全 文 ：MicroRNA研究进展*
何晨 谭军 陈薇 聂能
(重庆邮电学院生物信息实验室,重庆 400065)
摘 要: 在多细胞生物的基因组中都存在一类非编码 RNA 基因,能够产生长度约为 22 个核苷酸的小分子
RNA, 称为 micr oRNA( miRNA) ,具有调节其他基因表达活性的功能。miRNA 的发现, 为我们理解复杂的基因调
节网络开辟了新的空间。本文概述了 miRNA 的产生过程、转录抑制机理、研究并预测 miRNA 的方法等。
关键词: miRNA RNAi siRNA dsRNA RISC
The Progress of MicroRNA Research
He Chen Tan Jun Chen Wei N ie N eng
( Chong qing Univ er sit y of P ost s and T elecommunicat ions ( CQUPT ) , Chong qing 400065)
Abstract: MicroRNAs a re family of small, noncoding RNA that can regulate expression of ot her genes. The
discovery of miRNA open out a new dimension on our under st anding of g ene r egulation netw orks. T his paper is fo
cused on the biog enesis of miRNAs, mechanism and function, as well as the methods o f research and for ecast.
Key words: miRNA RNAi siRNA dsRNA RISC
miRNA 是指长度约21~ 25个核苷酸的小型非
编码 RNA家族。这些小 RNA,能够识别特定的目
标 mRNA , 并在转录后水平负调控基因的表现。
miRNA 家族的成员作为小分子短暂 RNA ( stR
NA )在研究秀丽线虫发育转变过程中发现的。经过
研究发现 miRNA是 stRNA 中的一个大家族, 并且
很容易在线虫、苍蝇、植物和哺乳动物中发现。
miRNA 的功能并不局限于发育调节, 相反 miRNA
有着不同的表现形式, 还可能控制着生长发育和生
理机能的很多方面。随着大量 miRNA 在其他物种
发现,其广泛存在与进化保守性也暗示着它在生命
活动中必不可少的调节作用, 对基因表达、生长发育
和行为等都具有十分广泛和深远的影响。
1 miRNA的发现
1993 年 Lee 等在研究线虫发育缺陷时发现
lin4。不编码蛋白质, 但能时序调控秀丽线虫胚胎
后期发育的基因。l in4 基因的突变使得线虫能够
蜕皮,但只能停留在 L1,不能发育为成虫。l in4 产
生一个 22核苷酸的 RNA, 和 lin14 基因 3U TR
( 3端非编码区)上 7 段保守的靶位部分互补。lin
14编码一个核内蛋白,负责幼虫从 L1阶段到 L2阶
段的细胞分裂。LIN14蛋白的负调节要求 mRNA
具有一个完整的 3UT R, 具有完整 3UT R 的 lin
14 mRN A 才能和 lin4 作用, 从而抑制 L IN14蛋
白质的表达。通过类似的机制, l in4 也负调控 lin
28 的转录, l in28 是一个冷休克域蛋白, 它触发从
L2到 L3阶段的发育转变。与 l in14 相比, l in28
和 l in4 的结合位置更少, 可能由于同 l in4 的作用
较弱,导致转录抑制延迟。
l in4 和转录抑制功能的发现, 暗示在发育过程
中基因调控的一个新机制。在秀丽线虫身上发现的
第二个 miRNA基因 l et7 是一个异时性开关基因,
其靶基因控制着线虫从 L4 到成虫阶段的发育转
变。与 l in4 的作用原理相似, l et7 通过识别、结合
l in41 和 hbl1( lin57)的 3UT R实现转录抑制[ 1]。
l et7 是研究通过 miRN A调整发育的另一个实例,
收稿日期: 20050420
* 基金项目:重邮博士启动基金( A200466)
作者简介:何晨 ( 1980) ,男,山西运城人,硕士研究生,主要研究方向为生物信息学
谭军 ( 1972) ,男,重庆人,博士后,教授,主要研究方向比较基因组学
生物技术通报
综述与专论 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第 1期
说明 miRNA存在于线虫其其他物种的可能性。
lin41 和 l et7 的同源基因在多细胞动物进化
保守。在软体动物、海胆、苍蝇,老鼠和人类基因组
中很容易通过序列比对发现。说明 miRNA 广泛存
在,也暗示了 miRNA 在发育过程中的重要作用。
2 miRNA的产生过程
动物 miRNA成熟需要经历两个过程。首先是
初期 miRNA 复合体( primiRNA) 被加工成的 70
个核苷酸的 miRNA 前体 ( premiRNA )。然后
miRNA 前体在 Dicer 酶、AT P 和解旋酶的共同作
用下分裂成 21~ 25bp的成熟 miRNA。
miRNA 成熟过程中的连续分裂, 需要两个
RNaseIII: Drosha 和 Dicer (图 1) [ 2] 催化, 两者都是
特定 dsRNA 的 RNA 内切酶。Drosha 主要存在于
细胞核内, 具有一个 dsRN A 识别结构域和两个
RNaseIII结构模体和一个未知功能的末端。Dro
sha不管 primiRNA 序列和结构如何, 都会将其分
裂成 70bp 的 premiRNA。premiRNA 是茎环结
构。Drosha切割 premiRNA 的机理尚不清楚 [ 2]。
primiRNA 由 Drosha 酶处理成单个的 pre
miRNA 后, premiRNA 被 RanGTP/ Expor tin 5
( Exp5) 输出受体从细胞核传送到细胞质 (图 1)
中[ 3]。在此 premiRNA 被 Dicer 切割成 miRNA:
miRNA * 双体, 它包含成熟的 miRNA 和它的互补
链( m iRNA * )。miRNA: miRNA * 双体经过解旋酶
的作用产生成熟 miRNA 单体。成熟 miRNA 尺寸
上的差异与 premiRNA 结构上的凸起或不匹配程
度有 关。Dicer 酶 包含 RNA 解旋酶结构域、
DUF283结构域、PAZ 结构域、两个 RNaseIII 结构
模体和一个 C 末端 dsRNA 结合域 ( dsRBD) [ 4]。
Dicer 的 PAZ 域可以辨认出 Dr osha 切割产物的末
端,并定位第二次切割点。
植物 miRNA 的成熟是在 Dicer 同源异形体
DCL1 催化下进行的, 类似 Drosha 功能的酶催化
primiRNA 转变成 pr emiRNA, 然后在 DCL1 和其
他类似蛋白的作用下,通过对 premiRNA茎环结构
的剪切, 在细胞核内生成中 间产物 miRNA:
miRNA * 双体。在类似 Export in5功能的 HASTY
协助下输出细胞核进入细胞质。最后, 经过解旋酶
的作用成为单链的成熟 miRNA。
图 1 miRNA和 siRNA的产生过程以及转录后抑制模型
目前尚未发现植物的 Dr osha同源异形体,这也
是植物 miRNA成熟过程与动物不同的原因之一。
成熟的 miRNA从 miRNA: miRNA * 双体中分
离,被选择性地组合进 RISC 并进行靶基因识别,而
miRNA * 会被迅速降解。Dicer切割 premiRNA 产
生的 miRNA: m iRNA * 双体,每个单体的 5端稳定
性一般不同。虽然成熟 miRNA 可能位于 premiR
NA 的任意一条链, 但是 miRNA 的 5端稳定性要
弱于 miRNA * 一支。也就是说成熟 miRNA 比
miRNA
*
5末端稳定性弱, 更容易进入 RISC, 这也
反映了 miRNA: miRNA * 双体从稳定性弱的末端解
开双链要相对容易 [ 5, 6]。因此, premiRNA 的分子
热力学性质决定了 RISC装配是不对称的, 也决定
了转录后抑制过程中靶基因的唯一性。少数情况下
miRNA和 miRNA * 5末端有相似的稳定性, 那么
miRNA: miRNA
* 双体中每一支进入 RISC 的概率
就是相同的。
192006年第 1期 何晨等: M icr oRNA 研究进展
3 miRNA同 siRNA的比较
miRNA 是 21~ 25bp 的非编码 RNA, 它的 5
端有一磷酸基团, 3端为羟基。来自具有茎环结构
的前体( premiRNA) (图 1) [ 7, 8]。成熟 miRN A来自
premiRNA U 形端的一枝,并且被两个 RNaseIII [ 2]
逐步地从 pr imiRNA 上释放出来。动物 miRNA
作为转录抑制因子,通过并不完全的匹配, 识别、结
合靶基因的 3UT R实现转录抑制。在 miRNA 研
究初期, miRNA 也曾被认为是 RNAi的组成部分。
RNAi即 RNA 干扰,是一种进化保守性机制, 是机
体为了抵抗病毒入侵的一种天然保护作用。当病毒
入侵, 转座子( T E)转录或基因组中反向重复序列转
录时,细胞中的 RNA可以通过两个 RNA 互补链结
合成分子间双链 RNA,也可以通过单个 RNA 链自
身回折互补,形成分子内双链 RNA。双链 RNA 进
入细胞后,被 Dicer 酶切割成 21~ 25nt 的片段, 即
小分子干扰 RNA ( siRNA ) (图 1)。 siRN A 可与
RISC结合,作为模板识别 mRNA 靶子。通过碱基
互补配对原则, mRNA 与 siRNA 中的反义链结合,
置换出正义链。双链 mRNA 在 Dicer 酶、AT P 和
解旋酶共同作用下产生 22nt 左右的 siRNA, siRNA
继续同 RISC形成复合体, 与 siRNA 互补的 mRNA
结合,使 mRNA 被 RNA 酶裂解。这个过程也称为
转录后基因沉默( PT GS)。外生性 dsRNA 的RNAi
具有进化保守性, 参与生物体防御病毒感染或是寄
生核苷酸的机制。RNAi组成部分的突变, 会影响
到植物对病菌的免疫。基本上说, s iRNAs和 miR
NA 在分子特征、产生过程、和作用机理上很相似。
很多 miRNA 的生物化学知识, 都来自我们认识
siRNA和 RNAi的过程。
miRNA和 siRNA 也有区别。miRNA 是一个
独特的种类, 来自基因组中编码的特定前体。pri
miRNA和 pr emiRNA 的结构, 决定了 miRNA 成
熟后的结构和序列。相比之下, siRN A是简单且随
机地来自长 dsRNA ,这些 dsRNA 可能是外生的或
者是从 dsRNA 里提炼出来的双向转录的内生
RNA。siRNA在结合点上,非常完美的和它的靶基
因匹配,并且在配对碱基的 10与 11之间切割、降解
靶基因。植物 miRNA 的作用机理同 siRNA 相似
(图 1) [ 9] ,但动物 miRNA 同靶基因在多点上不完全
互补, 且被限定在靶基因的 3U TR, 因此只在蛋白
质转录水平上负调控靶基因的表现。
miRNA和 siRNA 两者的比较见表 1。
表 1 miRNA和 siRNA的区别
名称 miRNA s iRNA
来源 内源转录本 转基因、病毒 RNA
前体 茎环状的 prem iRNA 双链结构的 dsRNA
催化酶 Drosha、Dicer 或者类似 Dicer 的酶复合体 Dicer
匹配方式 不完全互补(动物)或者完全互补(植物) 完全互补
作用目标的专一性(特异性) 相对较低 高
作用点 蛋白质合成水平 转录后水平
大小 约 22nt 约 22nt
功能 发育过程中,调节内源基因的表达 抑制转录活性,病毒感染,表型遗传
靶基因的命运 抑制转录或者被降解 被降解
4 miRNA的功能和作用机制
lin4 通过抑制转录对靶基因 lin14 进行负调
控。对 l in4 基因有缺陷的线虫的研究证明 miRNA
在生物体内的调节作用是至关重要的。有趣的是
lin4 只抑制 L IN14 蛋白质的合成, 并不影响 l in
14 mRNA 的数量。因为, l in14 的转录一开始会正
常地在 l in4 存在的情况下进行, lin14 的 mRNAs
可以不顾 lin4 的表现, 有效地同核糖体结合。推
测 lin4调控的转录抑制发生在转录开始以后, 例如
在转录延长或者是 LIN14蛋白质释放期间。
抑制靶基因的转录并非 l in4 所特有,事实上,
它显示了动物界 miRNA 负调控其靶基因的机理。
l et7和 Bantam(编码一个抗细胞凋亡的 miRNA)
在 3 U TR结合它们的靶基因,在线虫和苍蝇中,负
调控各自靶基因的转录。动物 miRNA 的功能不仅
局限于抑制靶基因转录,最近研究发现, miR196 基
20 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 1期
因和靶基因 H oxb8[ 10]匹配得非常完美,并导致靶基
因 mRNA 的降解。植物中的 miRNA,都引起它们
靶基因 mRNA 的降解。这是植物 miRNA 和动物
miRNA 的一个重要的区别。植物 miRNA 同靶基
因的配对完美, 同时它们互补位点位于靶基因转录
区域,而不是限制在 3U TR。Brennecke 等利用人
工构建的对 Bantam miRNA完全互补的靶基因, 证
实了动物 miRNA一样可以引起靶基因的降解。同
时,在研究拟南芥花发育过程发现的 miR172 是作
为转录抑制基因出现, 但是它同靶基因 APET A
LA2( AP2)的互补位点是位于编码区域, 而非 3
UT R。
对于 miRNA 来说, Dicer 和 RISC 是必不可少
的。因为 Dicer 是产生 miRNA 不可或缺的, 而
RISC则是 miRNA 实现功能的载体。
通过生物化学提纯, 科学家已经查明了 RISC
的几个重要组分。A rgonaute( A GO)蛋白质属于一
个进化保守的家族,具有 PAZ 结构域和 Piw i结构
域。最近发现 PA Z结构域与 RNA 的结合有关 [ 11]。
AGO 家族在多细胞物种中有多个同源蛋白(秀丽线
虫有 24个, 果蝇有 5个, 哺乳动物有 8个)。由于
AGO 家族有不同的突变种和表型,所以 RISC 会呈
现不同风格、组织种类、或者发育调节方式。RISC
功能的生物化学机制有待于进一步研究。
lin4 和 l et7 的研究形成了对 miRNA 的分子
结构和功能机制的一些认识, 但其仅是 miRNA 的
功能之一。Dicer 和 AGO 是 miRNA 和 siRNA 的
产生与功能实现必不可少的组成部分。Dicer 的突
变可以中断 miRNA 的生成, 导致多种发育缺陷, 其
中包括秀丽线虫生殖系统缺陷,拟南芥胚胎异常, 斑
马鱼生长停滞, 以及老鼠干细胞分化等。AGO类蛋
白的突变阻碍了转录抑制过程, 同样会导致生物体
的多种缺陷。例如拟南芥 zw ille基因突变体中早熟
分裂组织的分化,有缺陷胚胎的形成,秀丽线虫幼虫
发育阶段 alg1 和 alg2 的突变等等。这些缺陷从
侧面反映出 miRNA 的重要作用。
5 miRNA的识别和预测
miRNA 基因的克隆及其识别技术的飞速发展
导致了 miRNA 数据库的建立, 包括对最新公布的
miRNA 的注释。miRNA 信息要进入该数据库必
须要有成熟的 miRNA 显性实验证明, 科学地推测
出相应的茎环状前体。同源 miRNA便能轻易地从
其他物种中识别出来, 如人和老鼠的 miRNA。
目前, 两个最灵敏的 miRNA 基因预测工具是
M iRscan和 M iRseeker, 前者被系统的应用于检测
脊椎动物和线虫的候选基因,后者应用于筛选昆虫
的候选基因。它们鉴别出的基因许多都在试验中得
到证明,所以灵敏度很高,能够相当准确地估计各种
基因组中 miRNA 的数量。
miRNA功能的描述重点在于 miRNA 靶基因
的辨认。在植物中, 因为特定 miRNA 是十分完美
地匹配它们的靶基因, 生物信息学对于 miRNA 靶
基因的预测已经相关地证明了直接性, 实验结果证
明也是有说服力的 [ 12]。然而通过计算预测动物
RNA靶基因却很困难,原因是动物 miRNA 只有大
约 21~ 25 个核苷酸, 而且与靶基因的匹配并不完
全。因而生物信息学预测不得不依赖现有的比较少
的 miRNA 靶基因, 规则是来自基因领域的研究。
科恩集团( Cohen group)基于下面三个标准,筛选出
了果蝇的 miRNA 靶基因。这三个标准是: 完美匹
配,或者在 3UT R内 miRNA 内部头 8个 G- U 匹
配; miRNA 和它认定的配对之间偏好的结构、热力
学的异元双链分子的形式; 在果蝇 D. pseudoobscu
ra和果蝇 D. melanogaster 之间 miRNA 位点的进
化保守。
对于潜在有效的靶基因, 在其 3UT R 接上
GFP 报告基因,通过检测 GFP 在翅盘的表达有没
有相应 miRNA存在。利用这种方法找到了三个预
测的 miRNA 靶基因, 对应的 miRN A 分别是调节
Notch基因的 miR7, 调节促进细胞凋亡基因的
miR2, 和调控编码新陈代谢酶基因的 miR277[ 13]。
在秀丽线虫中发现 miRNA 以来, 通过研究
miRNA基因家族, 已经取得了巨大成就。不仅证
明了这些体积微小, 又无编码的 RNA 是调控基因
的一员,也显示了生物信息学, 生物化学, 遗传学等
学科的联合, 在研究基因调控机制的重要作用。
miRNA发现以来, 已经在 miRNA 分类、表现形式、
以及鉴别靶基因等方面都取得了重大进展。miR
NA 研究 2002年被美国《科学》杂志评为年度科技
突破之首。 (下转第 25页)
212006年第 1期 何晨等: M icr oRNA 研究进展
的活性及小鼠的保护性免疫效率。此外在抗原基因
中增加分泌引导序列亦可提高 DNA 疫苗诱发产生
抗体的水平[ 24] ,增强 DNA 疫苗的免疫效果。
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(上接第 21页) m iRNA 的发现为人类认识小 RNA
解开了新的篇章, 并且随着人们对 miRNA 认识的
逐步深入,基因调控机制必将具有更加广泛的应用
前景。
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