全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论·
收稿日期:2006-04-25
作者简介:李诚斌(1974-),男,研究方向:植物分子遗传学,E-mail:c.b.lee@163.com
LTP在植物抗环境胁迫中的作用
李诚斌 施庆珊 疏秀林 欧阳友生 陈仪本
(广东省微生物研究所 广东省菌种保藏与应用重点实验室,广州 510070)
摘 要: 脂质转移蛋白(Lipidtransferprotein,LTP)是一类分泌蛋白,曾被认为是一种在体外膜间进行脂质转移的蛋
白,因其作用对象很广泛,所以目前又称其为非特异性LTP(non-specificlipidtransferproteins,nsLTPs)。有很多证据表明
nsLTPs可能参与多方面的植物细胞与生理生化反应,这些生物学功能包括:参与角质层的合成和胚胎的发育;适应各种胁
迫环境;抗病原微生物等作用,尤其是在适应胁迫环境中,起到很大作用。介绍了nsLTPs在植物抗环境胁迫中所发挥的作
用,同时对应用研究作了简单展望。
关键词: 植物 脂质转移蛋白 环境胁迫
LTPandItsEnvironmentalStressToleranceinPlants
LiChengbin ShiQingshan ShuXiulin OuyangYousheng ChenYiben
(GuangdongProvincialkeyLaboratoryofMicrobialCultureColectionandApplication,GuangdongInstituteof
Microbiology,Guangzhou510070)
Abstract: Lipidtransferproteins(LTPs)aresecretedproteins,whichidentifiedinitialybytheirabilitytofacilitate
transportoflipidsinvitrofromonemembranetoanother.Duetotheabsenceofsubstratespecificity,theyarecurently
namednon-specificlipidtransferproteins (nsLTPs).QuiteanumberofevidencesrevealedthatnsLTPsareprobably
involved in diferentaspectsofplantphysiology and cel biology,including formation ofcutin monomersand
embryogenesis,involvementinflowering,defensereactionsagainstphytopathogens,andtheadaptationofplantstovarious
environmentalconditions.Itplaysavitalofroleintheadaptingtotheenvironmentalstresresistance.Inthispaper
describesthensLTPsactasanimportantroleinseveraltypeofplantstresresponse,meanwhileprospectsforthe
practicaluseinagricultureareprovided.
Keywords: PlantsnsLTPsEnvironmentalstresresistance
干旱、盐碱、高温、冷(冻)害和涝害等非生物胁迫
因素是严重影响作物生长发育的环境因子,也是制约
世界粮食作物产量的重要因素。据统计全世界的盐碱
地近 10亿 hm2,约占陆地面积的 1/3。我国大约有
666.7万 hm2盐碱地,含盐量最高达 0.6%,且有逐年
增加的趋势。每年由于干旱使全球粮食产量降低10%
～20%。干旱给农业带来的损失有时可能是灾难性的。
在未来25年,全球的水稻产量必须增加60%才能满
足人类自身人口增长的需要,因此就有必要尽可能的
减少一切由生物或非生物因素带来的减产[1,2]。随着人
口的不断增长、环境资源的恶化,研究的注意力愈来
愈集中如何改良植物对逆境胁迫的抗性上。由于植物
的胁迫耐性大多数属于数量性状,现有可利用的资源
匮乏,采用常规的育种方法已无法满足研究的需要,
不仅耗时费力,困难大,而且效果不太理想,因此,必
须引入外源基因来增强植物对环境胁迫条件的抗性。
目前,应用于植物胁迫耐性改良的外源基因包括编码
渗透调节产物合成酶、膜修饰酶、活性氧清除酶、胁迫
诱导蛋白等基因[3]。
植物nsLTPs是一种主要存在于细胞壁的可溶性
蛋白,由于它的存在使植物对不良环境具有很强的抗
性和适应性,以及对病原微生物有抗性。因此,通过把
外源的LTP基因导入植物体内过表达,使植物体内的
LTP蛋白增加,以增强其对生物与环境胁迫的抗性,
从而对增加作物的产量提供最直接的帮助。
1 LTP生物学特性
2006年第6期
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第6期
脂质转移蛋白质(lipidtransferprotein,LTP)广泛
存在于动物、植物和微生物中,已从许多不同植物组
织中分离得到。1994年Thoma等通过原位杂交等手
段发现它主要存在于拟南芥 (Arabidopsisthaliana)气
生部分的表皮层中,进一步细胞学水平上的定位研究
又发现它存在于植物细胞壁中[4]。在不同植物中已发
现了多种nsLTPs,它们具有一些共同的特征,如:分
子量较小,约为 8～10kD;N端具有信号肽结构,分子
内具有 8个半胱氨酸由 4个二硫键连接成固定结构
等。
体外实验证明,它具有介导生物膜间脂质分子转
运、抑制细菌和真菌生长、适应胁迫环境等功能。但其
它体内功能却不是很清楚。
2 LTP与植物环境胁迫的关系
在自然环境中,植物的生长一直随着周围环境条
件的改变而不断变化。自然界对植物的生长代谢能够
造成不利影响,甚至造成农作物减产的主要环境因子
有冷害、冻害、干旱和盐碱等因素。为了克服各种逆
境,植物产生了一系列复杂的生理生化和分子反应。
胁迫因子被识别,最终通过一系列信号分子的传导来
影响诱导基因的调控元件,从而影响到各种蛋白的合
成。通过研究发现,LTP在植物抵抗和适应胁迫环境
中有着重要的作用,比如水胁迫(waterdeficit)、重金
属处理[5]和盐胁迫[6,7],以及冷处理[8]等都会诱导 LTP
基因的表达,个体LTP的表达水平与植株的生长阶
段、组织类型及作用因素有着密切相关性。
由各种环境胁迫因子诱导产生了许多基因,尽管
这些因素不相同,但针对干旱、高盐和低温诱导的基
因,有一个顺式作用元件—DRE(dehydration-respon-
siveelement)在其中起调控作用[9,10],至于其它的作用
机理还不是很清楚。
2.1 冷害和冻害对植物LTP表达的影响
在冻害高发区,甚至是零星出现的地区,植物的
抗冻能力就是决定该地区农作物产量最主要的因素
了。除此之外,在很多地方,植物分类也是由其对冻害
的忍受能力来决定的。因此研究植物对冻害的忍耐能
力的冻伤机制就一直受到人们的关注。在自然状态
下,冻害不是单独存在的,它常常伴随其它一些冬天
常见的胁迫因素共同侵害植物,这些因素包括水淹和
冰冻造成植物缺氧;大风和阳光直射导致茎脱水等。
另外,低温还会引起植物对病原菌抗性的降低[11]。但是
植物总能在一定程度上去适应和容忍这些胁迫因素。
至于植物怎么去感应冷环境并适应,目前其分子机制
还不是很清楚[12]。
随着温度的降低,植物细胞最明显的变化就是细
胞膜的流动性降低[13],因此,人们研究冷适应主要集
中在质膜和叶绿体类囊体膜在胁迫条件下的稳定性。
通过分子学的研究发现高等植物对冷环境的适应是
受到多种调控途径共同作用的[14],甚至还与一些信号
传导途径有关。
在植物对低温的适应过程中,有很多基因的表达
得到增强,但是其中很多基因的生理与生化功能却未
知。Cryoprotectin是第一个报道在胁迫条件下具有稳
定质膜功能的 LTP蛋白 [15]。Cryoprotectin的活力对
Ca2+和Mn2+具有很强的依赖性,会受到螯合剂的抑制。
Cryoprotectin具有超低温保护作用,但令人奇怪的是,
它却丧失了脂质转移活力[16];同样这种情况也发生在
洋葱种子抗细菌LTP中[17]。由此而产生一个“结构与
功能”的问题,为什么在这样一个极端保守的蛋白中
其氨基酸系列发生很小的变化就会导致生化活性发
生如此之大的改变。
在低温条件下,Keresztessy等(1998)利用同源模
型 技 术 (homologymodelingtechnique)比 较 大 麦
(HordeumvulgareL.)、玉米 (ZeamaysL.)等作物在冷
适应过程中其结构的变化规律,发现LTP可能改变了
质膜的脂质的组成[18]。
低温对LTP的表达所作用的时间也不一致。大
麦(H.vulgare)在低温诱导处理 7d后才达到最高表
达量[19],黑麦(wheat-rye,Triticumaestivum)的 TaLTP1
(T.aestivumlipidtransferprotein)、TaLTP2基因在 24h
之内就得以表达[20]。
2.2 水胁迫与植物LTP基因表达的关系
植物 LTP也会受到水胁迫的诱导。在水胁迫
(waterstress)适应方面,Liu等(2003)研究绿豆(Phaseo-
lusaureus)LTP时发现其在水胁迫适应过程中有重要
作用,且特异的存在于生长中的茎组织中 [21]。菜豆
(Phaseolusvulgaris)LTP受水胁迫的诱导。Jang等
(2002)研究发现黑麦(T.aestivum)在经过水胁迫处理
后第三天TaLTP得到表达[20]。
2.3 干旱与盐碱对植物LTP基因表达影响
20
2006年第6期
LTP可由各种非生物因素胁迫诱导表达:Dunn
(1991)等证实干旱诱导了大麦(H.vulgare)中LTP的表
达[22];Tores-Schumann(1992)等报道了番茄(Lycopersi-
conpenneli)在盐的作用下诱导LTP的表达[6];Ouvard
等发现了向日葵(Helianthusannus)叶里有受干旱诱导
的LTP蛋白 [23]。通常一些由低温和干旱诱导的类似
LTP(LTP-like)蛋白,也会由 ABA诱导产生。Rabbani
等(2003)研究非生物因素(冷冻、干旱、高盐和 ABA)
对水稻基因表达的影响时发现,98%以上的高盐诱导
基因和100%的ABA诱导基因是由干旱因素引起的,
这表明不仅干旱与高盐之间,而且干旱与ABA之间
有着很强的相关性[24],但所有这些因素都最终与干燥
或水胁迫相关[25]。这些受干旱(包括盐、甘露醇、ABA、
PEG、高温等)诱导表达的LTP蛋白或类似LTP蛋白,
在不同的组织和时间下表达。ABA和渗透压条件(盐
和甘露醇)能够提高水稻LTP2的表达,在处理12～24
h后表达量达到最高水平,而未经诱导处理的水稻种
子只有在萌发三天后的成熟种子中有表达;在一般情
况下,水稻LTP1是不在种子和根中高水平表达,同样
也不受盐的诱导表达[26]。
Trevino等研究了番茄(L.penneli)nsLTPs家族中
受干旱诱导的表达差异性。LpLtp1和LpLtp2在幼叶
中诱导表达,随着叶片的成熟逐渐减少,而LpLtp3在
嫩叶中只有很低的表达量;在ABA诱导下,LpLtp1和
LpLtp2转录水平要比干旱条件下高,而LpLtp3正好
相反[27]。
LTP基因的诱导表达因植物不同,其对各种胁
迫因子的反应也是不一致的。例如在一些大麦(H.
vulgare)品种中,LTP基因表达只受 NaCl和 ABA的
诱导,而冷害、水杨酸和干旱不会诱导产生 LTP的表
达。LTP基因对胁迫环境的应答,不仅与植物种类有
关,而且也在同一株植物的不同组织和器官中表达。
番茄(L.penneli)只有在用 NaCl、甘露醇、ABA、高温
处理时,才会在茎中表达类似 LTP蛋白。大麦(H.
vulgare)中干旱胁迫诱导的基因只在根和茎中得以表
现。
3 植物逆境胁迫抗性的功能基因组研究策略
与方法
由于植物抗逆性遗传极其复杂,因而植物抗逆性
能(包括抗非生物胁迫如盐碱、干旱、低温等的能力和
抗生物胁迫如真菌、细菌、病毒和线虫的能力等)的提
高受到了极大限制。由于抗逆性状的复杂性和缺乏有
效的选择手段,难以通过选择或种属间杂交或诱交方
式来获得优良品种。通过抗逆性与产量性状的相关性
进行相关育种虽然是可行的,但抗逆性和数量性状位
点(QTL)的连锁关系十分复杂,在不同的发育时期,这
种连锁关系也会有很大的不同。因此,目前功能基因
组学的应用对研究植物抗逆性起着重要的作用。
基因组规模的EST、基因组测序和cDNA微阵列
分析,是快速分离鉴定与渗透压、干旱、温度相关基因
的主要研究方法。目前常用的方法有:(1)利用胁迫特
异性的表达序列标签 (EST)[27];(2)cDNA微阵列 (或
DNA芯片)技术来筛选与胁迫相关的基因,其优点是
可以同时对大量基因,甚至整个基因组的基因表达差
异进行对比分析,但其缺点是假阳性高、成本高,在一
些技术上还不够成熟,此方法成功用于筛选出水稻、
拟南芥等植物中的盐胁迫基因[24,28];(3)利用基因芯片
技术分析胁迫相关基因,如冰花(Mesembryanthemum
crystalinum)中的耐盐基因;(4)利用正向遗传学(For-
wardgenetics)和反向遗传学(Reversegenetics)进行功
能研究。利用反义方法(Antisenseapproaches)可以发现
新的适应性酶,比如△1-pyroline-5-carboxylatesyn-
thetase,也可以揭示一些与胁迫适应性相关蛋白的功
能;(5)抑制差减杂交技术(SSH)。该方法具有操作简
便、周期短、高敏感性,阳性率高等特点,其缺点是需
要几微克的 mRNA,材料差异不能太大[29],因此该方
法应用比较广泛。Yubero-Serano等(2003)利用此方法
从草莓(Fragriaananassacv.Chandler)浆果中克隆到一
个与ABA、受伤和冷胁迫有关的Fxaltp基因[30];Wu等
(2003)从伏令夏橙(ValenciaOrange)中分离到 CsLTP
基因,具有抗微生物侵害的作用[31];中科院遗传发育
所602组就利用此方法从旱稻(Oryzasativacv.IAPAR
9)中克隆到一个特异性的水稻LTP基因[32]。但就目前
所发表的报道 LTP基因家族的克隆多数是从 cDNA
文库中利用差异筛选法(diferentialscreening)分离得
到[33,34],也有利用 cDNA-AFLP方法筛选的,如马铃薯
(Solanumtuberosum)nsLTP基因[35](Horvathetal,2002)。
Lee等(2003)利用SAGE技术(serialanalysisofgeneex-
pression)分析了在冷胁迫条件下拟南芥中LTP基因表
达模式,以及其在冷适应中可能充当的角色[36]。
李诚斌等:LTP在植物抗环境胁迫中的作用 21
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第6期
4 LTP基因在抗环境胁迫中的应用
环境胁迫因子是制约植物产量的最主要因素。克
服这些限制因素,提高作物的产量是人口迅速发展的
当今世界必须面对的问题。通过传统培养、选育方法
改良植物的胁迫抗性,至今尚未培育出真正的耐胁迫
品种。因此通过遗传工程直接导入外源基因来提高作
物抗性,可能是一条最有效,最快捷的方法了。
目前国内外对LTP基因的研究主要集中在结构
与生理生化性质等理论方面的研究,至于其实际运用
到植物中还尚属少见。国外有报道通过把洋葱(Ali-
umcepa)中克隆到的同源 LTP——Ace-AMP1,转化到
PusaBasmati1(一种印度本地的栽培品种),获得的转
基因植株具有抗生物胁迫的作用[37]。本人经前曾工作
过的中科院遗传发育所储成才研究组把克隆到的水
稻 LTP基因与一个具有强启动子的表达载体相连,
采用农杆菌介导法转化到水稻品种日本晴(Nippon-
bare)中,获得带有外源LTP基因的转基因植株。对转
OsLTP1基因植株进行的耐盐性能实验初步表明,转
基因植株可以在含 NaCl(1.5%)的培养基上正常生
长,而非转基因植株却死亡[38]。自然环境下,大多数植
物对盐碱、干旱的耐受性差,只能生长在氯化钠含量
为0.3%以下的土壤上。
通过该实验证明,转LTP基因植株具有较强的耐
盐能力,一方面证明了外源LTP基因可以提高水稻植
物的耐盐性能,且与其转录表达水平密切相关;另一
方面,也表明其在实际生产中具有很大的应用潜力。
5 前景展望
自LTP被发现至今,人们对其研究也比较深入,
尤其是在生化性质方面研究的比较充分,但就其在环
境胁迫中所起到的作用研究甚少,至于成功应用的范
例则更少,作为一种能使植物适应生物与非生物胁迫
环境的基因,应用前途十分广泛,有必要深入研究,为
提高作物的抗性发挥重要作用。
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