全 文 ：RNA干涉在提高植物营养价值上的应用
刘宾 蒋继志 廖祥如 韩国辉 史海水
(河北大学生命科学学院,保定 071002)
摘 要: RNA 干涉( RNAi)是由具同源性的外源 dsRNA 引起的序列特异性转录后基因沉默现象, 广泛存在
于各种动、植物中。人类大多数疾病, 像心脏病和癌症, 都能够通过食用添加具有特殊营养成分养的饮食来预防。
应用 RNAi技术可为人和动物提高植物的营养价值。
关键词: RNAi dsRNA siRNA RISC RdRP Dicer
The Application of RNAi in Improving Plant Nutritional Value
Liu Bin Jiang Jizhi Liao Xiang ru Han Guohui Shi Haishui
( F acul ty of L if e Sc ienc e , H ebei Univ er sit y , Baoding 071002 )
Abstract: RNAi( RNA inter ference) is a phenomenon o f specifical postranscriptional g ene silencing mediated
by induced dsRNA w ith homogenous sequences , w hich operat es extensively in both plant s and animals. Some major
human diseases, such as hea rt disease and cancer, can be prevent ed by dietar y supplements o f specific nutrients. It
can improve the nutr iti onal value o f plants for human and animal nut rit ion through RNAi.
Key words: RNAi dsRNA siRNA RISC RdRP Dicer
近几十年, 由于基因图谱和鉴定的完善, 典型植
物和农作物基因组序列的测定, 转基因技术在提高
食品和饲料营养价值上的应用越来越广泛。但是,
通过转基因提高植物营养的效果受两种因素限制。
一方面是外源基因拷贝的引入可能会间接降低外源
基因和同源内生基因的表达, 这是一种被称作共抑
制的基因沉默现象[ 1]。另一方面是新陈代谢循环
有反馈抑制特性, 倾向保持体内营养水平平衡。通
过刺激某种已停止营养积累或将营养成分转变为代
谢废物的分解代谢方式使生物合成基因过表达, 会
使某种营养成分产量提高, 植物就会对这种提高产
生回应[ 2]。因此,考虑降低分解酶水平的代谢控制
方式是必需的。
1998年,由于 dsRNA 的干涉( RNAi)对靶mR
NA 抑制的特异性和高效性的确认, 而得到广泛重
视。最近,共抑制已被认为是 RNAi 一种转录后
体内负调控途径的表现, 并且影响某些超表达效果
的共抑制现象也对实现分解酶水平降低有用。
RNAi改良了基因活性编程性丧失的可能性。
RNAi在动、植物中都有发生, 都以 dsRNA 引起同
源的靶 mRNA 的降解。在体外把 dsRNA 转入动、
植物细胞,降低同源基因表达的方法已取得了巨大
成功[ 3]。这都表明应用 RNAi调节植物基因的表
达,从而提高植物的营养价值具很高的可行性。
1 RNAi的机制和特点
1. 1 RNAi的机制
20世纪 90年代, Arizona 大学的 Jor gensen 在
试图通过增加色素合成基因拷贝数创造一种紫色更
深的矮牵牛时,发现转基因植物的内、外源色素合成
基因的表达都被抑制了,部分或全部开白花,他将这
种现象命名为共抑制。8年后, Graig M ell和 An
dr ew Fire发现在秀丽小杆线虫中引起明显基因沉
默的微量 dsRNA 具有与线虫 dsRNA 相同的序
列[ 4 ]。他们称这不同寻常的基因沉默为 RNA 干
涉。
RNA i在动、植物中的生化过程已被探明,并且
收稿日期: 20050129
作者简介:蒋继志,硕士生导师,电话: 13032028223
通讯作者:刘宾( 1977 ) ,男,河北邯郸人,研究方向:植物分子与基因工程
生物技术通报
技术与方法 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 3期
多种真核生物都具这种现象。Zamo re 根据经验指
出由 21~ 23 个核苷酸构成, 被称作小型干涉 RNA
的 siRNA 是促使果蝇的特定 RNA 在体外降解的关
键因素[ 5]。后经证实 siRNA 是 RNase 家族的
Dicer 断裂 dsRN A 的直接产物 [ 6]。随后, s iRNA 先
被装配成叫做 siRNP 的多蛋白复合物, 然后加工成
RNA 诱导沉默的复合体( RISC) ;这些复合体寻找和
断裂与 siRNA 互补的靶 mRNA [ 6] 。
真核生物中还存在一种叫做 miRNA 途径的基
因沉默方式。miRNA 是一类含量丰富的不编码的
小 RNA( 21~ 24 个核苷酸) , 由 Dicer 或 Dicerlike
酶切割由基因组中非蛋白编码区编码的长转录本产
生的具不完全茎环结构的 miRNA 前体产生。siR
NA 和 miRNA 都参与构成结构相似的 RISC。
RISC会对与其互补的靶 RNA ( cRNA )进行切割或
阻碍其翻译。在植物中, 大部分已知的 miRNA 与
它们相应的靶 mRNA 基本或完全互补。
植物内源的 RNA 沉默体系也包括一种 RNA
依赖的RNA合成酶( RdPR)。该酶以完全或不完全
配对的方式以 RNA为模板合成 cRNA [ 7] , cRNA 与
模板 RNA退火形成 dsRNA, dsRNA 在 Dicer 作用
下被切割 siRNA。
1. 2 miRNA i的优点
有些 RNAi载体产生的 siRNA 和长 dsRNA 有
激活 RNA依赖的蛋白激酶( PKR)途径, 会引起细
胞非特异性死亡 [ 12]。避免激活细胞的 PKR途径仍
是 RNAi技术发展的一个主要挑战。而动、植物体
内大量内源 miRNA 除了在基因调控中所起的编程
作用,没有其它不利影响。从以下几个方面来说会
更加利于控制基因表达。
第一, miRNA 不引发 PKR 途径。第二, m iR
NA 可正确地破坏靶基因转录本,或者高效地抑制靶
基因转录本翻译。最近的一项研究表明在人的脊椎
表达的 siRNA- miR30减少靶基因产物的效率比由
普通短的发夹结构 RNA 作用产生的 siRNA 高
80%。第三, m iRNA 的表达受到时间与空间的限
制。第四,单独一个 miRNA 可以作用于一个基因
群的几个不同基因或个体, 比如 PHV 和 PBH 的由
miR165/ m iR166指导的切割[ 7]。第五, 单链 miR
NA 来自类 siRNA 双链体, 此类双链体的结构在其
末端能量分布上具有高不对称性。这些不对称的双
链体注定一条链会尽可能参与形成 RISC, 而另一条
链很可能被破坏[ 13] 。因此, 由以 miRN A 为基础的
siRNA 载体产生的类 miRNA 的小 RNA会对 RISC
集合表现出更高的偏爱, 并且会指导对它们的靶
mRNA 的高效切割。
1. 3 逆沉默的优点
RNAi原是一种防御核酸(包括病毒和转座子核
酸)入侵的机制。例如,在病毒侵染过程中大多数植
物 RNA 病毒会形成 dsRNA 中间物, dsRNA 中间
物又会被宿主的 Dicer 切割形成 siRNA, siRNA 以
病毒 RNA 为靶 RNA 进行降解的。但许多病毒有
一种合理的逆防御方式, 能使 RNAi被抑制, 即使在
RNAi途径激烈活动时这种方式也可以让病毒高效
的侵染植物。
在最近几年已有 20 种来自不同植物病毒的
RNA 沉默抑制物被鉴定。例如, 最近发现番茄丛生
矮病毒群可产生一种 p19 蛋白, 该蛋白通过强亲和
力与 siRNA 结合[ 14] ,抑制 RNAi。当宿主的沉默反
应被烟草的 p19蛋白抑制时, 在一个瞬间表达实验
中的各种各样的转入基因的表达被提高了 50 多
倍[ 14]。因此, 表达 p19 或其它 RNA 沉默抑制物的
转基因植物也许能按期望超表达某些至今仍被不明
因素抑制的基因。
2 RNAi在提高植物营养价值上的应用
在许多作物中基因控制的特异产物并不只在特
定组织中发生作用, 而是在所有或大部分植物器官
中行使功能。因此, 某一对改良种质有益的基因突
变往往对其它植物器官的生长有害。RNA i不仅不
仅可以增加可操纵基因的范围和变异的类型, 而且
其对基因的控制有时空性。
应用 RNAi提高植物体赖氨酸水平的实验很好
的说明了这个问题。赖氨酸的合成受到赖氨酸引起
的对二氢吡啶二羧酸合酶( DHPS)活性的反馈抑制
的严格调控。DHPS 专门催化赖氨酸的生物合成。
植物 DHPS 基因的遗传突变致使 DHPS 对赖氨酸
不敏感,使植物体所有器官中的赖氨酸过量产生[ 8]。
但是,虽然种子中赖氨酸含量的增加是有益的,可植
物生长组织的赖氨酸增加是有害的, 因为高浓度的
赖氨酸会引起植物生长和开花的异常, 最终使种子
32 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 3期
产量降低[ 8] 。通过使用种子特异启动子的 RNAi技
术,可使几种作物种子的转基因 DHPS 特异表达,消
除了 DHPS 对植物生长组织的不利影响, 使植物即
具有好的生长特性, 又在种子中累积了高浓度的赖
氨酸[ 9] 。
RNAi技术也被应用在其它几种植物的营养质
量提高上。例如,在咖啡中, 通过特异 RNAi对咖啡
因合酶基因进行抑制, 可显著降低咖啡因含量[ 10]。
在另一项研究中,通过 RNAi敲除一种 22kD的玉蜀
黍醇溶储藏蛋白的基因成功地产生了一种显性的高
赖氨酸玉蜀黍变种, 该变种的种子富含高赖氨酸的
蛋白。
RNAi在油脂的脂肪酸构成的遗传修饰上也取
得了成功。具发夹的 RNA 引起的 RNAi已被应用
在降低棉花的两个关键脂肪酸脱氢酶基因的控制
上,这两个基因分别编码硬脂酰载体蛋白 9脱氢
酶和油酰磷脂酰胆碱 6脱氢酶[ 11] 。去除棉花的这
两个基因会提高棉花的营养价值,产生高油酸、高硬
脂酸的棉子油, 这两种脂肪酸是人的心脏健康所必
须的。
3 植物 RNAi技术的发展
在首次对在植物中由 dsRNA 引发的 RNAi技
术的基因沉默的研究中, 反向重复序列被用来超表
达引发了花本身基因高效沉默的 dsRNA [ 16]。Peter
Waterhouse和他的同事 [ 15] 通过插入一个作为接头
的内含子,进一步完善了这个基于 RNAi技术的载
体。
同样,被设计用来表达具发夹结构的 RNA 的载
体也成功的沉默了其相应的靶基因[ 17] 。dsRNA 或
具发夹结构的 RNA 的组成性表达往往给植物的生
长发育带来想象不到的不利影响。因此, 虽然化学
诱导 RNAi沉默载体已发展到能从时间和空间上控
制沉默的程度[ 18] ,并且此类的化学诱导沉默体系的
应用对植物功能基因组学的研究非常有意义,但是
大规模的使用化学物质改良植物是不切实际的, 而
且对环境有害。组织或器官对基因沉默的特异性控
制可能是植物 RNAi技术发展的一个更好的选择。
沉默植物基因的另一种方法是病毒诱导的基因
沉默( VIGS) [ 20] 。该技术通过用表达内源植物基因
转录本片断的重组病毒侵染植物体, 可以使靶基因
瞬间失活。关键是 VIGS 通过对病毒诱导达到
RNAi不需要对植物体的基因作任何改变。VIGS
对基因功能的研究非常有用[ 19] , 但是不能通过改变
遗传信息来改良植物。
4 结论和展望
人类植物食品的营养价值在预防各种各样与营
养不良有关的人类疾病上越来越重要。dsRNA 引
发的 RNAi能高效的沉默基因, 并且检出目的植物
所需时间更短, 所以能高效的提高人类植物食品和
家畜饲料的营养价值。
植物特异组织和器官的靶基因沉默需要组织或
器官特异性 RNAi载体。随着 miRNA 基因结构的
分析,沉默效率高、副作用少的植物 RNAi载体会有
很大发展。高营养食用作物的基因工程既需要基因
沉默,也需要逆沉默技术。未来的研究会集中在能
以时、空控制的方式行使功能, 且以 RNAi为基础的
基因沉默载体的发展和精细调控上。
参 考 文 献
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