全 文 ： 生物技术通报
# 技术与方法# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第 2期
抑制性消减杂交技术在寄生虫学研究中的应用
韩红玉 林矫矫 黄兵
(中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所,农业部动物寄生虫学重点开放实验室,上海 200232)
摘 要: 抑制性消减杂交技术( SSH)是一种适用于分离两个遗传背景相关的 DNA 样品之间差异从而表达
基因的方法。目前,该技术在寄生虫学研究中的应用不是很多 ,主要应用在寻找与寄生虫不同发育阶段相关的差
异表达基因和与寄生虫抗药性相关的差异表达基因以及其他相关基因的研究, 如与不同虫株、不同宿主、或性别差
异相关的基因。本文从这几个方面综述了 SSH 技术在寄生虫学研究中的进展情况。了解这些信息,有助于将来
更好地利用该技术研究寄生虫学,为寄生虫病的防治提供一定的理论依据。
关键词: 抑制性消减杂交 差异表达基因 寄生虫 发育阶段 抗药性
The Application of Suppression Subtractive Hybridization in Parasitology
Han H ongyu Lin Jiaojiao Huang Bing
( K ey L a borator y f or A nimal Para si tology of M inist ry of A gr ic ul tr y ,
Sh anghai I nsti tu te of Animal Parasi tology , CA A S, S hanghai 200232)
Abstract: Suppression Subtr act ive H ybridization( SSH) is widely used method fo r separat ing DNA mo lecules
that distinguish tw o closely related DNA samples. But it is no t widely used in parasit olo gy . In this paper, T he ma-
jor applicat ion of SSH w ere intr oduced , fo cusing on isolation r elated differential genes fr om different developmental
stag es of parasit e and related drug- resistant genes o f par asite. Besides the two aspects, other related differential ex-
pressed genes w ere ident ified by SSH , such as the related genes of different str ains , different hosts and sex . This
informat ion was pro vided some t heo ries fo r preventing and cur ing parasit osis .
Key words: Suppression subt ractiv e hybridization Differential expr essed gene Parasite Developmental
stag e Drug resistance
生物体之所以能表现出各种各样的特性, 展示
出丰富多彩的表型,重要原因之一是由于其内部基
因表达差异所致,因此认识生物体内部基因有序地、
时相性地表达是揭示遗传信息复杂性的一个极为重
要的步骤[ 1] 。对于一个生物个体来讲, 虽然所有细
胞的基因组组成是相同的,但在不同的细胞、同一细
胞的不同分化阶段和同一细胞受到不同的外界刺激
时,有关基因的表达是不相同的。了解不同细胞或
同类细胞在不同发育阶段、不同生理状态下的基因
表达状况,可以为研究生命活动提供重要的信息。
基因表达的差异表现为两个方面:一是基因表达种
类的不同;二是基因表达水平的高低/差异。目前,
在众多筛选差异表达基因的方法中 SSH 技术具有
操作简单、筛选效率高、假阳性率低、消减的 cDNA
群体用途灵活等独特的优点 [ 2] , 被科学家们广泛的
关注并应用于生命科学的各个领域。
SSH 技术是一种适用于分离两个遗传背景相
关的 DNA 样品之间差异表达基因的方法。在 SSH
技术的众多应用中, 主要用于 cDNA 和基因组
DNA 的消减杂交。该技术是建立在抑制 PCR 基础
上的,在单一程序上结合了均一化和消减的方法。
均一化的目的在于使目标群体中 DNA 片段丰度均
等化;消减的目的在于排除了两个群体中的共有序
列。该方法运用了杂交二级动力学原理, 即丰度高
收稿日期: 2005-12-20
基金项目:国家自然科技资源平台建设项目( 2005DKAZ1205-4)
作者简介:韩红玉( 1973- ) :女,博士,研究方向:寄生虫分子生物学
的单链 DNA 在退火时产生同源杂交的速度快于丰
度低的单链 DNA,从而使原来在丰度上有差别的单
链 DNA 含量达到相对均衡等。这极大地增加获得
低丰度差异表达 cDNA 或基因组 DNA 片段的可
能,从而简化了消减文库的分析。一般情况下, SSH
技术通过一轮消减杂交后可使稀有序列富集大约
1 000倍左右。
SSH 技术自 1996 年报道以来, 由于其实验方
法具有优越性, 已成功用于细胞分化、发育、再生、衰
老等的研究中和分离不同组织器官之间、个体不同
发育阶段以及受外界因子作用而差异表达的基因等
方面,该方法的研究主要集中在医学等相关领域在
寄生虫学的研究还不是很多, 文献报道也很有限, 但
已经陆续有一些报道了。目前, 主要集中在几种危
害严重的寄生虫研究上, 涉及以下几个方面:
1 与寄生虫生活史不同发育阶段相关的差
异表达基因的研究
寄生虫的生活史比较复杂,需经过几个不同发
育阶段来完成整个循环过程, 每个阶段的虫体有不
同的形态特征, 需要不同的生活条件。因此, 每个发
育阶段都有其特异表达的基因,到目前为止, 寄生虫
学者已发现了一些危害较为严重寄生虫的不同发育
阶段差异表达基因。
1. 1 与寄生原虫不同发育阶段相关的基因
疟原虫是一种分布极广, 遍及全世界的寄生性
原虫,它的生活史复杂, 需要中间宿主按蚊, 完成整
个生活史有许多形态和功能明显不同的发育阶段。
在蚊体内完成复杂的发育过程是疟原虫传播所必须
的,研究蚊媒体内疟原虫的发育生物学是发展疟疾
防治新策略的前提。疟原虫子孢子在蚊子中肠的卵
内发育,然后进入唾液腺中发育成熟。按蚊将唾液
腺中疟原虫子孢子通过叮咬注射入脊椎动物宿主,
使其感染。尽管卵内子孢子和唾液腺内子孢子形态
相似,但它们对哺乳动物宿主的感染性存在很大差
异,产生免疫保护性反应的能力和细胞的运动性也
不相同。为此, M atuschew ski K 等[ 3] 利用 SSH 技
术分析了卵内子孢子和唾液腺内子孢子差异表达基
因情况,通过比较鉴定了唾液腺子孢子中 30个高度
表达上调的 mRNA 转录本, 其中,有 29个在血液阶
段不是明显表达的。最多的转录本是编码蛋白激酶
基因。疟原虫感染阶段特异性 mRNA 表达上调表
明:这些基因的翻译产物可能在肝细胞感染/肝脏阶
段的发育中起作用。同时,为了鉴定疟原虫在按蚊
体内不同发育阶段的差异调控基因。Dessens等[ 4]
也运用 SSH 方法成功获得了蚊子中肠阶段疟原虫
的阶段特异性表达基因。疟原虫感染哺乳动物的入
侵阶段- 子孢子和裂殖子入侵宿主并分别寄生肝细
胞和红细胞。每个入侵阶段虫体为了与宿主细胞周
围环境相互作用并得以生存,需要适应环境,这些适
应性很可能是被差异表达基因所控制的。为了鉴定
其差异表达基因, Kaiser K [ 5]等利用 SSH 技术以约
氏疟原虫( P . yoeli i)唾液腺子孢子和裂殖子为材料
鉴定了入侵阶段特异的红细胞前期转录本。对消减
文库 cDNA 克隆测序,将获得的 cDNA 序列与 P.
yoel ii 基因组比较获得了 25 个高丰度的靶基因,其
中包括已经鉴定的子孢子特异性蛋白基因:编码环
子孢子蛋白( CSP)和血小板反应素相关的无名蛋白
( T RAP) ) ) ) 一个具有血小板反应素类型 1 重复单
位的新蛋白。分析表明其定位在子孢子棒状体中。
另外,还鉴定了一组 4个基因编码的低分子量蛋白,
其中两个蛋白表达图式类似于 TRAP, 因此可能定
位于子孢子的分泌微线中。通过鉴定, 这些差异表
达基因编码的蛋白介导了子孢子和蚊子唾液腺以及
子孢子和哺乳动物肝细胞之间的特异性相互关系。
在疟原虫生活史中,其基因的表达随宿主转换, 寄生
部位以及虫体的不同发育期而发生显著变化。鉴定
不同发育阶段的关键基因对于分析疟原虫入侵宿主
细胞、激发期特异免疫应答以及了解其特定的生化
过程具有重要意义。
利氏曼原虫有一个两性世代交替的生活史,在
前鞭毛体和无鞭毛体之间交替转换。无鞭毛体感染
巨噬细胞,寄生于吞噬溶酶体的水解环境中。在分
化为无鞭毛体的过程中, 利氏曼原虫显示了明显的
形态变化和生化变化。这些变化是通过一系列独立
的基因阶段特异性表达调控的。Bellat in JA [ 6]等通
过 SSH 方法鉴定了两个在墨西哥利氏曼原虫
( L eishmania mex icana)前鞭毛体阶段优先表达的
基因:一个新的基因家族 A600和一个差异表达的B
- 微管基因。Northern blot 分析证实这些基因是
无鞭毛体阶段特异表达的。A600 基因预测含有
512006年第 2期 韩红玉等:抑制性消减杂交技术在寄生虫学研究中的应用
293bp开放阅读框, 在利氏曼原虫基因组中是串联
重复序列。序列分析预测: A600 基因 ORF 编码膜
结合蛋白或分泌蛋白, 在无鞭毛体分化或前吞噬溶
酶体阶段对虫体的生存起功能性作用。
为了分析柔嫩艾美耳球虫( Eimer ia tenel la)卵
囊基因的表达情况, Miska KB [ 7] 等利用 SSH 技术
对 E. tenel la 转录表达进行了分析, 从未孢子化卵
囊和孢子化卵囊转录表达富集的 cDNAs 获得了
499个 ESTs 序列, 其中, 225个克隆从孢子化卵囊
的 cDNA 中获得, 274 个克隆从未孢子化卵囊的
cDNA 中获得, 共代表 163个单一序列, 其中 64%
的克隆代表新的基因。从孢子化卵囊中获得的单一
转录大约一半也在子孢子和裂殖子中表达, 而从未
孢子化卵囊中获得的大多数( 79% )转录物在其他发
育阶段没有发现。这一结果证实了这些转录确实在
孢子化卵囊和未孢子化卵囊之间是差异表达的。
1. 2 与寄生蠕虫不同发育阶段相关的基因
旋毛虫( Tr ichinella sp ir al i s )是一个感染广泛
的寄生虫之一, 在同一宿主体内完成整个生活史, 成
虫和幼虫分别寄生于同一宿主的小肠和肌细胞内。
在感染后第 5 天, 成熟雌虫便可产生新生的幼虫。
为了了解第 5天成虫的特异性表达基因, Fu BQ [ 8]
等以肌肉中幼虫和第 3天的成虫为对照组,以第 5
天的成虫为试验组, 采用 SSH 技术筛选了一个 5天
旋毛虫的阶段特异性 cDNA 片段, 并用这一片段作
探针筛选 cDN A文库,分离了一个编码推定的旋毛
虫角质膜胶原 cDNA 片段, 该片段含有一个编码
343个氨基酸的开放阅读框, 分子量为 35. 1KDa。
同源性比较发现与其他线虫角质膜胶原有 47%的
同源性。基因组 DNA Southern blo t 分析显示: 这
一基因在旋毛虫基因组中是单拷贝基因。Mak CH
等[ 9]通过利用 SSH 技术成功鉴定了旋毛虫感染性
阶段幼虫的三个热诱导基因。反向 Northern blot-
t ing 分析显示: 25 个克隆中有 19个克隆在感染性
阶段幼虫受到热激后是差异转录的。序列分析显示
有12个差异基因,其中3个基因与组蛋白 H3、H2B
和翻译控制肿瘤蛋白( T CTP)同源。通过 RACE 方
法获得了一个 0. 6kb的组蛋白 cDNA 片段,该片段
含有一个编码 136个氨基酸的开放阅读框, 同源性
比较发现与来自果蝇的基因有 94%的同源性。半
定量 RT-PCR显示:热激后组蛋白 H3、组蛋白 H2B
和 TCT P 表达水平分别增加 4. 8、27 和 5. 7 倍。
Nor thern 分析证实组蛋白 H3、组蛋白 H2B 和
T CTP 转录上调。结果显示这些应激蛋白在寄生虫
暴露于不利的宿主因素后对维持寄生虫本身可能起
到积极的作用。
植物寄生线虫是一类重要的病原微生物,其食
管腺细胞分泌的蛋白在线虫入侵和宿主防御抑制过
程中起重要作用, 为了弄清楚植物线虫食管腺细胞
表达分泌蛋白的基因, Gao B[ 10] 等采用 SSH 技术以
大豆包囊线虫( H eterodera gly cines )食管腺细胞和
肠内区为材料分离了在寄生阶段腺细胞中优先表达
的基因。从消减 cDNA文库中鉴定了 23个单一的
cDNA 序列,与大豆包囊线虫的基因组 DNA 进行
Southern blots, 再通过筛选一个腺细胞长距离 PCR
cDNA 文库获得 21 个克隆的全长 cDNA 。信号肽
推测 10个克隆的预知蛋白为分泌蛋白,其中 8个蛋
白是细胞外分泌的, 1 个是核分泌的, 1 个定位于细
胞质膜上。原位杂交显示: 预测的 8 个细胞外克隆
有 4 个在大豆包囊线虫背腺细胞中特异表达, 1个
在亚腹腺细胞中特异表达, 3个在肠道中特异表达;
1个定位于细胞核的克隆和定位于细胞质膜的克隆
分别在亚腹腺细胞和背腺细胞中表达。克隆编码食
管腺细胞分泌蛋白基因对理解植物线虫寄生的分子
基础是非常重要的。H uang GZ[ 11] 等从一个南方根
瘤线虫 ( Meloidogyne incog ni ta )食管腺细胞消减
cDNA文库中鉴定了 2个分支酸变位酶( CM )基因,
这两个基因可能在南方根瘤线虫的入侵、入侵位点
的选择或大豆防御抑制过程中发挥作用。这些酶
(命名为 M I-CM-1 和 MI-CM-2) 含有氨基端信号
肽,与爪哇根结线虫( Meloidogyne j avanica )和细
菌中的分支酸变位酶有明显的相似性。原位杂交显
示: Mi-cm-1和 M i-cm-2 的转录在南方根瘤线虫的
2个亚腹食管腺细胞中特异性聚集。RT-PCR分析
证实:这两个酶在早期寄生幼虫阶段是高丰度转录
的,而在线虫的后期寄生阶段 M i-cm-1 转录丰度
低、Mi-cm-2的转录没有检测到。Southern blot 分
析揭示:这些 CM 基因是根瘤线虫一个小的多基因
家族成员。CM s的广泛存在表明: 这个多功能酶在
调控植物寄生线虫寄生机制中可能是一个重要因
52 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 2期
子。
吸虫孢蚴在中间宿主软体动物体内的发育对宿
主的感染非常重要,目前对孢蚴生物学的了解主要
依赖于体外培养, 为了获得早期孢蚴的转录模式,
Now ak TS [ 12]等运用 SSH 技术鉴定了可能在棘口
吸虫( Echinostoma paraensei )培养的孢蚴中表达上
调的 69个单一 EST 序列,同源性比较发现有 70%
以上序列没有同源序列, 但比较结果显示一个编码
一氧化氮合成酶抑制剂的转录可能在宿主的防御机
制中起保护作用。通过定量 RT-PCR 对 6 个转录
中的 3个进行检测,发现体外培养的孢蚴与体内孢
蚴的转录速度相比明显减少。另外证实, 6 个转录
中有 5个在整个生活史中的表达是有明显变化的:
在早期软体动物体内的发育阶段或钻入螺体时的自
由生活阶段表达明显上调。
鱊头槽绦虫 ( Bothriocep halus acheilognathi )
是一种广泛寄生于草鱼体内的寄生虫。Luo HL [ 13]
等通过利用 SSH 技术分析了成熟和未成熟鱊头槽
绦虫的差异表达基因。分离鉴定了 5个与成熟鱊头
槽绦虫相关的 cDNA 片段, Northern blot 和 RT-
PCR分析证实其中 4个基因在成熟虫体中是表达
上调的。序列分析显示: 一个基因编码结构蛋白卵
壳前体; 3个基因编码与卵黄铁蛋白、钠/氢泵、mus-
cin- like pro tein同源的功能蛋白。另一个基因对鱊
头槽绦虫是特异的,编码的蛋白推测为金属结合蛋
白。
1. 3 与节肢动物发育阶段相关的基因
大中华蚤是草鱼的一个重要致病菌,为了了解
草鱼对大中华蚤感染的免疫反应, Chang MX[ 14] 等
利用 SSH 方法鉴定了当大中华蚤寄生在草鱼肝脏
和腮中时表达上调的基因。从感染的消减文库中挑
选了 122个阳性克隆进行序列分析,同源性比较结
果显示 23个基因是与免疫相关的,包括编码已知的
急性期反应物和 4个新基因:编码优势免疫 MHC-
相关多肽( SIM P)来源蛋白、TNF 受体相关因子 2
结合蛋白( T2BP)、脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白 1
前体、糖蛋白 A 重复优势区( GARP)。RT-PCR 证
实:感染后其中有 7个免疫基因是差异表达的,它们
是 GARP、A-2-巨球蛋白、MHC Ñ、C3、SIMP、T2BP
和运铁蛋白, 其中 A-2-巨球蛋白、MHC Ñ、C3、
SIMP、T2BP 在大中华蚤寄生草鱼肝脏时表达上
调,寄生于草鱼腮中时, SIM P 表达下调, 这些研究
为了解草鱼的免疫反应和进一步分析候选基因提供
了一定的基础。
Lai R[ 15] 等利用 SSH 技术和蛋白质组学等方
法从硬蜱中分离鉴定了 2个非- 阳离子防御样抗菌
多肽(命名为 Amblyomma 防御肽 1 和防御肽 2)。
从蜱的中枢神经系统差异表达 cDNA 文库中分离
到了编码防御样抗菌肽的 cDNA 克隆, cDNA 序列
推测每个前蛋白原含有 92个氨基酸残基。从饱血
雌蜱的血淋巴中纯化到了 Amblyomma 防御肽 2,
纯化的多肽显示具有抗菌活性, 能抗革兰氏阳性菌
和革兰氏阴性菌。通过鉴定发现 Amblyomma 防御
肽 1在饱血后 4天中表达上调。
2 与寄生虫抗药性产生相关基因的研究
由于寄生虫生活史复杂,控制寄生虫病,主要还
是依赖于药物防治,但寄生虫抗药性的产生,使得药
物防治寄生虫病面临严峻考验。目前, 对寄生虫抗
药性产生的机制, 还是不清楚,很多研究者希望能找
到与寄生虫抗药性产生有关的基因, 通过对其研究,
有望了解寄生虫抗药性的产生机制, 为防治寄生虫
病提供新的理论依据。在危害比较严重的血吸虫方
面, Now ak T S[ 16] 等利用 SSH 技术, 以曼氏血吸虫
( S . mansoni)感染 12h后扁卷螺的 BS90 抗性株和
敏感株为材料, 构建了一个互补的消减 cDNA 文
库。从文库中挑选了 120个克隆测序,其中代表 88
个单一的 EST 序列, 差异表达筛选表明在 88个序
列中, 有 22 个是在抗性株中差异表达的。用定量
RT-PCR对其中 4个转录本进行分析,结果与差异
表达筛选获得的结果一致,这些基因在抗性株中表
达上调, 而在敏感螺体内是表达下调的。同源性比
较,发现大多数 EST s( 71. 6% )是新序列。为了调
查扁蜷螺暴露于棘口吸虫( Echinostoma p ar aensei )
两天后的反应, Jung YH [ 17] 等运用 SSH 技术获得
了抗氧化酶- 过氧化锰歧化酶( M nSOD)的部分序
列。通过同义核酸替代方法比较了扁蜷螺敏感株
(对棘口吸虫和曼氏血吸虫都敏感)和 BS-90抗性株
(对棘口吸虫敏感而对曼氏血吸虫有抗性)过氧化锰
歧化酶( MnSOD)全长序列( 669nt)。Southern 杂交
结果显示:扁蜷螺有 1~ 4 个过氧化锰歧化酶( M n-
532006年第 2期 韩红玉等:抑制性消减杂交技术在寄生虫学研究中的应用
SOD)位点,定量 RT-PCR显示: 敏感株在感染棘口
吸虫和曼氏血吸虫后过氧化锰歧化酶( M nSOD)表
达增加;而 BS- 90 抗性株在感染棘口吸虫后 Mn-
SOD表达增加,感染曼氏血吸虫后 MnSOD表达减
少。
为了探索球虫抗药性产生的分子基础, 作者 [ 18]
等利用 SSH 技术对鸡球虫的抗药性基因进行了研
究,以遗传背景一致的柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子
化卵囊为驱动组,马杜拉霉素抗药株和地克珠利抗
药株孢子化卵囊为实验组, 构建了富含两个抗药株
差异表达基因的消减 cDNA 文库。从每个文库中
随机挑取 65个阳性克隆经斑点杂交实验,分别选择
表达量上调的 6个克隆进行序列分析和同源性比
较。结果发现: 有 4个 cDNA 片段可能是新基因片
段,与地克珠利抗药株的产生有关; 有 3个新的 cD-
NA 片段可能与马杜拉霉素抗药株的产生有关。这
些结果将为探索球虫抗药性产生及发展的分子机理
奠定了一定的基础。
贝祝春[ 19] 等以伯氏疟原虫 ( P . ber ghei ) K173
株和青蒿素抗性株为材料,利用 SSH 技术成功构建
了伯氏疟原虫青蒿素抗性相关的消减文库, 为青蒿
素类药物抗性相关基因的进一步分离鉴定和青蒿素
类药物抗性产生分子机制的深入研究奠定了基础。
田海生[ 20]等以淡色库蚊对溴氰菊酯抗药性品
系为 T ester、敏感品系为 Driver,进行正向抑制性差
减杂交;以敏感品系为 T ester, 抗性品系为 Driver,
进行反向抑制性差减杂交。分别获得了两个标准化
的 cDNA 消减文库, 其中抗性相关基因(抗性品系
高表达或特异表达)文库含 523个重组子,敏感相关
基因(敏感品系高表达或特异表达) ,这一结果为媒
介抗药性的研究提供了一定的基础。
3 与寄生虫其它方面相关基因的研究
3. 1 与寄生虫不同虫株相关的差异基因
枯氏锥虫( T ryp anosoma cruz i )是细胞内寄生
虫,能引起恰加斯病( Chagas disease) ,包括许多不
同的虫株。不同的 T . cr uz i虫株的表型差异可能是
由于特殊基因的差异表达引起的。在宿主器官内的
虫株为了适应周围的环境, 可能导致不同的临床症
状。Dost CK[ 21] 等为了鉴定 T. cr uz i不同虫株的差
异表达基因,利用 SSH 技术对 T . cr uz i不同虫株进
行了分析。分离的克隆测序后与已知 T . cruz i 基因
进行了同源性比较。获得了 6 个差异表达基因: 阶
段特异性糖蛋白( 82gp) ,与热激蛋白同源的 85KDa
蛋白, B-微管基因、己糖转运体、脱氢酶/前列腺素
F2A-合成酶和一个组织蛋白酶 B 样蛋白酶。通过
RT-PCR对这些基因的表达进行了分析, 并对 T.
cruzi不同虫株的差异表达图式进行了检测, 但在基
因表达和虫株的分类之间却没有发现特异的相关
性。
汪琦等[ 22] 采用 SSH 技术对弓形虫 ZS2株和
RH 株差异表达基因进行了研究, 分别以 RH 和
ZS2株弓形虫的 cDN A为 driver 组和 tester 组, 并从
ZS2株中扩增了差异表达基因。为以后国内外弓形
虫虫株分子差异及同源性研究提供了科学的资料。
3. 2 与寄生虫不同寄生宿主相关的基因
原虫拍琴虫( Perkinsus mar inus )是引起拍琴虫
病( Dermo )的致病菌, 拍琴虫病是东方牡蛎( Cras-
sostr ea vi rg inica)的一个致命疾病, 但对太平洋牡
蛎( Crassost rea g igas )不致病。为了了解这两种牡
蛎对拍琴虫感染后的反应, T anguy A 等 [ 23] 运用
SSH 技术鉴定了当拍琴虫攻击牡蛎血细胞和鳃的
过程中表达上调的基因。获得了 C. vi rg inica的差
异表达基因序列 107个, C. gigas 差异表达基因序
列 69 个, 其中两种牡蛎分别有 46和 37 个序列与
Genbank中的已知基因匹配。大多数序列在其他
软体动物中没有发现同源序列。筛选了涉及免疫系
统、细胞通讯、蛋白调控和转录、细胞周期、呼吸链和
细胞骨架的 19 个基因进行半定量 PCR分析,结果
显示:在两种牡蛎受到拍琴虫感染时这些基因都过
量表达, 只是在表达量和表达时间上存在差异。受
到拍琴虫感染后, 两种牡蛎之间的反应主要表现在
基因表达的一些差异上, 这些结果为进一步分析提
供了候选基因和通路。
许晓春等 [ 24以斯氏按蚊- 约氏疟原虫为实验模
型,分别将刺叮约氏疟原虫( P lasmod ium yoel ii )感
染鼠血和正常鼠血后 24h 的饱血斯氏按蚊作为
T ester 组和 Driver 组, 利用 SSH 技术建立一个 T
组特异表达基因增高的差减 cDNA 文库。将此差
减文库分别与 T 组和 D组的 cDNAs混合探针作斑
点杂交,筛选出差异表达基因,测序并进行同源性比
54 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 2期
较后发现: 相对于 D组的 T 组差异表达基因得到有
效富集, 58个重组克隆中有 24个表达增高,阳性率
为 41. 4%。所代表的 23 个基因搜索结果显示, 12
个与已知功能的基因同源, 4 个与未知功能的基因
同源, 7个为新发现的基因;其中 9个与 LPS 诱导的
冈比亚按蚊免疫反应性细胞系 EST 同源,占39. 1%
( 9/ 23)。这些结果显示蚊虫对疟原虫感染的反应涉
及多种生化途径及机制, 尤其与天然免疫系统和能
量代谢关系密切。
3. 3 与寄生虫性别相关的基因
为了筛选线虫的性别特异性基因, 为线虫乃至
寄生虫的性别控制提供新的工具, 吴绍强等[ 25] 以猪
蛔虫为材料,利用 SSH 技术构建了猪蛔虫雌、雄虫
性别差异表达的消减 cDNA 文库, 随机从两个消减
文库中各挑取 25个克隆进行测序及同源性分析, 发
现 25个雄虫 EST s中有 20个是已知的, 5 个是新
的; 25个雌虫 EST s中有 11个已知的,其余 8个可
能为新基因。通过 BLAST 分析发现:在构建的雄
虫特异性消减文库中, 主要的精子蛋白( M SP)基因
的 EST 丰度高,而在雌虫特异性消减文库中, 卵黄
蛋白原( VIT )基因的 EST 丰度高。这些结果为研
究寄生线虫性别特异基因的功能及性别调控的机理
奠定了一定的基础,从而为采用性别控制的方法来
防治寄生虫病迈出了坚实的一步。
4 展望
随着分子生物学技术的不断发展和完善, 将会
涌现出越来越多的新方法和新技术, SSH 技术与这
些新方法和新技术的结合,将使 SSH 技术进一步改
进和提高,在分离差异表达基因、发现新基因以及研
究基因功能等方面发挥更大的作用。
SSH 技术在寄生虫学上的应用还有待进一步
提高和扩展。SSH 方法作为研究差异表达基因的
成熟技术, 在寄生虫上的应用已经拉开了序幕。将
来,特别是运用 SSH 技术寻找寄生虫不同生活史阶
段的特殊差异表达基因, 研究基因结构和功能关系,
找出与寄生虫生长发育密切相关的基因; 或者找出
寄生虫用药前后的差异表达基因,并研究其抗药性
的产生机制,将为防治寄生虫病提供一定的理论依
据。
参 考 文 献
1 孙春晓,于常海.生理科学进展, 2000, 31( 1) : 35~ 42.
2 Diatch enk o L, Lau YF, C ampb ell AP, et al . Proc Nat l Acad Sci
U S A, 1996, 11, 93( 12) : 6025~ 6030.
3 Matusch ew ski K, Ross J, Brow n SM, et al. J Biol Ch em, 2002 ,
277( 44) : 41948~ 53.
4 Dessens JT , M argos G, Rodriguez MC, et al . Parasitol Today,
2000, 16( 8) : 354~ 356.
5 Kaiser K, M atuschew ski K, Cam argo N, et al . Mol M icrobiol ,
2004, 51( 5) : 1221~ 1232.
6 Bel lat in JA, Murray AS , Zhao M, et al . E xp Paras itol , 2002 ,
100( 1) : 44~ 53.
7 Miska KB, Fet terer RH , Barf ield RC. J Paras itol , 2004 , 90( 6 ) :
1245~ 1252.
8 Fu BQ, Liu MY, Kapel CM, et al . Vet Parasitol, 2005, 132 ( 1-
2) : 31~ 35.
9 Mak CH , Su KW, Ko RC. Paras itol, 2001 , 123( Pt 3 ) : 293~
300.
10 Gao B, Allen R, M aier T , et al . Mol Plant M icrobe Interact ,
2001 , 14( 10) : 1247~ 1254.
11 H uan g GZ, Don g RH, Allen R, et al . M olecu lar Plant Pathol-
ogy, 2005, 6( 1) : 1~ 23 .
12 Now ak T S, Loker ES . Ex perim ental Parasitol , 2005, 109( 2 ) :
94~ 105.
13 Luo HL, Nie P, Ch ang MX, et al. Paras itol Res, 2004, 94( 4) :
265~ 274.
14 Chang MX, Nie P, Liu GY, et al. Parasitol Res, 2005, 96( 4 ) :
224~ 229.
15 Lai R, Lomas LO, Jonczy J, et al . Biochem J, 2004 , 379( Pt 3) :
681~ 685.
16 Now ak T S, Woodards AC, Jun g Y, et al . J Parasitol, 2004, 90
( 5) : 1034~ 1040.
17 Ju ng Y, Now ak T S, Zh ang SM, et al. J Invertebr Path ol , 2005,
90( 1) : 59~ 63.
18 韩红玉, 赵其平, 等.中国农业科学, 2005, 38( 8) : 1712~ 1716.
19 贝祝春,王京燕. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2004, 22( 3 ) :
139~ 143.
20 田海生,马磊,等.中国血吸虫病防治杂志, 2001, 13( 2) : 75~ 78.
21 Dos t CK, Sar aiva J, Mones i N, et al . Parasitol Res, 2004, 94
( 2) : 134~ 140.
22 汪琦,陈观今,等.生命科学研究, 2003, 7( 3) : 236~ 238.
23 T angu y A, Guo XM, Ford SE. Gene, 2004, 338( 1) : 121~ 131.
24 徐晓春, 瞿逢伊, 等. 中国寄生虫学与寄生虫杂志, 2001, 19
( 6) : 325~ 329.
25 吴绍强, 邹丰才,等.中国农业科学, 2005, 38( 5) : 1040~ 1045.
552006年第 2期 韩红玉等:抑制性消减杂交技术在寄生虫学研究中的应用