全 文 ：蛋白质组学研究技术及其进展
张宏一1, 2
( 1农业部作物品种资源监督检验测试中心,北京 100081; 2中国农业科学院作物科学研究所,北京 100081)
摘 要: 蛋白质组学是在后基因组时代出现的一个新的研究领域,它是对机体、组织或细胞的全部蛋白质的
表达和功能模式进行研究。对蛋白质组的研究可以使我们更容易接近对生命过程的认识。本文对蛋白质组学研
究所使用的主要技术例如二维凝胶电泳、质谱、酵母双杂交、蛋白质芯片、表面等离子共振和生物信息学等作一简
要综述。
关键词: 蛋白质组学 二维凝胶电泳 质谱 酵母双杂交 蛋白质芯片 表面等离子共振 生物信息学
Progress on The Techniques of Proteomics
Zhang Hongyi1, 2
( 1T he S up er v ision and T est ing Cente r f or Cr op G ermp lasm R esou rce s, Be ij ing 100081;
2I nsti tute of Cr op S ciences , Chine se Academy of A g ri cul tu ral S ci ences , Bei j ing 100081)
Abstract: Proteomics is a new resea rch er a of the po st- genomic era that aims at the analysis and identification
of ent ire pro teins pr esent in the cell tissue o r the or ganism, and of t he functions and the linkage of these prot eins.
The study on pro teomics can make us easily know how the vital prog ress goes. T he article will intr oduce these tech-
niques of pr oteom ics such as tw o-dimensional g el electrophor esis、mass spectr ometr y、tw o-hybrid sy stem、pro tein
chip、surface plasmon resonance and bioinfo rmatics etc.
Key words: Pro teomics T wo-dimensional g el electr opho resis Mass spectr ometr y Two-hybrid system
Pro tein chip Surface plasmon resonance Bio informat ics
众所周知, 始于 20 世纪 90 年代初的庞大的人
类基因组计划业已取得了巨大的成就。10 多个低
等模式生物的基因组序列测定已经完成: 第一个多
细胞生物 ) ) ) 线虫基因组的 DNA 全序列测定在
1998年底完成; 人类基因组序列草图已经绘制完
成。但是, 由于基因的主要功能是通过其表达产
物 ) ) ) 蛋白质来实现的, 因此人类要揭示整个生命
活动的规律, 就必须研究基因的产物 ) ) ) 蛋白质。
蛋白质具有自身特有的活动规律,随着生命活动的
进程表现出极其动态的紧密协调的变化, 蛋白质在
合成之后具有相对独立的修饰、转运和相互间作用
能力, 同时还具有对外界因素发生反应的能力。因
此,只有从蛋白质组学的角度对所有蛋白质的总和
进行研究,即开展蛋白质组学研究,才能更加贴近对
生命现象和本质的掌握, 生命活动的本质和活动规
律才能找到答案[ 1] 。
1 蛋白质组与蛋白质组学及其研究内容
蛋白质组 ( P roteome)指由基因组编码的全部
蛋白质[ 2] , 也可以说是指细胞或组织或机体全部蛋
白质的存在及其活动方式。蛋白质组学旨在阐明生
物体全部蛋白质的表达模式及功能模式, 其内容包
括鉴定蛋白质的表达、存在的方式(修饰形式)、结
构、功能和相互作用等。从蛋白质组的定义上可以
清楚地看出,蛋白质组学不同于传统的蛋白质学科
之处在于它的研究是在生物体或其细胞的整体蛋白
质水平上进行的, 它是从一个机体或一个细胞的蛋
白质整体活动的角度来解释和阐明生命活动的基本
规律。
收稿日期: 2005-05-16
作者简介:张宏一( 1978- ) ,男,回族,山东省青州市人,中国农业科学院在读硕士,主要从事作物抗逆性研究
T el : 010-62178210; E- mai l: yelang1081@ sin a. com y elang1081@ sina. com
生物技术通报
#技术与方法# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 4期
蛋白质组研究可分为两个方面: 一方面是对蛋
白质表达模式(或蛋白质组组成)的研究; 另一方面
是对蛋白质组功能模式(目前主要集中在蛋白质相
互作用网络关系)的研究。对蛋白质组组成的分析
鉴定是蛋白质组学中与基因组学相对应的主要内
容。它要求对蛋白质组进行表征, 即实现亚细胞结
构、细胞或组织等不同生命结构层次中所有蛋白质
的分离、鉴定及其图谱化。此外,尚须比较、分析在
发生变化的生理条件下蛋白质组所发生的变化。如
蛋白质表达量的变化,翻译后修饰的类型和程度,或
者可能的条件下分析蛋白质在亚细胞水平上定位的
改变等。双向凝胶电泳( 2-DE)和质谱( M S)技术是
当前分离鉴定蛋白质的两大支柱技术。通过分析一
个蛋白质是否与有抑制功能的蛋白质相互作用可得
到揭示其功能的线索。利用大规模酵母双杂交系
统,建立相互作用关系的网络图, 是目前蛋白质组学
领域的研究热点之一。
2 蛋白质组学的相关技术
2. 1 蛋白质的分离技术
目前在蛋白质组研究中应用最多的是二维聚丙
烯酰胺凝胶电泳( tw o- dimensional g el elect rophore-
sis, 2-DE) , 它也是目前对蛋白质组分辨率最高、重
复性最好的分离技术 [ 3]。二维聚丙烯酰胺凝胶电泳
的基本原理是根据蛋白质的等电点和分子量大小不
同,进行两次电泳将之分离 [ 4]。二维电泳的第一向
是等电聚焦( iso electric fo cusing, IEF) ,分为载体两
性电解质 pH 梯度等电聚焦和固相化 pH 梯度等电
聚焦。其第二向是 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-
PAGE) ,一般采用垂直电泳或水平电泳。两种方法
的实验结果没有明显的差别, 均适用于分子质量在
10~ 150Ku的蛋白质。由于 2-DE 利用了蛋白质两
个彼此不相关的重要性质对其进行分离, 因此分辨
率非常高, 一般能分辨到 1 000~ 3 000个蛋白质样
点。最好的胶可分离得到 11 000个左右的蛋白质样
点。但这与庞大的蛋白质组组分相比远远不能满足
需要,因此,样品的制备和发展预分离方法将是很有
用的。
二维电泳分离后的蛋白质点经显色后才能被鉴
定。二维电泳中的显色是一个重要的步骤, 常用的
显色方法有考马斯亮蓝染色、银染、荧光染色或同位
素标记等。其中, 银染法是非放射性染色方法中最
灵敏的, 其灵敏度可达到 1ng 甚至更低。但最灵敏
的还是利用同位素标记, 20ppm 的标记蛋白就可通
过其荧光或磷光的强度而测定。
图像分析也是二维电泳研究的重要方面。染色
后可用图像扫描仪、激光光密度仪、磷光或荧光测定
仪等建立双向凝胶电泳图谱。此外, 还要对不同组
织、不同细胞表达的蛋白质图谱进行比较, 除掉凝胶
图谱的纹理和背景, 找到表达上差异的蛋白质点,确
定有生物意义的蛋白质[ 5] 。
近来又出现了一些新的蛋白质分离技术, 如多
维色谱技术、亲和色谱技术和一维变性聚丙烯酰胺
凝胶电泳等,其中最有发展前景的是多维色谱技术。
从目前的发展方向看, 液相色谱 ) 质谱联用成为蛋
白质组学分离技术的一个新的增长点, 并越来越受
到关注。该技术最突出的优点是对全蛋白质组分进
行分析时的歧视效应大大减小, 而且可以实现蛋白
质分离与鉴定的在线联用,有利于蛋白质组研究的
自动化和高通量化。
2. 2 蛋白质的鉴定技术
2. 2. 1 Edman降解法测 N 端序列 由于 Edman
降解法测序可得到准确的肽序列, 是蛋白质鉴定可
靠的重要依据, 因而成为目前蛋白质鉴定的主要方
法。但它存在着测序速度较慢、费用偏高等缺陷。
最近, 应用细径 (内径 0. 8mm, 流速 40Ll/ min) 的
HPLC柱, Cor dw ell等能够在 100 飞摩尔( fmol)的
初产率下测得 5~ 10个氨基酸残基的序列[ 6] 。随着
Edman降解法在微量测序和速度等技术上的突破,
它在蛋白质组研究中可发挥重要的作用。类似 Ed-
man 的 C端化学降解法已研究了多年并有自动化分
析仪器问世, 但它的反应效率较低, 通常需纳摩尔
( nmol)样品。
2. 2. 2 质谱技术 质谱技术的基本原理是带电粒
子在磁场或电场中运动的轨迹和速度依粒子的质量
与携带电荷比 (质荷比 m/ z)的不同而变化, 从而可
以据其来判断粒子的质量和特性[ 7] 。质谱仪一般有
进样装置、离子化源、质量分析器、离子检测器和数
据分析系统组成。质谱最重要的技术是将被分析的
分子变成气相的离子。质谱技术按照样品分子离子
化的方式分为电喷雾离子化质谱( elect rospray ion-i
32 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 4期
zat ion mass spect rometry, ESI-MS)和基质辅助的激
光解吸离子质谱( matrix assisted laster deso rpt ion
ionizat ion mass spect rometry , MALDI-M S)。在离
子化方面,两种质谱都采用/软电离0的方法, 即样品
分子电离时,保留整个分子的完整性,不会形成碎片
离子。这对以前的电子电离方式是一个很大的突
破,因为电子电离方式的样品分子必须气化, 并与电
子直接碰撞, 而对于大分子, 特别是热不稳定、极性
的蛋白质而言, 这种电离方式会产生大量的碎片离
子,结果图谱谱线多得无法分析。这就是质谱技术
出现已久, 但没能应用到生物大分子研究的主要原
因。因此,当 80年代 Fenn 第一次展示电喷雾离子
化图谱时, 就引起了轰动。不久, MA LDI电离技术
也发展起来了。到 90 年代初, ESI 和 MALDI 已被
认为是两种在生物大分子研究中具有重要意义的离
子化技术。另外,对于蛋白质和多肽,质谱技术还有
一个重要功能就是多肽的测序, 即采用串联质谱
( Tandem-MS) , 在第一级质谱得到多肽的分子离
子,选取目标多肽的离子作为母离子,与惰性气体碰
撞,使肽链中的肽键断裂,形成一系列的离子, 即 N
端碎片离子系列( B 系列)和 C 端碎片离子系列( Y
系列) , 将这些碎片离子系列综合分析, 可得出多肽
片段的氨基酸序列[ 8]。Wilm 等应用纳喷串联质谱
( nano-electr ospray tandem mass spect rometry)能在
较低的飞摩尔上测得多肽片段序列 [ 9]。
质谱法有不少优点, 还能用于翻译后修饰的分
析(糖基化、磷酰化) , 但目前只适用于 20 个氨基酸
以下的多肽片段。此外, 它还存在固有的局限性,譬
如Leu和 Ile、Lys和Gln不能区别,有些多肽的固有
序列不能用质谱法测定。
2. 2. 3 氨基酸组成分析 氨基酸组成分析由于耗
资低而常用于蛋白质鉴定。氨基酸组成分析有别于
肽质量或序列标签, 是利用不同蛋白质具有特定的
氨基酸组份的特征来鉴定蛋白质[ 10] 。该法可用于鉴
定 2-DE分离的蛋白质,应用放射标记的氨基酸来测
定蛋白质的氨基酸组份, 或将蛋白质转 PVDF 膜,在
155 e 酸性水解,让氨基酸自动衍生后, 经色谱分离,
获得 的数 据用 AACompIdent、ASA、AA C-P1、
PROP-SEARCH 等软件进行数据库查询, 依据代表
两组分间数目差异的分数对数据库中的蛋白质进行
排榜, /冠军0蛋白质的可信度较大。但该法的速度
较慢,所需蛋白质或肽的量较大, 在超微量分析中受
到限制;且存在酸性水解不彻底或部分降解而产生
氨基酸变异的缺点, 故应结合蛋白质的其它属性进
行鉴定[ 11]。
2. 2. 4 蛋白质芯片技术 蛋白质芯片( Protein Chip)
技术是继基因芯片( Gene Chip)技术之后的新一代
生物芯片技术。根据芯片表面的不同化学成分, 可
将蛋白质芯片分为化学表面芯片和生物表面芯片。
其中化学表面芯片又可分为疏水、亲水、阳离子、强
阴离子和金属离子螯合芯片五种, 用于检测未知蛋
白,并获取指纹图谱。生物表面分为抗体抗原、受体
配体和 DNA 蛋白质芯片等种类, 可显示与之结合的
抗原或配体的不同分子量亚型。蛋白质芯片技术是
一种高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术,它
不需要进行蛋白质分离, 只是利用抗体或其它类型
亲和探针构成的芯片进行检测, 可以同时检测几千
种蛋白质,效率非常高。具体方法是首先将一系列
的/诱饵0( Bait )蛋白质(如抗体)按照一定的排列格
式固定在经特殊处理的材料表面上 [ 12]。然后以我们
感兴趣的样品为探针来探查该表面, 那些与相应的
抗体相结合的蛋白质就会被吸附在表面上。而后把
未与抗体结合的蛋白质洗掉, 把结合的蛋白质洗脱
下来,经凝胶电泳之后通过质谱法进行鉴定。这种
技术实际上是一种大规模的酶联免疫分析,可以迅
速地将我们感兴趣的蛋白质从混合物中分离出来,
并进行分析。蛋白质芯片上的/诱饵0蛋白质可根据
研究目的不同, 选用抗体、抗原、受体、酶等具有生物
活性的蛋白质。
2. 3 蛋白质间的相互作用技术
蛋白质与蛋白质的相互作用是细胞生命活动的
基础和特征。这种千变万化的相互作用以及由此形
成的纷杂的蛋白质联系网络同样也是蛋白质组学的
研究内容,且相应的工作也已经展开。目前的研究
方法主要有酵母双杂交系统、表面等离子共振技术
等。
2. 3. 1 酵母双杂交系统 酵母双杂交系统( yeast
tw o hybrid system)自Fields和Song 建立[ 13]以来已
经成为分析蛋白质相互作用的强有力的方法。该方
法仍在不断的完善中, 如今它不但可用来在体内检
332005年第 4期 张宏一:蛋白质组学研究技术及其进展
验蛋白质间、蛋白质与小分子肽、蛋白质与 DNA、蛋
白质与 RNA 间的相互作用,而且还能用来发现新的
功能蛋白质和研究蛋白质的功能, 在对蛋白质组中
特定的代谢途径中的蛋白质相互作用关系网络的认
识上发挥了重要的作用。
酵母双杂交系统的建立得益于对真核生物调控
转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反
式转录激活因子的参与。转录激活因子在结构上是
组件式( modular) ,即这些因子往往由两个或两个以
上相互独立的结构域构成, 其中 DNA 结合域( DNA
binding domain,简称为 DB)和转录激活结构域( ac-
t ivat ion domain,简称为AD)是转录激活因子发挥功
能所必需的。单独的 DB 虽然能和启动子结合, 但
是不能激活转录。而不同转录激活因子的 DB 和
AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功
能。DB和 AD分别能与多肽 X和 Y 结合,由 DB和
AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为/ 诱饵0
( bait )和/ 猎物0或 /靶蛋白0 ( prey 或 target pro-
tein)。如果在 X和 Y 之间存在相互作用,那么分别
位于这两个融合蛋白上的 DB 和 AD 就能形成有活
性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转录与表
达。这个被激活的、能显示/诱饵0和/ 猎物0的两个
蛋白质之间相互作用的基因称之为报道基因 ( re-
porter gene)。通过对报道基因表达产物的检测,反
过来可判别作为/诱饵0和/猎物0的两个蛋白质之间
是否存在相互作用[ 14] 。
酵母双杂交技术只能反映蛋白质间可能发生作
用,还必须结合其它试验才能确认, 尤其是要与生理
功能研究结合。虽然如此, 该项技术在蛋白质间的
相互作用研究、筛选新的蛋白质以及研究蛋白质功
能等方面仍发挥着重要的作用。
2. 3. 2 表面等离子共振技术 目前,表面等离子体
共振( Sur face Plasmon Resonance)技术已成为了当
今一种全新的研究蛋白质之间相互作用的手段。表
面等离子体共振 SPR 生物传感器是利用表面等离
子体共振现象和 SPR 谱峰对金属表面上电介质变
化敏感的特点, 通过将受体蛋白固定在金属膜上,检
测受体蛋白与液相中配体蛋白的特异性结合。SPR
技术的特点是测定快速、安全、不需标记物或染料及
灵敏度高。其除了应用于检测蛋白质与蛋白质之间
的相互作用外, 还可检测蛋白质与核酸及其他生物
大分子之间的相互作用, 并且能对整个反应过程进
行实时监测。因此, SPR 技术在检测生物大分子特
异性相互作用上比传统的方法更具优势, 其对基础
理论、医学诊断及治疗等都具有十分重要的意义[ 15] 。
2. 4 生物信息学
生物信息学( bioinformatics)是在生命科学、计
算机科学和数学的基础上逐步发展而形成的一门新
兴交叉学科,是为理解各种数据的生物学意义,运用
数学与计算机科学手段进行生物信息的收集、加工、
存储、传播、分析与解析的科学 [ 16]。生物信息学在基
因组学和蛋白质组学的研究中起了特殊的重要作
用, 因为基因组和蛋白质组研究提供的数据的数量
之巨大在生物学史上是史无前例的。而且, 蛋白质
组比基因组具有更大的复杂性, 因而蛋白质组信息
学更有挑战性。当前生物信息学已经不仅是高效地
进行基因组和蛋白质组数据的分析, 而且可以对已
知或新的基因产物进行全面的功能分析。例如用生
物信息学对质谱得到的肽指纹图谱 ( peptide-mass
fingerprint ing )分析出了一个新的在进化过程中保
守的模序( mot if ) ,它对蛋白质的结构和功能具有重
要意义。用分子建模( molecular modelling )揭示了
在耐热菌 Thermus aquat icus 的肽延伸因子 EF- Tu
中的一个模序( 340~ 345)对维持三个结构域之间的
整体结构之间的整体构象的完整性有重要意义。肽
指纹图谱原先只是一个普通的蛋白质分析技术, 但
通过生物信息学处理则可以得到有功能意义的结构
信息,甚至预测部分蛋白质的功能。有关二维凝胶
数据库的信息见表 1。
3 蛋白质组学研究展望
虽然蛋白质组研究当前还处于一个初期发展阶
段,相关技术手段及其配套应用还很不成熟。但是
其受重视的程度和进展还是显著的。目前,美国、澳
大利亚、日本和欧洲多国等近 10个国家开展了蛋白
质组研究,并成立了相应的研究机构 [ 17]。2002年的
诺贝尔化学奖分别授予了发明生物大分子质谱分析
法和生物大分子三维结构核磁共振技术的科学家,
表明开展人类蛋白质组计划的技术保障体系已经具
备。2001年,我国关于蛋白质组研究的国家自然科
学基金重大项目也已启动。以北京师范大学为首的
34 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 4期
众多单位, 在北京正式成立了隶属于教育部的高等
学校蛋白质组学研究院。它的诞生标志着我国向生
命科学的最前沿领域-蛋白质组学的研究迈出关键
性的一步。同时, 国际和国内许多大公司和制药厂
表 1 二维凝胶数据库
数据库 内容 地址
Biobase 角质形成细胞, 膀胱癌等 (丹麦 Cebter for Gen om e
Research )
ht tp: / / biobas e. dk/ cg-i bin/ cel is
ECO2DBASE 大肠杆菌 (在 NCBI 库中) ftp: / / ncbi. nlm. nih. gov/ resp os itory/ E CO2DBASE
H eat-DPAGE 人心肌(德国柏林) ht tp: / / www . ch emie. fu-berlin. de/ user/ pleiss
H SC- DPAGE 人类心脏(英国 H aref ield, Heart Science Center) ht tp: / / www . haref ield. nthames. nhs. uk/ nh li/ pro-
tein/ index. html
LSB 人类,小鼠和大鼠肝脏等(美国 Large Scale Biology) ht tp: / / lsbc. com. 2dmaps/ patterns. h tm l
QUEST Ref52细胞,大鼠胚胎,酵母(美国Cold Spring Harbor
Lab)
ht tp: / / siva. cshl. org
SWISS- DPAGE 10个人类图谱,包括:肝, 浆细胞,红细胞, 血小板,以
及酵母,大肠杆菌
(瑞士日内瓦, U nivers ity H ospital)
ht tp: / / expasy. hcuge. ch/ ch2d/ ch2d-top. h tm l
YEAST S. cerevisiae, S. pombe 等(瑞典Goteb org Un iversity) ht tp: / / yeast-2dpage. gmm. gu. se
YEAST S. cerevisiae(美国Proteom e inc) ht tp: / / www . proteom e. com/ YPDhom e. html
也纷纷进入这一领域。从蛋白质组学这个领域研究
的一开始, 基础研究和实际应用的期望就表现出强
烈结合的趋势。我们有理由相信, 随着蛋白质组学
研究的深入发展,在揭示诸如生长、发育和代谢调控
等生命活动的规律上将会有所突破, 也许人类揭开
生命科学的诸多奥秘的梦想已为期不远。
参 考 文 献
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德利用工程植物生产可生物降解的塑料 # 国外动态#
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原酶( pha B )和 3-羟基丁酸聚酯( PHB)合酶( phaC)的三种基因细菌( Ralstonia eut ropha)的顺序性作用,可
使其合成理化特性类似于人工合成聚合物的 PHB。由于这种 PHB可以生物降解,故认为其可用作工业上
生产塑料的原材料。
有鉴于此, 最近德国克里斯蒂安-阿尔布雷希茨大学的科学家 G. Menzel等利用根癌农杆菌( A gr obacte-
rium tumef aciens) ,将整个 PHB 聚合物合成途径中的三种基因,转移至甜菜发根。
结果发现, 表达了上述三种基因的转基因克隆, 可产生 55毫克的高分子量 PHB/克干重根组织。这是
首次利用基因工程在可贮存碳水化合物的植物的根中生产 PHB聚合物。 汪开治
352005年第 4期 张宏一:蛋白质组学研究技术及其进展