全 文 ：核酸检测技术在水产养殖病原诊断中的应用*
范文辉1, 2 黄倢2 包振民1
( 1中国海洋大学生命科学与技术学部,青岛 266003; 2中国水产科学研究院黄海水产研究所,青岛 266071)
摘 要: 目前核酸检测技术在水产养殖疾病诊断中已广泛应用。现就国内外研究发展动向, 对分子杂交技
术、PCR 技术、PCR 分子杂交联用技术、PCR 免疫学联用技术、16S rRNA 技术和限制性酶切技术等方法进行综述,
详细阐明了各个技术的原理、特点及应用。病原体遗传背景的研究状况为决定是否应用这些方法的关键。
关键词: 核酸检测 病原诊断 水产养殖 应用
Application of Nucleic acid Detection Technology on
Diagnose of Aquatic Animal Pathogens
Fan Wenhui
1, 2 Huang Jie2 Bao Zhenm in1
( 1Ocean Univ er sit y of Cina , Qing dao 266003; 2 Ye llow S ea Fi sh eri es Resear ch Inst i tut e , Qingdao 266071)
Abstract: Nucleic acid detection technolog y has been applied ex tensively to diagnose o f aquatic anima l patho-
gens w ith the development of molecular biolog y. This paper intr oduces the molecular hybr idizat ion, po lymerase
chain r eaction( PCR) , PCR-molecular hybridization, PCR- immuno logy, 16S rRNA gene ana lysis and rest riction en-
zyme dig est ion technolog ies, deta iledly clarifies t heir mechanism, character istics and applicat ion in aquacult ur e. Ge-
netic backg rounds o f aquatic animal pathogens play impor tant roles in the application o f nucleic acid detection tech-
nolog y in aquaculture.
Key words: Nucleic acid detect ion Pathogen diagnose Aquacultur e Applicat ion
近年来,随着水产养殖业规模的不断扩大和集
约化程度的不断提高,各种病害接踵而至,给水产养
殖业带来了严重的经济损失。于是建立准确、灵敏、
快速的病原检测技术已迫在眉睫。传统的病原检测
方法如组织切片观察法、超薄切片电镜观察法、免疫
学方法包括血清学反应、单抗检测法,多抗检测法以
及单纯 ELISA 法等存在很多弊端, 或是费时费力,
或是准确性与灵敏度令人不甚满意。例如, 血清学
反应特异性较低,易出现交叉反应,并且由于感染初
期抗体的滞后形成和病愈后抗体的仍然存在, 可能
会造成检测结果的假阴性和假阳性;单纯 ELISA 方
法虽然灵敏度较高, 结果受样品浓度的影响, 易出现
假阳性或微阳性。核酸检测技术是以病原微生物的
核酸为研究对象, 实现对病原的准确诊断,其带来了
水产养殖病原诊断技术的革命。核酸检测技术主要
包括分子杂交技术、PCR技术、PCR分子杂交联用
技术、PCR免疫学联用技术、16S rRNA 技术以及限
制性酶切技术等。近几年,运用核酸检测技术对水
产养殖生物和环境中的病原进行检测发展非常迅
速,尤其是随着 PCR技术的日臻完善和各种探针标
记技术的发展,使得核酸检测技术更为准确、灵敏、
安全和快捷。
1 分子杂交技术
分子杂交是利用一个特异性标记 DNA 或
RNA单链为指示探针, 通过与另一被测的核酸单链
复性,形成双链,以测定某一特异性核酸序列是否存
收稿日期: 2004-12-20
* 基金项目:国家重点基础研究发展规划项目课题( G1999012002) ,中国水产科学研究院黄海水产研究所海水养殖生物疾病控制与分子病
理学实验室开放课题资助
作者简介:范文辉, 1978年 10月生,女,硕士研究生,研究方向:海洋生物学
通讯地址:青岛市南京路 106号黄海水产研究所病研室( 266071)
生物技术通报
# 技术与方法# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 3期
在的一种检测方法。核酸探针具有特异性好、灵敏
度高、诊断快速、操作简单等特点, 在流行性爆发病
的诊断并制定及时的治疗方案中具有极高的应用价
值。目前,分子杂交方法已在多种病原检测中应用,
并成为多种核酸检测方法的基础。分子杂交的种类
很多,按杂交方式可分为斑点杂交、Southern 印迹杂
交、原位杂交等;根据探针来源和性质可分为基因组
DNA 探针、cDNA探针、RNA 探针及人工合成寡核
苷酸探针等。探针的标记包括放射性标记和非放射
性标记,其中后者的应用更广泛。
斑点杂交是一种最常用、快捷的进行基因检测
的分子杂交方法之一, 根据杂交膜上点样斑点的有
无或强弱就能推测样品是否感染病毒以及感染程
度。此法操作简便, 所需仪器和试剂简单, 一次可以
对大量样品(可达上百个)进行检测,可在基层条件
一般的实验室进行。史成银等[ 1] 以含不同 HHNBV
(WSSV) 特有 DNA 片段的重组质粒为材料制备地
高辛标记核酸探针, 利用斑点杂交对已感染 H HN-
BV 但未出现症状的养殖对虾进行 HHNBV 检测,
成功的实施了生产上的及时抢捕。
另一种分子杂交检测技术为原位杂交, 原位杂
交是用标记的 DNA 或 RNA 探针, 在细胞或染色体
上与互补的核酸序列杂交,再经过放射性自显影或
免疫荧光、化学发光在杂交原位上显示杂交体的技
术。由于原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一
细胞的研究而不受同一组织中其它成分的影响, 可
更为方便的研究那些细胞数量少且散在于其它组织
中的细胞内 DNA 或 RNA; 且由于原位杂交不需要
从组织提取核酸, 对于组织中含量极低的靶序列有
极高的敏感性, 并可完整的保持组织与细胞的形态,
更能准确的反映出组织细胞的相互关系及功能状
态, 此技术已被广泛应用于病原微生物的诊断的研
究中。Chang[ 2] 等运用原位杂交技术,来确定WSSV
的宿主和传播途径,直观定位了 WSSV 的靶组织及
靶组织中对 WSSV 敏感的细胞类型。Mari J[ 3] 从纯
化的 T SV( Taur a Syndrome Virus)提取 ssRNA 基
因, 转录成双链 cDNA 并且被用来构建 cDNA 文
库。然后通过载体和质粒重组的方法筛选两个特异
性的 pP15和 pQ1探针,通过 no rthern blots和 dot-
blo ts,表明了两个探针能够特异性地与提取的 T SV
DNA、T SV 和感染的 T S 虾组织匀浆液进行杂交。
并且该探针与同批次 T S 病虾组织切片原位杂交检
测 TSV 的结果与 northern blo ts 和 do t blots 检测
结果一致,与 IHHNV 和 HPV 无杂交信号,说明该
探针具有较高的特异性。
分子杂交在应用上还存在一些不足, 目前水产
动物病原体的遗传背景的研究相对滞后于生产, 绝
大部分的病原体的 DNA 全序列还没有测出,国内外
构建病原体全部或部分的基因文库的工作还不太完
善, 这对制备杂交所用特异性核酸探针有较大的困
难,并且早期分子杂交法所用探针制备过程较繁琐,
如果回收的克隆片段不纯,还可能存在非特异性标
记;对于原位杂交来说,其耗时长,操作繁琐, 不适合
在基层使用; 另外分子杂交法是直接检测存在于养
殖生物体内的相对较低拷贝数的病原 DNA, 与 PCR
方法相比其灵敏度还比较低。
2 PCR技术
聚合酶链式反应( PCR)技术,又称 DNA 体外扩
增技术,可谓是现代分子生物学技术中的一枝独秀。
由于其快速而又特异,所以倍受青睐。从 20世纪 90
年代开始国外相继使用 PCR来诊断多种病原。常
规 PCR法的诊断原理是根据所设计的引物对特异
性片段进行 PCR 扩增, 通过对产物琼脂糖凝胶电
泳, 看是否能扩增出特异性条带来检测样品中是否
含有病原 DNA。对于核酸为 RNA 的病原体, 则用
逆转录聚合酶链式反应( RT-PCR)来进行检测, 一般
过程为: 引物设计- RNA 提纯- cDNA 的构建-
PCR扩增以及产物电泳。在常规 PCR的基础上,现
已发展了许多衍生技术,如原位 PCR、套式 PCR、荧
光定量 PCR以及 rea-l time PCR等。
PCR检测技术具有许多优点。首先, PCR检测
技术特异性好, 这是由于不同生物之间核苷酸的千
差万别所致。其二, PCR检测技术对感染早期的检
测非常有效, 而且还具有检测速度快的特点。当知
道待检病原具有某一特定基因片段时, 即可利用特
异的引物对样品中微量的目标 DNA 进行 PCR 扩
增,通过电泳检测扩增出的特定片断,即可确定感染
的病原。
应用 PCR检测WSSV 的技术已经非常成熟,如
Kimur a
[ 4]等根据 WSSV DNA EcoRI酶切片段( 1. 4
22 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 3期
Kb)的序列,设计两对引物( P1/ P2, P3/ P4) , 建立套
式 PCR( nested-PCR)检测方法; T akahashi[ 5]等根据
WSSV DNA EcoRI-H ind Ó酶切片段Pjd79( 889bp)
的序列设计引物,用 PCR方法检测不同地域不同对
虾的WSSV 携带及感染情况; M aeda[ 6] 等在 Kimura
和 Takashi等人的基础上, 运用套式 PCR 来研究
WSSV( PRDV)的宿主和致病性。战文斌等[ 7] 采用
Kimur a引物, 用 PCR技术对不同生长期的中国对
虾进行了白斑病毒WSSV的检测, 同时检测了对虾
发病时养殖池中多见的野生厚蟹和矛尾刺鰕虎鱼。
结果表明WSSV 感染的亲虾有可能是病毒的宿主,
而野生厚蟹则有可能是病毒中间宿主或病毒的携带
者, 对WSSV 的感染、传播中起了重要的作用。李
军等 [ 8] 应用 RT-PCR 技术对感染草鱼出血病病毒
( GCHV)不同时期的草鱼内脏匀浆上清液进行检
测,结果均为阳性, 感染 GCHV24h 后即可检出, 该
结果证明此方法对感染早期的诊断非常有效。Dhar
等[ 9]使用 Rea-l t ime PCR 方法对 T SV 实现了正确
的定量检测, 同时表明该方法可降低污染。
在细菌检测方面, 夏春等[ 10] 根据鱼源嗜水气单
胞菌 B-溶血素基因序列设计了两对引物, 采用套式
PCR法证实了我国嗜水气单胞菌流行株亦存在B-溶
血素的基因, 并建立了 PCR检测产B-溶血素嗜水气
单胞菌的方法。PCR 技术在细菌检测中还可以与
SSCP(单链构象多态性)技术等联用, 来提高诊断的
准确性。彭宣宪等 [ 11]以嗜水气单胞菌、鲁氏耶尔森
氏菌、鳗弧菌等为研究对象, 建立了通用引物 PCR
联用单链构象多样性分析诊断技术。该技术在同一
反应条件下对多种病原菌的 DNA 进行扩增,能完成
对多个病原菌的同时检测,特异性好且快捷经济。
常规 PCR检测技术在运用中存在一些不足,例
如在 PCR扩增系统中,常因模板 DNA品质不良,而
导致假阳性的结果。
3 PCR与分子杂交联用技术
早期的斑点杂交法所用核酸探针制备过程较繁
琐,耗时长, 且如果回收的克隆片断不纯, 可能存在
非特异性标记。如果把 PCR 和斑点杂交技术结合
起来,就可以克服上述弊端, 通过 PCR 反应可快速、
大量的合成特异性探针(此探针可以直接用于样品
病原 DNA 检测,也可以用于样品病原 DNA 经 PCR
扩增后的产物检测) ,通过斑点杂交可进行大批量的
样品检测,操作简便、安全,易于推广,并且灵敏度比
单纯的 PCR法或斑点杂交法有进一步的提高。雷
质文等 [ 12] 直接运用 PCR 法快速制备 DIG 标记探
针, 探针的长度为 547bp,在硝酸纤维素膜上进行斑
点杂交, 对 WSSV 进行检测。检测结果显示, 在相
同条件下, 用 PCR法制备的 DIG 标记探针和/ 对虾
暴发性流行病原核酸探针点杂交检测试剂盒( I 型) 0
探针检测虾样, 二者结果基本一致。说明 PCR制备
的 DIG标记探针与试剂盒的探针的灵敏度基本相
同。造成二者不完全一致的原因是因为试剂盒所使
用的探针是混合探针, 较 PCR法制备的单一探针有
更多的标记结合位点, 所以后者比前者显色稍微弱
一点。杨冰等[ 13] 利用非放射性标记物地高辛,通过
PCR方法制备了 IH HNV DNA 探针, 通过核酸斑
点杂交检测法对 IHHNV 进行检测。结果表明, 该
方法的检出灵敏度为 24. 8pg,可检出 26. 6ng 患病对
虾组织 DNA 中的 IHHNV,与 WSSV、HPV 均不起
交叉法应,可适用于健康亲虾、苗种的培育和无特定
病原( SPF)对虾的种群选育及 IHHNV流行病学调
查。
闫冬春等[ 14] 设计了两对引物用于检测 WSSV,
外引物用于 PCR扩增,内引物用于合成探针进行斑
点杂交。结果表明, 外引物 PCR-电泳的检出极限为
1pgWSSV DNA; PCR产物经内探针斑点杂交, 可检
出 10fg 的 WSSV DNA; 单纯的内探针斑点杂交只
能检出 1ng以上的WSSV DNA。PCR-斑点杂交的
检测灵敏度是 PCR-电泳的 102倍,是单纯的斑点杂
交高 105倍。Southern 杂交表明, 该 PCR-斑点杂交
检测WSSV 特异性可靠,适合用于痕量WSSV 的检
测, 在水产养殖动物感染后但又未出现明显症状或
大规模爆发以前能准确的预测和预报, 这是常规方
法无法比拟的。
4 PCR与免疫学联用技术
4. 1 PCR-ELISA 法
PCR-ELISA 法是 PCR 技术与 ELISA 技术结
合检测方法, 主要是用于检测样品中的特定基因。
它引入地高辛(或生物素)标记的 dNTP 进行 PCR
扩增,利用酶标抗地高辛抗体(或酶标记亲和素)进
行 ELISA 检测, 代替了用于常规 PCR 产物检测的
232005年第 3期 范文辉等: 核酸检测技术在水产养殖病原诊断中的应用
电泳方法,方便快捷, 易于处理大量样品, 且其灵敏
度比使用琼脂糖凝胶电泳检测方法高 100 倍左右。
当有适当的标准品时,还可进行定量测定[ 15]。
Gonzalez等[ 16]描述了一种基于 lam B 基因的
PCR-ELISA 快速分析牡蛎中大肠杆菌的检测手段。
分析感染大肠杆菌的牡蛎样品时, 该方法检测范围
可达 10~ 105cfu/ g 样品。Elandalloussi LM [ 17]等应
用基于地高辛标记显色系统的 PCR-ELISA 法对可
造成双壳类软体动物大规模死亡的两种寄生虫-P.
at lant icus 和 P . mar inus 进行检测, 结果表明, 该
PCR-ELISA 法可检出 1pg 的P . atlanticus DNA,其
灵敏度为常规 PCR的 100倍。用该 PCR-ELISA法
和FTM assay法同时对 45份蛤肉样品进行检测,有
39份检测结果一致。以上说明 PCR ELISA 法是一
种快速、精确、可定量的检测感染抗原的方法, 并且
将来可以进行自动化操作。
4. 2 免疫 PCR法
免疫 PCR( IM-PCR)是 1992年 Sano 建立的一
种检测微量抗原的高灵敏度技术[ 18] 。该技术把抗原
抗体反应的高特异性和聚合酶链反应的高敏感性有
机结合了起来, 其突出的特点是指数级的扩增效率
带来了极高的敏感度, 能检出浓度低至 2ng/ L 的抗
原[ 19] , 为现行任何一种免疫定量方法所不及。它的
基本原理是用一段已知 DNA 分子标记抗体作为探
针,用此探针与待测抗原反应, PCR扩增粘附在抗原
抗体复合物上的这段 DNA 分子,电泳定性, 根据特
异性 PCR产物的有无, 来判断待测抗原是否存在。
由于 PCR产物在抗原量未达到饱和前与抗原抗体
复合物的量成正比, 因此免疫 PCR 还可用于抗原的
半定量试验。免疫 PCR 理论上可以检测单个抗原
分子,但实践中它的敏感性受许多因素的影响,如连
接分子、显示系统的选择、DNA 报告分子的浓度、
PCR循环次数等。
Kakizaki等[ 20] 报道了在感染的鱼中运用免疫
PCR检测病原巴斯德氏菌。结果表明,利用它可检
测出 34cfu/ m l的病原菌, 而使用传统 ELISA 方法
只能检测出 3. 4 @ 104 cfu/ ml的菌。徐平西等[ 21] 用
戊二醛作连接剂,将蛋白质高效率包被在普通 PCR
管内壁, 使免疫 PCR 反应用普通 PCR 仪得以在管
中连贯地进行。实验结果与 ELISA 方法比较敏感
度高出约 105倍。这一改良法的建立可望促进免疫
PCR的普及应用。另外, PCR法还可以荧光标记技
术联用,使结果的观察更加直观。
5 16S rRNA技术
从 20世纪 60年代开始, 分子遗传学和分子生
物学的迅速发展使细菌分类学进入了分子生物学时
代, 许多新技术和方法在细菌鉴定中得到了广泛的
应用。由于细菌种间 16S rRNA 基因序列间隔区在
长度、序列上具有相对多变性,所以利用保守区基因
作为引物,对间隔区进行克隆和分析,就能为病原微
生物的各菌株、种、属的鉴定、分型提供依据。该检
测技术目前已被成功的运用到了病原菌的种、属以
及家族种类的鉴定中。16S rRNA 基因片段的分析
方法主要包括以下 3种: 一是将 PCR产物克隆到质
粒载体上进行测序, 与数据库中的序列进行比较,确
定其在进化树中的位置, 从而鉴定样品中存在的微
生物种类。该方法获得的信息最全面, 但在样品成
分复杂的情况下需要大量的测序工作。二是通过
16S rRNA 种属特异性的探针与 PCR 产物杂交, 此
外探针也可以直接与样品进行原位杂交对病原菌进
行检测。该方法简单快速,主要用于快速检测,但可
能出现假阳性或假阴性。三是对 PCR 产物进行
RFLP 分析,通过观察酶切电泳图谱, 确定微生物基
因的核糖体型, 再同核糖体库中的数据进行比较分
析样品中微生物的种属关系。
目前, 16S rRNA技术在水产养殖病原检测中已
开始运用并发展迅速。邹玉霞等[ 22]通过对大菱鲆出
血症病原菌的 16S rRNA 基因进行系统发育学分
析,确定了该病原菌为鳗弧菌。Carlos 等[ 23] 通过对
26株不同地理及不同来源菌株的 16S rRN A基因进
行了分析, 确定了鱼出血性败血病血症病原美人鱼
发光杆菌的分类地位, 并建立了基于 16S rRNA 基
因的巢式 PCR病原检测方法。利用此方法可检测
到被感染鱼组织里病原菌 10fg 至 1pg DNA ( 20~
200个菌) ,可以从怀疑带菌但又无症状的鱼体检测
出病原,具有较高的选择性和特异性。
6 限制性酶切技术
限制性酶可识别 DNA上较短的序列, 在识别位
点上切开 DNA ,单个核苷酸变化即可导致限制性酶
切位点的增加或缺失。因此, 酶切后产生的片段数
24 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 3期
目发生了改变, 即所谓的限制性片段长度多态性
( Rest riction length polymorphisms, RFLP)。然后
进行凝胶电泳, 酶切后的 DNA 片段根据大小在凝胶
电泳上进行分离,染色后即可观察各个不同的片段,
进行遗传变异的分析。不同样品总 DNA 酶切后即
可产生限制性酶切多态性,然而检测这些多态性差
异时,需要使用标记的 DNA 探针来加以确定[ 24, 25]。
另一种方法可以不需要 DNA 探针杂交, 首先对
DNA 片段进行限制性酶切, 然后靶定 DNA 特定片
段,通过 PCR扩增,来显示限制性片段多态性,即所
谓的扩增片段长度多态性( Amplif ication f ragment
leng th polymorphisms, AFLP)
[ 26, 27]。对病原微生
物而言,这种诊断是相当有用而直接的方法。也可
以鉴别特定的寄生虫[ 28, 29]。Chang Y S[ 30] 等从美国
三个不同的海岸水体 ( N ewYork, NewJersey, and
Texas)收集蓝蟹( Callinectessapidus) , 通过 PCR检
测和原位杂交分析两步诊断证实存在白斑综合症病
毒 ( w hite spot syndrome v ir us, WSSV )。通过
RFLP 方法, 对于一个 1 156bp 片段的 WSSV rr-l
specific RsaI进行扩增, 从而区别 New Jersey 蓝蟹
WSSV 和其它地方分离的 WSSV。
7 结语
核酸检测技术作为现代分子生物学的常规技
术,在水产养殖各种疫病的预警中发挥了重大作用。
大量的研究表明核酸检测方法具有灵敏度高、特异
性强、简便快捷等特点, 是常规方法无法比拟的, 应
用潜力非常之大。同时, 应该注意的是核酸检测技
术也有其缺点, 除了斑点杂交等检测方法外, 其它核
酸检测技术一般不便在基层临床使用。所以, 其作
用受到了一定的限制; 生产上在选择使用哪种检测
方法时,一定要考虑到自身的实验条件以及检测所
要求的灵敏度, 不能拘泥不前, 也不能盲目追求先
进,选择适合自己的检测方法,为疾病的快速准确诊
断、流行病的预防、SPF 动物育种提供可靠的依据,
推动水产养殖业的健康发展。
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