全 文 ： 综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年增刊
冰核细菌及冰核基因的应用研究进展
谢翔 王玉 刘汉林 王贵学
(重庆大学生物工程学院,重庆 400044)
摘 要: 引起水由液态变为固态的物质称为冰核或成核剂。冰核种类繁多, 目前已发现 4属 23种或变种的
细菌、4属 11种或变种的真菌和 1种病毒,它们都具成冰活性。细菌冰核是一类蛋白质, 也称冰蛋白, 由细菌冰核
基因编码。作为生物冰核领域的研究重点,冰核细菌的研究已涉及到促冻杀虫、防霜冻、植物病害等多个领域; 同
时冰核细菌已成功地应用于人工降雪、制冷和高敏检测等方面,具有广阔的应用前景。主要对冰核细菌的应用研
究现状和发展进行综述。
关键词: 冰核细菌 冰核基因 应用
Progress on the Applied Studies of Ice
Nucleation-activation Bacteria and Its Gene
X ie X iang W ang Yu LiuHan linW ang Gu ixue
(College of B ioeng ineering , Chongqing University, Chongq ing 400044)
Abstrac:t The m ater ia ls wh ich can m ake the state of w ater change from liqu id to so lid are ca lled ice nuc lear o r nu-
c leation agents. Ice nuc leation has a great var iety, includ ing bacter ia ( four genus and tw enty - three species and var ia-
tions), fung i( four g enus and eleven spec ies and var ia tions) and one genus o f v irus. They all have the ac tiv ity o fm aking
the w ater becom e ice. B ac teria l ice nucleation which is one k ind of prote in, also ca lled ice prote in, is coded by bacteria l
ice nucleation g enes. A s a key stone o f research top ics in the biolog ica l ice nucleation field, the studies on ice nucleation ac-
tive bacteria are referr ing to killing insect pests by increasing co ld, anti- frosting and p lant disease, ect. And ice nuclea-
tion active bacteria has been app lied to such fields as artificia l snow ing, freezing , h igh sensitive checking , wh ich has ex-
tensive prospect o f application. Th is artic le rev iew s the studies on the applica tion and deve lopm ent abou t ice nucleation ac-
tive bacteria.
Key words: Ice Nucleation A ctive Bacteria Ice Nucleation Gene Application
基金项目:获得重庆大学生物工程学院创新人才培养基金和重庆大学大学生创新基金资助
作者简介:谢翔 ( 1983-) ,男,本科,主要从事生物工程专业学习和研究工作
1引言
众所周知,水结冰需要一种物质来催化,这种能
引起水从液态向固态转变的物质称冰核。不同种类
冰核催化活性差异很大, 非生物冰核可在-10左右
诱发小体积水结冰, 而自然界中活性最强的冰核来
自生物体 [ 1]。研究者将一些可以在-5 以上产生
冰核活性的生物称为冰核生物。自 1974年 M aki首
次从赤杨树叶中分离到在-2~ -5下诱发植物结冰
发生霜冻的冰核细菌 ( Ice nucleation active bacteria,
即 INA细菌 )以来, 冰核细菌引起了许多国家不同
学科如植物病理学、细菌学、植物生理学、园艺学和
气象学等研究者的广泛兴趣。他们深入开展了基础
理论和应用研究,在细菌冰核的种类、影响成冰活性
的因素、冰核细菌分子生物学及其应用等方面取得
了较大的进展。特别是在冰核细菌和冰核基因的应
用方面取得了非常大的进展。
2冰核细菌的应用
2. 1冰核细菌与防霜冻技术
霜冻是一种严重的自然灾害,能够在短短几小
时内毁坏大片农作物, 给农业生产造成重大损失。
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2006年增刊
长期以来人们普遍认为植物霜冻是由低温和植物的
霜敏感性所决定,但难以圆满解释霜冻的多方面原
因。自从发现冰核细菌以来,就引起人们的关注,世
界上有美、日、中等 20几个国家, 对冰核细菌进行了
全面系统的研究。近 10年来, 国内外大量研究证
明 [ 2] ,冰核活性细菌广泛存在于自然界中。存在于
植物体内的冰核细菌可在-2~ -3诱发植物细胞水
结冰而发生霜冻; 而无 INA细菌存在的植物, 一般
可耐-6 ~ -7的低温不发生或发生轻微霜冻。因
此,这一发现为研究和防御植物霜冻开辟了一条新
途径。
2. 1. 1冰核细菌诱发植物霜冻机理 农作物发生
的霜冻害是植物细胞间水发生结冰引起的, 而结冰
的必要条件是温度降到冰点以下和存在冰核。采用
人工模拟霜箱和自然诱发霜冰方法,以玉米、大豆、
番茄、黄瓜和菜豆等植物为研究对象进行试验。结
果表明 [ 3] ,喷施 INA细菌的植物,叶温在-25~ -3
时就发生严重霜冻, 而对照无菌苗则在-6 ~-7时
才发生霜冻, 两者相差 3 ~ 4 , 这说明冰核细菌产
生的冰核可诱发植物体内过冷却态水在较高的温度
下结冰,充分证明了 INA 细菌是诱发和加重农作物
霜冻的重要因素。因此研究用化学、物理和生防方
法防除 INA 细菌,减轻农作物霜冻危害,是防御霜冻
研究的重要组成部分,现已取得了成效。
2. 1. 2药剂防霜 研制或筛选防除 INA 细菌的药
剂,必须具有杀灭 INA 细菌和破坏冰蛋白成冰活性
的功能,方能取得防霜效果。美国用一羧酸脂化丙
烯酸聚合物 ( CRYOT2ED )喷洒叶面, 形成薄膜, 阻
止 INA细菌繁殖来防御果树和蔬菜霜冻。安建勇
等 [ 4]人研究了利用药剂和生防菌防除玉米叶片上
的 INA细菌, 研究结果表明, 在-46霜冻条件下,
不同药剂有不同程度的防霜效果。其中霜剂 1号防
效达到极显著水平, 它能杀灭 INA 细菌和破坏冰核
活性物质 (冰蛋白 ) ,可以减轻或控制玉米早危害。
用药剂防霜关键需要研制出一种具有内吸性、
既能杀灭冰核细菌又能破坏冰蛋白活性、残效期长、
无毒无害的新农药, 就会大大提高药剂防霜的效果
和快速推广应用。
2. 1. 3生防方法防霜 从自然界植物体上的多种
微生物中, 筛选对 INA细菌有拮抗作用、营养竞争
能力强、抑杀或寄生性强的菌株,对其进行了人工生
产繁殖,再喷洒在植物体上,以期控制或杀灭 INA 细
菌,达到防御霜冻的目的。
2. 1. 3. 1拮抗菌防霜 中国农科院植保所研究人
员 [ 5]经过人工霜箱防霜试验,从 83株对 INA细菌
有拮抗作用的菌株中筛选获得 6株细菌,用于番茄、
烟草和黄瓜,具有一定防霜效果,可使霜冻温度降低
1. 5~ 2. 0。崔汝强等 [ 6]从多种植物根际土壤中
分离到 300个细菌分离物, 通过含菌平板培养筛选
出 F015、F023、F046等近 20株对冰核细菌具有较强
的拮抗力,对其进一步进行室内抗菌机理、菌株鉴定
和室外田间小区实验。实验结果表明,菌株初步鉴
定为芽孢杆菌 (Bacillus spp. )和假单胞杆菌 (P seud-
omonas spp. )。其代谢产物蛋白质粗提物对冰核细
菌的生长有明显的抑制作用。室外防霜效果在 19.
5% ~ 36. 9% , 可有效地控制霜冻害的发生与危害,
具有广阔的应用前景。
2. 1. 3. 2基因工程菌防霜 基因工程菌防霜就是
选择有拮抗作用, 营养竞争、定殖能力和抗逆性强,
又对植物无致病性的 INA细菌,采用生物技术手段,
将 INA 细菌的冰核活性基因切除或缺失, 从而获得
无冰核活性的变异基因工程菌, 该菌除无冰核活性
特性外,仍保持原 INA细菌的优异生物学特性,用于
防除 INA 细菌来防御植物霜冻。这种方法比从自然
界筛选拮抗生防菌成功率高, 效果好。
2. 1. 4噬菌体防霜 噬菌体是寄生细菌体内的一
种病毒,它利用细菌体内营养物质进行自身繁殖,最
后导致细菌解体而死亡。国外已经进行利用噬菌体
来防除植物体表面 INA 菌的研究, Kozlo tt等从 E.
herbibola ( INA细菌 )上分离到特异性噬菌体,把它喷
洒在植物体上, 再低温处理 24h, 尔后调查霜冻危
害,结果处理霜冻率比对照减轻 20% ~ 25% ; 田间
试验中霜害减轻了 40% ~ 50%。故认为利用专化
特异性噬菌体杀灭 INA 细菌来减轻或控制植物霜
冻,也是一条值得研究和探索的防霜途径。
2. 2冰核细菌与植物病害
研究证明 INA细菌大多属于植物致病细菌, 如
P s. viridif lava、P s. syringae pv. coronafaciens、Erw. ana-
nas等。在毛得奖等 [ 7]的最新研究中发现, 感染冰
核细菌溃疡病的杨树树皮内源生长素 ( IAA)和玉米
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2006年增刊 谢翔等: 冰核细菌及冰核基因的应用研究进展
素 ( ZR)含量要高于未被感染的健壮杨树,而同时感
染的杨树树皮内源赤霉素 ( GA4 )和脱落酸 ( ABA )
含量要低于未被感染的健壮杨树。内源激素的变化
最终导致感染杨树患病部位肿茎形态结构的形成、
略变活跃的生理状态以及抗寒能力的降低, 这个发
现也许能为病害防治提供新的科学依据和新的防治
途径。在杨凤连 [ 8]等对冰核活性细菌在不同处理
时间对菜青虫血淋巴免疫系统的影响的研究中发
现,采用水浴法可使菜青虫血淋巴免疫力被破坏,同
时结果还表明冰核活性细菌主要是在低温条件下通
过体表侵入菜青虫血淋巴而影响其免疫力。Tang C
等 [ 9]发现,在阴沟肠杆菌中转入冰核基因可以使玉
米螟和棉铃虫的耐寒能力降低;同时,他们将转基因
的阴沟肠杆菌喷洒到植物上,结果发现,虫害得到了
控制。
2. 3冰核细菌在其它方面的应用
冰核细菌的发现和研究的重要意义在于生物冰
核是一种有广泛作用的资源。冰核细菌的研究已从
INA细菌的种类、与植物霜冻害关系的研究转向冰
核资源的开发与应用,主要包括以下几个方面。
2. 3. 1人工降雪 1980年, W oerpelMD用冰核细
菌研制成冰蛋白人工降雪催化剂, 并申请专利。
1985年由美国的 Advanced Genetic Sciences Co. 生
产了商品名为 Snomax的冰蛋白人工降雪催化剂, 在
美国 18个滑雪场使用,获得巨大成功 [ 1]。
2. 3. 2食品冷冻浓缩 冰核细菌应用于食品冷冻
浓缩中, 冰核细菌具有在较高温度 (-2~ -5 )下形
成规则、细腻、异质冰晶的能力。因此, 将一定浓度
的冰核菌液喷于待冷冻的食品上, 可在 (-2 ~-5 )
条件下贮藏 [ 10 ]。一方面可以提高冻结的温度, 缩短
冻结时间,节约能源, 另一方面又可避免由于过冷却
现象造成冷冻食品风味与营养成分损失过多等弊
端,最大限度地保持食品原料中的芳香组分,改善冷
冻食品的质地。W idehem等 [ 11]实验发现, 使用假单
胞菌 (含有冰核基因 )属比用碘化银更能有效地降
低过冷却温度,同时在进行冷冻浓缩分析发现,假单
胞菌属导致晶体中蔗糖含量降低, 从而有效的对食
品进行冷冻浓缩。
2. 3. 3促冻杀虫 昆虫体重的 60% ~ 80%由水分
组成, 由于水的过冷却特性,使得昆虫在一定的低温
条件下不会因体内结冰而死亡。这也是昆虫具备抗
寒能力,越冬后仍能生存的主要原因。冰核活性细
菌能提高昆虫的过冷却点, 使其在较高的亚零下温
度下体内结冰,从而提高避免结冰类型昆虫的越冬
死亡率。云南农业大学段波等 [ 12]的研究中,他们对
黄粉甲的幼虫分别喂食 6株 INA细菌后不同时间
内,幼虫的过冷却点都被有效的提高。利用 INA细
菌促冻杀虫、提高害虫越冬死亡率、减轻下一年危
害,为控制害虫危害提供了一条生防新途径。
2. 3. 4海水淡化在水溶液冻结过程中,许多无机
矿物质留在浓缩了的溶液中, 而在所形成的冰块中
含量则很低。利用这种原理, 将海水连续通过几个
低温水池后,就可收集到以冰块形式存在、高质量的
饮用淡水 [ 13 ]。国外正在研究冰核细菌在这种海水
净化中的应用,一旦生产出可以在海水中发挥高冰
核活性安全型冰核细菌产品, 将会大幅度降低海水
淡化成本,增加生产效率和提高产量。
3冰核基因的应用
冰核细菌的冰核活性是由其所携带的冰核基因
所赋予的。自 Orser ( 1983) 从 E rw in iaherbico la中
克隆到第一个冰核基因 iceE以来,已先后有 8个细
菌冰核基因得到克隆和测序。应用冰核基因, 将克
隆到的基因进行异源表达,可以满足更多要求,有着
更广的应用范围。
3. 1细菌细胞表面展示
细菌细胞表面展示是指利用合适的外膜锚定基
团来实现异源蛋白在细菌细胞表面的活性表达, 这
方面研究已成为应用微生物学、生物技术和免疫学
上越来越重要的研究课题。近几年,研究者开始利
用细菌冰核蛋白进行细菌细胞表面展示。细菌冰核
蛋白 ( INP)是一种外膜蛋白,其 C2端暴露在细胞外
膜上,因此, 融合到 INPC2端的外源蛋白即位于细
胞表面上。此外 INP在细菌培养物达静止生长期时
仍可稳定存在, INP基因中部的重复区对 DNA重排
有较强的抗性,能抵抗 DNA重排而正常表达冰核活
性 [ 14] ,这样用 INP作细菌细胞表面展示时, 可同时
利用简捷、灵敏的冰核活性测定 (即冰核基因活性
表达的测定方法 )来间接检测异源基因的表达, 这
些特性使 INP成为一种理想的锚定基团在细菌细胞
表面展示上应用。在 Kang SM等 [ 15]的研究中,用冰
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2006年增刊
核基因产生的缺失 INC的冰核蛋白在大肠杆菌中
实现对折叠的蛋白质肽结构的展示, 从而完成了对
丙型肝炎病毒的核心抗原的表位图形的制作。
3. 2促冻杀虫
促冻杀虫基因工程菌 Enc1. 2022ina的构建,解
决了阻碍冰核细菌促冻杀虫应用中的难题, 为防治
我国北方地区重要农林果树和仓储主要越冬害虫探
索出了一条生防新途径。该工程菌可以在无选择压
力下冰核基因仍稳定存在并有效表达冰核活性的。
经应用试验证明 [ 16 ] ,用该工程菌饲喂玉米螟幼虫,
在饲菌后 9d内,虫体的过冷却点比不饲菌的对照提
高 10左右; 在饲菌后第 6d, 于-5和-7低温下
处理 12h, 工程菌处理过的幼虫冻死率分别为 85%
和 100%, 而对照虫体的冻死率分别为 0%和 5%。
试验还证明,该工程菌可以在昆虫体内稳定定殖增
生,在植物上附生定殖能力明显比野生型冰核细菌
弱。
3. 3报告基因
构建冰核基因与其他待检测基因的融合系统,
可用作目标基因表达检测的报告基因。冰核基因作
报告基因不仅可以用以研究植物与微生物互作用、
研究营养元素利用,还可以用于 hrp基因研究、根际
和叶围某些细菌基因的活性检测 [ 17 ]。与常规报告
基因相比, 用冰核基因做报告基因有几方面优点:
( 1)由于冰核的形成是一个物理过程, 不需要酶化
学反应,扩大了冰核基因作报告基因的应用范围;
( 2)活性检测所需的设备为低温酒精槽, 费用低,检
测方便快捷、效率高, 一般只需 3m in; ( 3)其检测灵
敏度同荧光素酶相当; ( 4)在 6个数量级的范围内,
冰核数量与冰核基因产物的剂量间呈对数线性关
系,因此可用冰核活性强弱来定性定量衡量检测基
因表达量的多少。
3. 4微生物高敏检测
W olber将冰核基因整合到对沙门氏菌具特异
性的噬菌体中,然后将改造后的噬菌体加到待测的
食品或水源样品中,经培养后检测冰核活性。利用
这种方法可检测到 107个杂菌中含 10个沙门氏菌
或 1m l水中含 10个沙门氏菌, 检测快捷、灵敏。而
在 DeAngelis KM等 [ 18 ]的研究中发现, 以冰核基因
为基础的细菌传感器可以检测在自然环境中相关的
微生物中的硝酸盐的利用率和存在率。
4展望
自 20世纪 70年代生物冰核发现以来,美国、日
本和加拿大等 30多个国家对其进行了研究, 召开了
7次国际生物冰核研讨会, 在生物冰核的种类、影响
成冰活性的因素、冰核基因、冰蛋白以及生物冰核与
植物霜冻和病害、冰核细菌的应用等方面取得了较
大进展, 但还有一些问题需要进一步研究和突破,
特别是在冰核细菌的应用水平还有待进一步的提
高。冰核细菌是重要的资源, 有广阔的应用前景,目
前的开发和应用还远远不够, 所以其应用基础和应
用技术将继续是研究的热点, 如食品冷冻浓缩和促
冻杀虫等。
我国于 1986年开展对冰核细菌的研究,起步较
晚,在生物冰核的基础理论和应用研究上远远落后
于美国、日本等国家, 如生物冰核分子生物学、冰核
细菌的发酵工艺、冰核细菌的浓缩和干燥技术, 生
物冰核在降雪和制冷方面的应用技术、在食品冷冻
浓缩中的应用技术等,这些方面的研究不足,严重限
制了我国生物冰核资源的开发和应用。因此亟待加
强冰核细菌方面的研究及其开发应用。
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