全 文 ：蛋白质组学研究技术及其在植物抗渗透胁迫研究中的应用
何宝坤1 王玉洁1 孙立平2
( 1临沂师范学院,临沂 276005; 2泰山医学院化学和化学工程学院,泰安 271000)
摘 要: 蛋白质组学是功能基因组学研究的热点领域之一。该文介绍了蛋白质组学的基本的和新兴的研究
技术方法如蛋白质组样品的制备、双向凝胶电泳、生物质谱技术、蛋白质芯片技术、酵母双杂交系统和生物信息学
等,以及蛋白质组学技术在植物抗干旱、盐渍等渗透胁迫研究中的应用。
关键词: 蛋白质组学 研究技术 植物 渗透胁迫
Proteomical Research Technology and its Application
in the Research of Plant Resistance to Osmotic Stress
He Baokun
1 Wang Yujie1 Sun Liping2
( 1 L in Yi Normal Univ er si t y , linyi 276005;
2 Dep artment of Ch emist ry and Chemical E ngineer ing , T ai sh an Medical Col l eg e, T aian 271000)
Abstract: Proteom ics is one of the most active research f ields in functional g enomics. The a rticle intr oduced the
essential and new protemica l research techniques and methods such as preparat ion of pro teome example, two dimen-
sional electropho resis( 2-DE) , bio-mass pectr ometry ( MS) , pro tein chips, yeast two hybrids system and bio- info rmat-
ics. Their applicat ions in the r esear ch of plant resistance to osmot ic str ess such as dr ought and salt tress w ere illum-i
nated biefly.
Key words: Proteom ics Resear ch techno lo gy Plant Osmotic str ess
蛋白质组是指由一种细胞、器官/组织、生物或
一个基因组所表达的全部蛋白质,这一概念最早由
澳大利亚的 Wilkins 和 Williams 于 1994 年提出。
蛋白质组学则是应用高通量、高自动化程度的大规
模蛋白质分离和鉴定技术研究蛋白质组的一门学
科。在蛋白质组学的研究技术中, 双向凝胶电泳、计
算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术
被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。双向电
泳技术的建立, 使大规模蛋白质的分离成为可能。
以计算机为基础的多种图像分析与大规模数据处理
软件的问世,使得科学家处理复杂的类似满天星
样的蛋白质图谱并建立相应的数据库得心应手。质
谱技术的发展, 可精确测定生物大分子的相对分子
量及多肽序列, 使得微量快速的蛋白质鉴定得以实
现。除上述基本技术外, 新的蛋白质组研究技术也
不断出现,如蛋白质芯片技术、酵母双杂交技术等。
随着蛋白质组学研究技术的迅速发展, 蛋白质
组研究对象也从 1995年的支原体[ 1] 、1996 年的酵
母[ 2 ]到近几年的所有生物。人们已经对拟南芥、水
稻、小麦和玉米等模式植物的蛋白质组进行研究[ 3] ,
分离并鉴定了与植物各种生命活动相关的大量蛋白
质。植物抗渗透胁迫作用作为一种重要的生命活
动,成为各种植物蛋白质组学研究的热点领域之一。
以下将对蛋白质组学研究的主要的、最新的技术以
及它们在植物抗渗透胁迫研究中的应用进行介绍。
1 蛋白质组学研究技术方法
1. 1 蛋白质组研究的样品制备
选择合适的样品制备方法对获得满意的双向电
泳图谱是很重要的。由于蛋白样品的来源和类型差
异较大,可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行
蛋白质组分析,也可以先进行样品预分级,即采用各
种方法将细胞或组织中的全体蛋白质分成几部分,
收稿日期: 2004-12-18
生物技术通报
技术与方法 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 2期
分别进行蛋白质组研究。一般方法是对细胞、组织
等样品进行破碎、溶解、失活或还原, 尽可能断开蛋
白质间的连接键,提取全部蛋白质。
蛋白样品提取以后, 为了获得高灵敏度、高分辨
率、高重复性电泳图谱,常常要对提取的蛋白质组样
品进行处理。样品中常含有核酸、脂、多糖、盐等影
响蛋白质的可溶性和双向电泳重复性的物质,可采
用超离心、透析、柱层析和加入核酶等方法来清除这
些物质。为了有针对性研究细胞中的某个细胞器,
还可以利用超离心或密度梯度离心技术分离目的细
胞器的蛋白再进行电泳。对于低拷贝蛋白, 可利用
层析技术进行富集。
1. 2 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳( 2-DE)
Farrel, Klo se和 Scheele于 1975年分别建立了
双向凝胶电泳 ( tw o dimensional poly acrylamide gel
electr ophoresis, 2-D PAGE )。双向凝胶电泳的基
本原理是根据蛋白质的等电点和分子量大小不同,
进行两次方向不同的电泳将之分离。第一向是等电
聚焦( isoelect ric focusing, IEF) ,分为载体两性电解
质 pH 梯度等电聚焦和固相化 pH 梯度等电聚焦;第
二向是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS- PAGE)。由
于蛋白质的等电点和分子量是两个彼此不相关的重
要性质,而 2-DE 同时利用了蛋白质间的这两个重要
性质上的差异分离蛋白质,因此 2-DE的分离能力非
常强大,目前在这样的一张凝胶上能同时分离几千
个甚至上万个蛋白质点。2-DE 结合质谱鉴定技术
可鉴定出大量的蛋白质组分, 再与其他生物技术如
分子生物学、分子遗传工程、微量蛋白质的自动氨基
酸序列分析相结合, 可以快速准确地发现和鉴定新
的蛋白质。
双向凝胶电泳虽然有高灵敏度、高分辨率、高重
复性的特点,但在应用中也面临一些问题, 如许多疏
水性蛋白质(如膜蛋白)、相对分子质量过大和极端
酸性或碱性蛋白在电泳过程中易丢失。低拷贝蛋白
组分易被高丰度蛋白组分遮蔽, 降低了分辨率。蛋
白在提取和消化过程中的丢失、凝胶的污染、在不影
响分辨率情况下的上样量多少等都是尚待解决的问
题。
1. 3 蛋白质点的染色
双向电泳凝胶上的蛋白质点染色常用方法有银
染色和考马斯亮蓝染色法 [ 4] , 另外还采用以下染色
试剂:氨基黑、印度墨、胶态金等。但测序技术和质
谱灵敏度的提高, 使蛋白质显色地位从简单的蛋白
质点转换为集成化的蛋白质微量化学表征过程中的
关键步骤。随着高灵敏度的蛋白质分析方法和电泳
后鉴定技术的结合, 银染色和考马斯亮蓝染色法用
于蛋白质组研究的局限性日益暴露出来。新的染色
技术如荧光标记、同位素标记技术在提高了灵敏度
的同时,也与自动化的蛋白质组平台切胶技术相兼
容,染色技术向高灵敏度和自动化方向发展。
1. 4 凝胶图像分析
获得蛋白质双向电泳凝胶后, 要将凝胶图像以
数字化图像的形式存储下来, 以利于进一步用双向
电泳凝胶分析软件进行分析。完整的图像处理包括
图像的采集和图像的分析。常用的图像采集系统有
光密度扫描仪、激光光密度仪、激光诱导荧光监测器
等,把凝胶上的蛋白质点数字化。为了对采集的图
像进行分析, 目前已经形成了比较完善的图像分析
系统, 常用的图像分析软件有 PDQuest6. 0、Im-
ageM aster 2D Elite3. 10、Phoretix 2D 等, 它们的基
本功能是相近的, 都包括一下步骤: 蛋白质点检测、
背景消减、归一化处理、蛋白质点匹配。
1. 5 生物质谱技术
质谱分析法是通过测定样品离子的质荷比( m/
z)来进行成分和结构分析的分析方法。80年代中期
出现的两种新的电离技术:电喷雾电离和基质辅助
激光解吸电离为代表, 这两种技术所具有的高灵敏
度和高质量检测范围,使得在 fmo l( 10-15 )及至 amo l
( 10
-18
)水平上检测相对分子量高达几十万道尔顿的
生物大分子成为可能, 从而促使质谱技术在生命科
学领域获得广泛的应用。质谱技术鉴定蛋白质, 其
优点是灵敏度高、准确度高, 而且容易实现自动化。
因此, 质谱技术是蛋白质组研究中最重要的鉴定技
术。
质谱技术按照样品分子离子化的方式分为电喷
雾离子化质谱 ( elect rospray ionizat ion mass spec-
trometr y, ESI-MS ) 和基质辅助的激光解吸质谱
( matrix-assisted laser desorpt ion ionizat ion, MAL-
DI-M S)。ESI-M S主要是靠强的电场使样品分子离
子化并以带单电荷或多电荷的离子形式进入质量分
192005年第 2期 何宝坤等:蛋白质组学研究技术及其在植物抗渗透胁迫研究中的应用
析器。它测定相对分子质量数万的蛋白质准确度可
达万分之一,并且可与高效液向色谱( HPLC)、串联
质谱等技术连用。电喷雾离子源后连接串联质谱可
检测离子结构碎片的质荷比, 能够提供离子的结构
信息,应用于多肽、核酸的测序及蛋白质的鉴定和翻
译后修饰分析。MALDI-M S 的基本原理是将分析
物分散在基质分子中并形成晶体, 当用激光照射晶
体时,基质分子吸收激光能量, 样品解吸附, 基质样
品之间发生电荷转移使样品分子电离。它常用飞行
时间( t ime of f light , T OF)监测器作为质量分析器,
所构成的仪器称为基质辅助激光解吸/电离飞行时
间质谱( MALDI- TOF-M S)。飞行时间监测器的质
量分析范围很大, 从几百道尔顿到十万道尔顿都可
以检测。线性飞行管的 MALDI-TOF-M S的质量分
辨率和测量准确度不高, 为了改进仪器的分辨率和
质量测量准确度, 在仪器的飞行管道内加了一个反
射电场,构成的仪器称为反射飞行时间质谱( RET-
OF-M S)。反射电场能使具有相同质荷比但能量有
细微差异的离子飞行时间达到一致, 同时离子改变
了飞行方向,延长了飞行距离,所以反射飞行时间质
谱( RETOF-M S)的分辨率和质量测量准确度有了很
大提高。
1. 6 蛋白质芯片技术
随着蛋白质组学的发展, 对高通量、自动化的要
求越来越高, 从而出现了蛋白芯片技术。它是将一
系列诱饵蛋白以阵列方式固定在经过处理的底板
上,然后将其与待分析的样品杂交, 只有那些与诱
饵结合的蛋白被保留在芯片上,然后通过检测器对
标记物进行检测, 计算机分析计算出待测样品的结
果,即可高通量快速的测定蛋白质的生物活性、种类
及相互作用。
目前,国外所使用的方法多是一种基于蛋白质
芯片和质谱技术联用的蛋白质谱分析平台新的蛋白
质芯片技术, 其核心是一系列称为 Pr otein Chip 的
蛋白质芯片, 它们具有多种特性, 如阳离子交换、阴
离子交换、金属离子螯合等 [ 5]。将蛋白芯片与质谱
技术联用,用质谱直接检测反应结果,极大提高了分
析的灵敏度与自动化程度。
1. 7 酵母双杂交系统
酵母双杂交系统最初是在人们对酵母转录因子
GAL4的认识基础上建立的。天然 GAL4分子由 1
条多肽链组成, 含有 881 个氨基酸, 1 个完整的
GAL4可分为结构上可以分开的、功能上相互独立
的 2个结构域:位于 N 端 1~ 174 个氨基酸区段的
DNA 结合结构域( DNA binding domain, BD)和位
于 C端 768~ 881位氨基酸区段的转录激活结构域
( Act ivat ion domain, AD) , 它们是转录因子发挥功
能所必需的。BD 和 AD单独作用时不能激活转录
反应,但是当二者在上游较为接近时,则呈现完整的
GAL4转录因子活性。分别与 BD和 AD融合的两
个蛋白现在分别一般称之为诱饵和猎物。如果
在诱饵和 猎物之间存在相互作用, BD和 AD
就能重新形成具有活性的转录因子, 从而激活报告
基因的转录。通过对报道基因表达产物的检测, 就
可判别诱饵和 猎物 两个蛋白质之间是否存在
相互作用。酵母双杂交系统具有相对简便、快速及
不用纯化相应蛋白的特点,可以用来鉴定各种受体、
转录因子、蛋白激酶、磷酸化酶、细胞骨架蛋白以及
参与细胞周期调控的蛋白质。
1. 8 生物信息学
生物信息学是以生物大分子为研究目的, 计算
机为工具,运用数学和信息学的观点、理论和方法去
研究生命现象, 组织和分析数量极其庞大且呈指数
级增大的生物学数据的一种学科。它是利用计算机
科学、数字和统计学的方法, 通过搜索、分析、比较大
量的基因和蛋白质序列数据,建立理论模型, 进行基
因结构的鉴定、分子设计、蛋白质结构预测、蛋白质
结构与功能关系的研究。目前, 在蛋白质组学方面
的应用: 蛋白质结构预测、数据库建立以及各种分
析、检索软件。
2 蛋白质组学研究技术在植物抗渗透胁迫
研究中的应用
在植物的生存环境中,一些环境因子如干旱、盐
渍等能引起渗透胁迫, 对植物的生长发育和生存都
会产生严重影响。渗透胁迫可以引起植物体内蛋白
质的种类和数量的变化。运用蛋白质组学研究技术
可以使我们更好地了解植物抗渗透胁迫的机理以及
植物对渗透胁迫的适应机制。
2. 1 干旱胁迫的蛋白质组学研究
当用 10% PEG 模拟干旱胁迫处理不同水稻品
20 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 2期
种,其中 Sinloa 品种根部有 13 种多肽发生变化, 8
种( M r 从 13 000 到 67 000)合成提高, 5 种( M r 从
21 000到 52 000)降低; 在 IR10120 中, 有 7 种多肽
( M r 从 22 000 到 67 000)合成提高, 4 种( M r 为 40
000、15 000、81 000和 43 000)降低。而耐旱的 Chia-
pas品种仅 4种多肽( M r为 60 000、62 000、16 000和
13 000)合成升高,未引起任何多肽的降低 [ 6]。
Salekdeh等[ 7] 研究两个水稻品种( Or yza sat iva
L. cv CT9993和 cv IR62266)在干旱胁迫以及复水
后的蛋白质组分变化。对叶片提取物进行电泳, 然
后分析胶上的 1 000多个蛋白点, 结果发现有 42个
蛋白点的丰富度在干旱胁迫下发生明显变化;复水
10天以后,所有蛋白的丰富度与对照组的完全或接
近。后来利用质谱法鉴定了 16个与干旱胁迫相关
的蛋白质,包括一个肌动蛋白解聚因子,它是在干早
胁迫下两个栽培品种鉴定的 3 个蛋白质之一。另外
还发现一个类 S 的 RNase同族体与干旱胁迫相关,
但是它缺少两个 RN ase组氨酸活性位点。此项研究
共揭露出 4 种与干旱相关的最新机制: 类 S 的
RNase 同族体上游调节因子、肌动蛋白解聚因子、核
酮糖一 1, 5 一二磷酸经化/加氧激酶和异黄酮类还
原酶蛋白, 为干旱胁迫下水稻的蛋白质组研究提供
有价值的参考。
干旱也能引起小麦幼芽蛋白质组分及含量变
化,主要发生在分子量为 20~ 48kD、等电点( pI)为
5. 34~ 5. 65的蛋白质, 并且干旱诱导小麦幼芽产生
41. 5kD 蛋白亚基, pI 为 5. 65; 分子量为 36. 2kD
( pI5. 35)和 15. 8kD( pI5. 70)的两个蛋白亚基含量也
明显增加[ 8] 。
2. 2 盐胁迫的蛋白质组学研究
用放射性同位素自显影双向电泳法研究水稻幼
苗盐胁迫下多基因的瞬时表达表明,至少有 35个蛋
白质被盐胁迫诱导和 17 个蛋白质被抑制, 包括 20
个在这之前未曾报道的低丰富度蛋白。这些发现对
寻找渗透胁迫应答新基因,尤其是那些在水稻盐耐
性获得中起瞬时调节作用的基因十分重要[ 9]。
耐盐的 779品种水稻幼苗中, 盐胁迫后诱导出
66kD/ pI5. 5 和 26kD/ pI6. 0的特异蛋白组份, 并有
多种蛋白质组分消失和含量减少现象; 而在盐敏感
的早花 2号水稻中, 虽然也有少数蛋白质组份被诱
导产生,但没有检测到 66 000和 26 000两种蛋白质
组分,并且双向电泳图谱相对稳定[ 10] 。
2. 3 渗透胁迫信号转导的蛋白质组学研究
蛋白质组学高通量技术运用到信号转导通路研
究中,产生了一个新的研究领域: 信号转导蛋白质组
学。其作为功能蛋白质组学的一个重要组成部分,
以研究信号转导通路以及其中的信号分子改变的蛋
白质组学。克服了传统地针对单条信号转导通路以
及其中的单个信号分子研究策略的局限性,能够在
一次实验中系统地研究多条信号转导通路中的蛋白
质- 蛋白质间的相互作用、蛋白质磷酸化等翻译后
修饰和下游靶蛋白的改变,有助于全面阐述信号转
导通路,已成为一个新的研究热点。
在渗透胁迫信号转导系统中, ABA 起了很大的
作用, 对于渗透胁迫信号的转导以及渗透胁迫诱导
蛋白的表达都起到了很大的作用。Moons等( 1997)
鉴定了水稻根中 3个受 ABA 诱导的蛋白质, 其氨基
酸序列测定确定其中 2个属于第 2类和第 3 类胚胎
后期丰富蛋白( LEA ) ,第三个未知。MAPK 途径是
研究较为深入的信号转导途径, 用酵母菌的双杂交
分析和突变体互补分析, 提出了拟南芥的 MAPK 级
联途径, AT MEKK1 MEK1/ A TMKK2 AT-
MPK4。
3 展望
蛋白质组学在大规模蛋白质水平上为基因功能
的研究提供了强有力的工具, 已经成为后基因时代
的研究热点。近几年,植物蛋白质组学发展迅猛,研
究重点主要放在利用双向凝胶电泳鉴定不同基因
型、表型和发育中表达的蛋白质组分,不同植物组织
的双向电泳图谱重点放在特定亚细胞蛋白质组或蛋
白复合体,例如根部、线粒体、类囊体和叶绿体。而
对植物在生长过程中经常遇到的干旱、盐渍等渗透
胁迫的研究较少, 为了全面了解植物抵抗渗透胁迫
的生理生化机制, 有必要对以下两方面进行更深入
的研究: ( 1)运用蛋白质组学技术分离和鉴定更多的
渗透胁迫诱导蛋白, 并预测这些蛋白的高级结构和
功能; ( 2)利用蛋白质组学技术进一步研究植物感
知、传递渗透胁迫信号和最终诱导相关基因表达的
渗透胁迫信号转导网络。
(下转第 36页)
212005年第 2期 何宝坤等:蛋白质组学研究技术及其在植物抗渗透胁迫研究中的应用
0203 双价转基因( Bt Bt+ CpT I )抗虫棉花新品系。皮棉产量较低,比华抗棉 1号减产 5. 5%。绒长
31. 0mm, 整齐度84. 60%,比强度 36. 60cN/ tex ,伸长率 6. 3%,马克隆值5. 22, 纤维品质较好。高抗红铃虫,
耐黄萎病。突出特点是纤维长,比强度高,抗虫性好。可继续选择,以培育出高产优质抗虫新品种,也可用作
杂交亲本改良棉花的纤维品质和抗虫性。
2005 单价( B t)转基因抗虫棉花新品系。皮棉产量低,比华抗棉1号减产 8. 5%。绒长 32. 50mm, 整齐
度 84. 90%, 比强度 38. 90cN/ tex ,伸长率 6. 4% ,马克隆值 5. 20,纤维品质较好。高抗红铃虫,耐黄萎病。突
出的特点是纤维长, 比强度特高,为超高强纤维新材料,抗虫性好。可用作杂交亲本改良棉花品种的纤维品
质和提高杂交品种的抗虫性。
3. 2 棉花抗虫育种技术探讨
从试验结果看出:在外源抗虫基因利用方面, 具有双价抗虫遗传背景的材料比单价抗虫棉表现好;在育
种途径方面,选育杂交棉品种、利用棉花杂种优势比选育常规转基因抗虫棉品种好[ 8~ 9] 。
利用转基因抗虫新种质作为杂交亲本配制的杂交组合,其后代分离广, 出现有利性状的机率大, 获得优
异种质如长纤维,高强纤维材料的机会多。
抗虫育种过程中,在产量性状选择方面, 应特别注意大铃和高衣分的选择。因抗虫棉的单株成铃数普遍
较高, 但一般铃较小,抗虫棉品种的衣分偏低 [ 10~ 11]。如能协调好衣分、单铃重与结铃性之间的相互关系,抗
虫棉的产量能进一步提高,抗虫棉的纤维品质和抗虫性普遍较好,在杂交育种实践中, 利用抗虫种质作为杂
交亲本,完全可以培育出高产优质抗虫棉花新品种 [ 12]。
参 考 文 献
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(上接第 21页)
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