全 文 ： 综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年增刊
植物体细胞胚胎发生及其相关应答基因的研究进展
张蕾1韩素英 2张守攻 1齐力旺 1*
( 1中国林业科学研究院林业研究所细胞生物学实验室,北京 100091;
2中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所,北京 100091 )
摘 要: 体细胞胚胎发生途径不仅是植物大规模克隆繁殖的重要途径, 也是研究从单细胞到整体植株发育
全过程的理想试验体系。植物体细胞胚胎发生的研究已经取得了很大的进展,但是也依然存在许多问题。根据近
年来的相关研究报道, 简述植物体细胞胚胎发生及此过程中相关应答基因的研究概况, 探讨植物体细胞胚胎发生
的生理生化基础, 并对今后应该加强研究的关键问题提出了自己的看法。
关键词: 植物 体细胞胚发生 生理生化基础 应答基因
Advances in Research in P lant Somatic Embryogenesis
and the Relational Responding Genes
Zhang Le i
1 H an Suy ing2 Zhang Shougong1 Q i L iw ang1*
( 1Laboratry of Cell B io logy, The R esearch Institute of Forestry, CAF, B eijing 100091;
2Institute of Forest Ecology, Environm ent and P rotection, CAF, Beijing 100091)
Abstrac:t P lant som atic em bryogenes is is no t on ly am a in m ethod for the rap id propagation w ith large sca le, but also
a idea l exper imenta l system fo r study ing the developm ent from a s ing le cell to a w ho le plantlet. A great progress has been
m ade in the study o f plan t soma tic embryogenesis, but the re still arem any prob lem s to be so lved. In this rev iew, the re-
search in plant som a tic em bryogenes is and the re la tiona l respond ing genes we re introduced. And the phys io log ica l and b io-
chem ica l bases w ere discussed. In addition, the prob lem s wh ich should be em phasized in the fu ture were a lso prov ided.
Key words: P lant Soma tic embryogenesis Physio log ica l and b iochem ica l bases Respond ing genes
作者简介:张蕾 ( 1980-) ,女,辽宁法库人,在读博士,研究方向:林木分子生物学
通讯作者:齐力旺, lw q@i ma i.l forestry. ac. cn
植物体细胞胚胎发生是细胞工程中植株再生的
重要途径之一,对于那些繁殖周期相对较长的植物
尤其是针叶树种具有极大的应用价值。通过体细胞
胚胎发生研究细胞起源和发育调控, 对阐明植物有
性胚及无性胚的发生机制具有重大意义 [ 1]。同时
这一发育途径也为研究从单细胞到整体植株发育的
全过程,特别是关于植物细胞全能性表达的分子机
理提供了一种理想的实验体系, 具有重大的理论意
义和实践意义。
经过几十年的研究,到目前为止已有多种植物通
过体细胞胚胎发生方式获得了再生植株。在林木上,
体细胞胚胎发生的研究也有了很大进展,特别在扦插
生根困难的针叶树种上取得了令人瞩目的成绩。但
是,在离体条件下, 植物体细胞胚胎的发生和发育仍
然存在许多问题,很多植物尤其是落叶松等针叶树种
体胚发生相对困难、质量不高、发生数量低而且难以
同步化,这些问题都是限制通过体细胞胚胎发生对植
物进行大量繁殖和遗传转化的瓶颈问题。
近年来,许多学者开始致力于相关方面的研究,
有关植物体细胞胚胎发生和发育的研究报道越来越
多,并且随着分子生物学技术的不断发展,逐渐向基
因分子水平深入。本文根据近年来的相关研究, 就
植物体细胞胚胎发生及此过程中相关应答基因的研
究概况综述如下:
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2006年增刊
1植物体细胞胚胎发生的研究概况
1. 1草本植物的研究概况
植物体细胞胚胎发生的研究最早始于 19世纪
40年代末,首先在胡萝卜上获得成功, 且研究也最
为完善。 1958年 Stew ard等发现, 离体条件下胡萝
卜 (Daucucus caro ta L. )根细胞可产生一种与合子胚
类似的能够发育成完整植株的胚状结构, 揭开了植
物体细胞胚胎研究的序幕 [ 2]。此后, 多种植物均通
过离体培养获得了体细胞胚,其中多数为草本植物。
除胡萝卜外,拟南芥以及禾谷类作物中的小麦和水
稻研究的也相对较多 [ 3~ 6] , 现已成为体细胞胚胎发
生和发育研究的模式植物。此外,玉米、大豆、棉花
等许多草本植物也成功地诱导了体胚, 并获得了再
生植株 [ 7~ 9]。
1. 2木本植物的研究概况
在林木上,体细胞胚胎发生的研究始于上世纪
70年代后期,在 80年代后期得到了迅猛发展, 主要
是在针叶树种上取得了很大的突破。Durzan等首
次报道了班克松 (P inus banksiana )、花旗松 (P seud-
otsugam enziesii )和白云杉 ( P icea g lauca )胚类似结
构的相关研究 [ 10]。仅仅几年以后,杉属植物即通过
未成熟胚诱导的胚性组织,获得了可发育形成完整
植株的形态学和生理上成熟的体细胞胚 [ 11, 12]。这
些最初的成功很快吸引了其他学者们的注意, 此后,
一系列针叶树种通过组织培养相继获得了体细胞
胚。中国林科院齐力旺等首次在华北落叶松 (Larix
p rincip is- rupprechtii )体细胞胚发生方面作了研究。
以未成熟胚作为外植体,采用 311-A最优回归设计,
最终确定了华北落叶松体细胞胚诱导的最佳培养条
件,建立了体细胞胚胎发生及再生体系,为研究植物
细胞的分化、发育、全能性表达以及品种改良提供了
理想的实验体系 [ 13]。吕守芳等筛选出日本落叶松
体细胞胚最佳诱导培养基,并以未成熟胚为外植体
诱导获得了高质量的体细胞胚 [ 14 ]。落叶松体胚发
生技术也已在胚性细胞系的大规模增殖培养、超低
温保存、原生质体培养和基因转化上得到了广泛的
应用 [ 15, 16]。此外, H arald等以高山冷杉 (Abies lasio-
carpa)未成熟合子胚为外植体, 成功地诱导了体
胚 [ 17]。席梦利等以杉木 (Cunningham ia lanceolata )
子叶和下胚轴为起始外植体,确定了杉木体细胞胚
诱导的最佳条件 [ 18]。在过去的几十年中, 国内外已
从冷杉属 ( Abies )、落叶松属 ( Larix )、云 杉属
(P ciea )、松属 (P inu s)等的 40余种针叶树中获得了
体细胞胚。
除针叶树种外, 体细胞胚胎发生技术在枸杞
( Ly cium barbarum )、杨树 (Populus L. )、檀香 ( Santa-
lum album L. )等许多树种中也获得了成功 [ 19~ 21 ]。
2植物体细胞胚胎发生的生理生化基础
2. 1贮藏物质的积累
在植物体细胞胚分化过程中, 往往伴随着淀粉、
脂类、碳水化合物以及蛋白等储藏物质的积累。
在体细胞胚胎发生和成熟阶段, 培养基中的
ABA能促进体胚中营养物质含量的增加,满足其发
育和成熟的需要。据报道, ABA可能参与了碳水化
合物的代谢,在体细胞胚发育过程中促进蛋白、淀粉
以及脂肪等物质的合成 [ 22]。 Beardmore与 Charest
在研究黒云杉体细胞胚蛋白的合成情况时也发现,
ABA的加入可导致其成熟胚内胚性蛋白的增加, 并
分离出 7个储藏蛋白 [ 23]。Cailloux等在三叶胶 (H e-
via brasiliensis)体细胞胚胎发生过程中发现,其鱼雷
胚中三酸甘油脂的含量明显提高 [ 24]。也有研究表
明,在针叶树体细胞胚胎分化过程中,贮藏蛋白和晚
期胚胎中后期的丰富蛋白 ( la te embryogenesis abun-
dant protein, LEA )大量合成,胚胎发生的特异性蛋
白、脂类和碳水化合物也大量积累 [ 25, 26 ]。
齐力旺等对落叶松不同类型的胚性愈伤组织和
非胚性愈伤组织的生理生化差异进行了研究, 发现
质地硬的非胚性愈伤组织中游离氨基酸含量为胚性
愈伤组织的 2倍以上, 经 ABA处理后,胚性愈伤组
织中多糖及邻苯二酚的含量急剧升高;胚性愈伤组
织中精胺的含量要低于非胚性愈伤组织, 精氨酸为
多胺合成的前体,而多胺能够促进体细胞胚的发生,
落叶松非胚性愈伤组织中精氨酸含量高, 可能与多
胺的合成及体细胞胚发生关系密切。落叶松胚性愈
伤组织经 ABA及 PEG诱导后, 表面形成球状的原
胚,这一时期淀粉含量也急剧上升 [ 27]。
淀粉、脂类和蛋白等营养物质的积累为体细胞
胚的形成和发育提供了必要条件。
2. 2内源 ABA含量的变化
许多相关研究皆表明在体细胞胚分化过程中内
2
2006年增刊 张蕾等: 植物体细胞胚胎发生及其相关应答基因的研究进展
源激素在接受诱导的刺激后, 有含量升高的现
象 [ 28, 29 ] ,说明外源植物生长调节剂的诱导可能导致
植物内源激素水平的变化,进而启动一系列的信号
转导以及基因表达等过程,以利于体细胞胚的发生。
A rnod与 Hakman在研究 ABA对挪威云杉 (P i-
cea abies)体细胞胚发育的调节作用时发现, 挪威云
杉体细胞胚成熟过程中内源 ABA的浓度会迅速提
高 [ 30]。在胡萝卜体细胞胚形成过程中, 培养第 10d
时,形成胚的细胞中内源 ABA的含量即上升到了最
高值, 而不能形成胚的细胞内 ABA的含量直到第
13d时才达到高峰 [ 31]。 Beardmore与 Charest也发
现,在加入外源 ABA后黒云杉 (P icea mariana )成熟
体细胞胚中内源 ABA 含量增加 [ 23]。Dunstan与
Boch用 ELISA分析白云杉 (P icea g lauca )体细胞胚
成熟期内源 ABA含量变化时发现,随施用外源 ABA
浓度 ( 12~ 60mmol /L )的增高, 内源 ABA的水平成
比例地提高, 高浓度 ABA在成熟胚培养的 6 ~ 8周
内,前 12d对胚成熟有效, 通过周期性地加入 ABA
能延长其作用时间 [ 32 ]。Dong等也曾检测到悬浮培
养的白云杉 (P icea glauca )体细胞胚成熟时, 内源
ABA和 mRNA的含量发生了很大的变化 [ 33 ]。在三
叶胶 (H evea brasiliensis )体细胞胚发育过程中, 加入
10
- 5
mo l/L的外源 ABA后,其体细胞胚内源 ABA的
水平也有了提高 [ 34]。崔凯荣等在研究枸杞体细胞
胚发生和发育过程中内源 ABA含量的变化时发现,
在外源 ABA诱导下胚性细胞启动分化期、胚性细胞
大量形成期以及球形胚形成期内源 ABA的含量均
显著升高, 表明外源 ABA与内源 ABA对体细胞胚
的发生起着相互调节和促进的作用 [ 19 ]。
2. 3外源激素对植物体细胞胚分化的影响
体细胞胚胎的发生与 ABA 的积累密切相
关 [ 35]。一些研究结果表明, ABA在植物体细胞胚发
生和发育过程中起着重要的作用 [ 36]。 Ra jasekaran
等发现在培养基中加入一定浓度的 ABA, 可促进象
草 (P ennisetum purpureum )叶胚性愈伤组织的形成和
体细胞胚的发生 [ 37]。杨映根等在研究青杄云杉
(P icea w ilsonii)体细胞胚分化时发现, 青杄愈伤组
织在无 ABA的培养基上不能产生体细胞胚, 而将其
转入附加 1mg /L ABA的培养基中, 3个月后即能分
化出大量子叶期体细胞胚 [ 38]。单独使用 ABA可直
接诱导体胚的发生 [ 39, 40]。范国强等在研究悬铃木
(P la tanus acerifolia )叶片体细胞胚发生及植株再生
时发现,在WPM培养基中附加 0. 5mg /L的 ABA可
促进由叶片诱导出的胚性愈伤组织产生体细胞
胚 [ 41]。
此外, ABA在针叶树体细胞胚发生特别是成熟
过程中也具有极为重要的作用 [ 25]。 Salopek等的研
究表明, ABA能够促进塞尔维亚云杉 (P icea omori-
ka)体细胞胚的成熟 [ 42]。杨金玲、F ilonova等先后证
明 ABA能明显地促进白杄 (P icea mey eri )和挪威云
杉体细胞胚成熟 [ 43, 44]。
ABA不仅能够促进体胚分化, 还能提高体胚的
质量和正常胚的发生频率以及同步化程度。有研究
表明, ABA能降低培养基中腐胺的水平, 进而抑制
体细胞过早萌发,增加贮藏蛋白的含量,提高体细胞
胚的质量 [ 45 ]。在培养基中加入 0. 2mg /L 的 ABA,
可提高玉米正常胚的百分率 [ 46]。Robert等报道, 同
时加入 ABA和 IBA后,云杉成熟胚的数量和体细胞
胚的同步化程度均有提高 [ 47]。
2, 4-D也是诱导体细胞胚胎发生的重要激素,
它是胚性感受态表达的重要因子。高浓度的 2, 4-
D、BA和 KT组合有利于胚性愈伤组织的诱导,但不
利于后期原胚的形成, 如果长时间处于高浓度 2, 4-
D的培养基中, 易造成体细胞胚成熟能力的丧
失 [ 48]。
外源激素的浓度是影响体细胞胚发生的重要因
素,体细胞胚的萌发频率与外源激素的浓度密切相
关。杨金玲等在研究白杄云杉体细胞胚发生时发
现,分化培养基中的 ABA浓度是影响其体胚发生的
关键因素。无 ABA诱导时, 没有胚性愈伤组织分
化;随分化培养基中 ABA浓度的逐渐升高, 体细胞
胚的分化率也逐渐提高, 当 ABA浓度在 2~ 8mg /L
时分化率明显提高, 且体细胞胚发育正常; 但当
ABA浓度达到 10mg /L时则不利于其进一步发育和
成熟 [ 43 ]。不同的植物对外源激素的需求不同, 但总
的说来,无论是对于愈伤组织的增值,还是对体细胞
胚的分化,适宜低浓度的激素通常会起到促进作用,
而过高浓度则可能会对体细胞胚的进一步发育产生
不利的影响。总之,外源激素的最佳使用浓度与植
物的种类和基因型直接相关。
3
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2006年增刊
3植物体细胞胚发生过程中相关应答基因
的研究概况
植物体细胞胚的发生需要许多基因复杂而有序
的表达,胚性细胞的分化和发育,是相应基因按顺序
表达的结果。在适宜的条件下, 胚性细胞中的某些
细胞能够发育成体细胞胚,这个发育过程往往包含
着细胞内特异基因的选择性表达。
ABA是影响体细胞胚分化的关键物质, 大量实
验表明, ABA能激活某些植物体细胞胚发生的特异
基因, 进而大量合成与体细胞胚分化相关的蛋白,如
贮藏蛋白、胚胎特异性蛋白以及与胚胎成熟有关的
胚胎发生晚期丰富表达的 ( Late embryogenesis-
aboundant LEA )蛋白等等 [ 47, 49]。 Em蛋白属晚期胚
胎丰富蛋白 ( LEA ) , 是一类胚胎特异表达蛋白, 由
Em基因编码, Em基因是一类典型的 ABA调节基
因 [ 50]。LEA蛋白最早从小麦胚胎中鉴定获得 [ 5 ]。
此后, 又陆续从玉米 [ 7]、棉花 [ 51, 52 ]、拟南芥 [ 3 ]、水
稻 [ 6, 53]和大麦 [ 54 ]等植物中分离到了许多 Em-like
cDNA s。
除 Em基因外, 其他胚胎特异表达或与体细胞
胚发生相关的基因也已被分离和克隆。 1987年,
Cho i等从胡萝卜体细胞胚发生体系中分离出了胚
胎特异 RNA s的 cDNA克隆, 并对 cDNA8相关的
DC 8基因和 cDNA59相关的 DC 59基因进行了深入
研究。DC 8基因和 DC 59基因均为单拷贝, DC 8基
因的产物与 LEA蛋白同源, 而 DC 59基因与玉米脂
质体膜蛋白基因 L3高度同源 [ 55]。在胡萝卜体细胞
胚发生过程中,经 ABA诱导后 DC 8基因和 DC 59的
mRNA水平均会提高 [ 56, 57] ,说明 ABA可在转录水平
上对基因进行调控。Mundy等的研究表明, ABA是
先与靶细胞效应部位的蛋白因子或受体蛋白结合,
再通过胞间第二信使传递信号, 使反式作用因子与
顺式作用元件结合, 从而在转录水平上调控基因的
表达 [ 36]。 Schm idt等发现, SEAK ( somatic embryogen-
esis recepyor kinase )基因可在胡萝卜胚性细胞中表
达,而在非胚性细胞中则不表达, 表明 SEAK 基因与
细胞胚性的获得有关 [ 58]。中国科学院发育生物学
研究所刁丰秋等利用改进的 cDNA RDA得到了在
调控时期特异表达的 LEA基因片段和在解调控 12h
特异表达的 D naJ和木质葡聚糖内转移糖基化酶的
基因片段 [ 59 ]。通过筛选 cDNA文库, 首次从胡萝卜
中获得了 D naJ的同源基因 D cJ1,该基因在根中特
异表达,其表达活性与胡萝卜体细胞胚根的早期发
育存在着明显的相关性 [ 60 ]。林慧馨等运用改进的
减法杂交技术分离了到胡萝卜 po ly( A )结合蛋白基
因 D cPAB基因,该基因在胡萝卜体细胞胚中特异性
表达 [ 61]。
此外, Colorado等在研究鹰嘴豆体细胞胚发生
时发现了三种特异的 cDNA, 经 mRNA体外翻译和
Northern印迹分析, 证明这三个 cDNA克隆的表达
与体细胞胚的成熟有关 [ 62 ]。
在林木上, Dong等发现在白云杉体细胞胚发育
过程中子叶胚中有特异性蛋白形成,显然是体细胞
胚发育晚期基因表达的产物。利用双向电泳对体细
胞胚成熟过程中相关蛋白的合成和变化进行追踪,
在前 21d内观察到了相关基因的表达。他们成功地
从白云杉子叶胚中分离到了 28个 cDNA,其中约有
30%的 cDNA的表达受 ABA调节。随后,又从白云
杉子叶胚 cDNA文库中筛选到了 5个 ABA效应 cD-
NA ( ABA-responsive cDNA ) PgEMB 5、12、14、15、
23。经预测,其中 PgEMB 12、14、15编码的蛋白与 3
个胚胎中 LEA同源 [ 26, 63, 64]。 Staso lla等发现, 在白
云杉体现胞胚发育过程中 2 000多个处于转录水平
的基因中有 200多个在胚胎发生的早期有不同程度
的表达 [ 65]。Chattha i等从花旗松 (P seudotsuga menz-
iesii)体细胞胚 cDNA文库中分离到了一个可被
ABA诱导的新基因 PM 2. 1, 对其氨基酸序列进行预
测,结果表明该基因编码的是一种 MT-like蛋白 [ 66]。
Sharon等从辐射松 (P inus rad iate )发育早期的胚胎
组织 cDNA文库中筛选到了胚胎特异表达的六个基
因家族 [ 67]。Mara等首次以松树体细胞胚和合子胚
作为模式体系,分析了两种谷氨酸合成酶 (GS )基因
的胚胎特异表达方式。发现 GS1a基因在合子胚中
不表达,表明萌发开始于成熟的体细胞胚; 而 GS1b
基因主要在合子胚和体细胞胚的前形成层细胞中转
录,该基因的表达水平与体细胞胚的质量密切相
关 [ 68]。
由于研究的时间较短, 人们对于体细胞胚发生
过程中基因表达调控的认识仍需进一步研究和探
讨。
4
2006年增刊 张蕾等: 植物体细胞胚胎发生及其相关应答基因的研究进展
4展望
植物体细胞胚胎发生作为一种极具利用价值的
繁殖技术,也为研究胚胎发育过程中发生的生物学
事件提供了良好的模式体系。从体细胞转变为胚性
细胞, 再由胚性细胞分化成体细胞胚是一个十分复
杂的过程,因此, 在体细胞胚发生的全能性表达过程
中,仅仅局限于形态学和细胞胚胎学的直观描述是
不够的,应该在这些研究的基础上,结合细胞胚胎学
过程及体细胞胚发育过程中的生理生化机理,探讨
体细胞胚发生的分子基础。近年来, 在植物体细胞
胚发生方面的研究已有了一定的进展, 但是对体细
胞胚胎发生的分子调控和分子机理的研究仍然相对
薄弱。虽然已有多种与体细胞胚发生和发育相关的
应答基因被克隆、鉴定和分离, 但迄今仍不清楚这些
基因究竟是如何进行表达和调控的。利用植物体细
胞胚发生的发育途径, 深入了解体细胞胚发生的分
子机理,不仅有助了解 ABA等关键因子如何影响植
物体细胞胚的发生和发育,解决体细胞胚分化过程
中的瓶颈问题,获得高质量同步化的体细胞胚,也对
最终揭示体细胞胚发生这一特定细胞分化过程的本
质,破解生命活动和个体发育谜团具有极其重大的
意义, 是今后应该着重加强研究的关键问题。在这
一领域取得突破,必将会大大促进植物体细胞胚发
生技术的发展和应用, 使其在植物的大规模繁殖以
及通过转基因技术进行品种改良等方面发挥更大的
作用, 为我国农林业的发展做出更大的贡献。
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