,其后由于运动的中断
流行病又广泛传播。P into等用 13个微卫星位点研
究了这个岛国内按蚊的遗传结构, 分析种群的遗传
变异及杂合度等参数,结果表明种群间差异较大,杂
合度检验结果是种间和种内杂合度都未见显著差
异,有效种群仍较大。微卫星分析表明灭蚊运动中
使用的传统方法 (户内喷洒 DDT)并未能降低有效
种群数量,按蚊并未经历瓶颈效应,种群仍处于平衡
状态 [ 10]。Lehmann等分别用同功酶和微卫星两种
遗传标记计算东非和西非的冈比亚按蚊不同地理种
群的基因流,结果均很好地反映出种群的遗传分化,
但微卫星标记比同功酶的灵敏度要更高一些 [ 11 ]。
K amau等用微卫星标记技术研究冈比亚按蚊时发
现,由于地理隔离使得种群与种群之间缺少基因交
流,从而导致了按蚊种群的分化 [ 12]。
JiYJ等 2003年建立了一个微卫星棉铃虫基因
组 DNA文库, 筛选出了 5个单拷贝微卫星位点,对
27个地理种群的棉铃虫进行了种群结构、生态区划
和种群演化格局的研究, 初步探讨了棉铃虫暴发的
分子遗传学机制 [ 13]。Evans用微卫星标记检测一种
蚂蚁Myrndca tahoensis群体的 DNA多态性, 结果发
现既产雌又产雄的蚂蚁群体, 个体间亲缘关系较
低 [ 14]。W idmer用微卫星研究熊蜂 Bombus terrestris
的群体遗传结构及其群体进化史。熊蜂在欧洲、近
东、南非、地中海和大西洋具有广泛的地理分布。根
据分类和体表颜色的不同,目前将 Canary和 M ade-i
ra岛的熊蜂看做是 2个独立的品种。从 Canary群
岛取 4个样,从 M adeira群岛取 1个样, 9个微卫星
研究的结果发现岛与岛之间、岛与陆地之间熊蜂遗
传差异是非常大。用微卫星做的聚类分析表明
Canary岛的熊蜂与其它地区的熊蜂明显不同, 而
Made ira岛的熊蜂却与欧洲的陆地熊蜂非常近
似 [ 15]。
龚鹏等通过微卫星引物 PCR扩增方法,对不同
寄主上的棉蚜 Aphis gossyp ii不同季节的棉蚜及其不
同蚜型的种群分化进行 DNA多态性研究。结果发
现棉蚜的有性蚜型和无性蚜型之间的在遗传是有较
大的差异,且有性蚜型和无性蚜型各有其特征带;性
母与性雌蚜、雄蚜的遗传关系十分接近;干母和干雌
的遗传关系很近, 但孤雌蚜已与二者有明显分
化 [ 16] ;冬寄主上棉蚜种群分化较小, 而冬寄主种群
和夏寄主种群之问棉蚜有较大的遗传分化 [ 17]。
2001年杨效文等构建了棉蚜基因组 DNA 300 ~
800bp的插入文库,并筛选出 2个棉蚜微卫星位点,
对棉蚜的种群分化进行了研究, 结果表明地理距离
是种群间基因交流的主要障碍, 不同寄主和不同体
色的品系间有不同程度的遗传分化 [ 18]。Guillemaud
用 7对微卫星引物对法国不同地理种群的桃蚜 My-
zus p ersicae进行了时间和空间的遗传结构分析。利
用有性系和无性系在秋季 (交配产卵期 )分布位置
不同的特性,直接得到有性系和无性系。遗传数据
表明有性系的基因型多样性明显多于无性系, 基因
型多样性随季节变迁而降低 (春-秋 ), 说明自然选择
正在起作用, 当两个地点距离小于 60km 时遗传结
构差别不明显, 当两个地点距离在 150~ 200km之
间时差异明显,表明桃蚜的迁飞能力大概在此距离
之间 [ 19]。国伟 ( G. W e i)等用 5对微卫星引物研究
了中国 15个麦长管蚜 Sitobionm iscan thi地理种群遗
传结构,通过遗传距离分析发现东部平原地区各种
群间的遗传距离近,西部高原各种群间遗传距离远,
推测在地理距离相当的情况下地势可以阻碍基因交
流程度,但总趋势是遗传距离随着地理距离的增大
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2006年增刊
而增大 [ 20]。
3 问题与展望
一个良好的遗传标记应高度稳定, 具有丰富的
多态性,且在全基因组的分布较均匀,微卫星标记基
本符合上述要求, 且绝大多数位于非编码区, 不转
录,不编码蛋白质和 RNA不受选择压力的影响。微
卫星遗传标记极大地促进了昆虫种群遗传学、生态
遗传学、基因定位等领域的研究,这是以往各种遗传
标记未曾实现的,但该技术在运用过程中也受到一
些因素的制约。首先是微卫星的筛选过程繁杂,当
前仍然只有少数昆虫种类筛选出了微卫星位点。其
次,对微卫星 DNA的检测需要高分辨率的检测方
法,理论上最高分辨率应达到分辨出一个碱基的差
别,目前常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳 /银染技术虽能
达到这个要求, 但过程复杂, 这就给大样本量的检
测带来了一定的难度。高效的微卫星位点筛选和全
新的检测技术将为微卫星应用带来巨大的潜力。
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