全 文 ：第 １３卷第 １期
２０１５年 １月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 １
Ｊａｎ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０１􀆰 ００７
收稿日期：２０１３－１２－１３
基金项目：上海烟草集团有限责任公司科技项目（ＳＺＢＣＷ２０１０００７４４）
作者简介：李士林（１９８７—），男，山东临沂人，硕士研究生，研究方向：发酵工学；许赣荣（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｇｒｘｕ１２３＠ １２６􀆰 ｃｏｍ
耐高温菌的分离及在固态发酵上部烟叶中的应用
李士林１，王宜君１，汤朝起２，许赣荣１
（１􀆰 江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 ２１４１２２；
２􀆰 上海烟草集团有限责任公司，上海 ２０００８２）
摘　 要：从上部低次烟叶中筛选出耐高温淀粉酶产生菌 ＧＷ ２和耐高温蛋白酶产生菌 ＧＷ ３，通过对菌落的形态
观察、１６Ｓ ｒＲＮＡ的鉴定和同源性分析，初步确定 ＧＷ ２为解淀粉芽胞杆菌，ＧＷ ３为枯草芽胞杆菌。 对上部低次
烟叶进行双菌种固态发酵，并优化发酵条件，最佳发酵条件：ＧＷ ２菌悬液（ＯＤ６００ ＝ １）接种量为 ７􀆰 ５ ｍＬ ／ ｇ，ＧＷ ３
菌悬液（ＯＤ６００ ＝ １）接种量为 １０ ｍＬ ／ ｇ，物料填充度为 ５００ ｍＬ三角瓶中装 ５０ ｇ 烟叶干基，当烟叶发酵水分质量分数
为 ４５％时，４８ ℃发酵 ５ ｄ。 在该发酵条件下，上部低次烟叶的淀粉降解率为 ２２􀆰 ３３％，蛋白质降解率为 １６􀆰 ７４％。 烟
叶淀粉和蛋白质的质量分数较大幅度下降，其含量指标接近优等烟叶的含量。 该发酵方式比传统的贮存式烟叶发
酵大大缩短了发酵时间。
关键词：上部低次烟叶；耐高温有益菌；固态发酵；淀粉；蛋白质
中图分类号：Ｑ９３　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０１－００３５－０７
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａｌｓ ｔｏ ｓｏｌｉｄ⁃ｓｔａｔｅ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｐｐｅｒ⁃ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｔｏｂａｃｏｏ
ＬＩ Ｓｈｉｌｉｎ１，ＷＡＮＧ Ｙｉｊｕｎ１，ＴＡＮＧ Ｚｈａｏｑｉ２，ＸＵ Ｇａｎｒｏｎｇ１
（１􀆰 Ｔｈｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ； ２􀆰 Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｇｒｏｕｐ Ｃｏ􀆰 Ｌｔｄ．，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００８２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ｔｗｏ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｏｂａｃｏｏ ｌｅａｖｅｓ􀆰 Ｏｎｅ ｉｓ ａｎ ａｍｙｌａｓｅ
ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎ ｎａｍｅｄ ＧＷ⁃２ ａｎｄ ａｎｏｔｈｅｒ ｉｓ ａ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎ ｎａｍｅｄ ＧＷ⁃
３􀆰 Ｂｙ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｅｓ ａｎｄ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｉｓ， ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ􀆰 Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｏｂａｃｃｏ
ｓｏｌｉｄ⁃ｓｔａｔｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｍｏｎｏｆａｃｔｏｒｉａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ􀆰 Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｏｌｉｄ⁃ｓｔａｔｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｔｈａｔ： ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ
ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ（ＯＤ６００ ＝ １） ｏｆ ＧＷ⁃２ ａｎｄ ＧＷ⁃３ ｗｅｒｅ ７􀆰 ５ ｍＬ ／ ｇ ａｎｄ １０ ｍＬ ／ ｇ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｃｈａｒｇｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ
ｔｏｂａｃｏｏ ｗａｓ ５０ ｇ （５００ ｍＬ ｆｌａｓｋ），ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ４８ ℃，ｍｏｉｓｔｕｒｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｂａｃｃｏ
ｗａｓ ４５％ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｗａｓ ５ ｄ􀆰 Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｏｌｉｄ⁃ｓｔａｔｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｓｔａｒｃｈ ａｎｄ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｕｐｐｅｒ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｆｌｕｅ⁃ｃｕｒｅｄ ｔｏｂａｃｃｏ ｗｅｒｅ ２２􀆰 ３３％ ａｎｄ １６􀆰 ７４％，
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ􀆰 Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｕｐｐｅｒ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｆｌｕｅ⁃ｃｕｒｅｄ ｔｏｂａｃｃｏ ｗａｓ ｃｌｏｓｅ ｔｏ ｔｈｅ
ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｐ ｑｕａｌｉｔｙ ｔｏｂａｃｃｏ􀆰 Ｉｎ ｔｈｉｓ ｗａｙ， ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｗａｓ ｇｒｅａｔｌｙ ｓｈｏｒｔｅｎｅｄ ｔｈａｎ
ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｓｔｏｒａｇｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ􀆰
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： ｕｐｐｅｒ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｆｌｕｅ⁃ｃｕｒｅｄ ｔｏｂａｃｃｏ； ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａｌｓ； ｓｏｌｉｄ⁃ｓｔａｔｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；
ｓｔａｒｃｈ； ｐｒｏｔｅｉｎ
　 　 国内优等烟叶中淀粉和蛋白质的质量分数一
般在 ４％和 ７％左右［１］，而本实验所涉及的上部低次
烟叶中的淀粉、蛋白质的质量分数分别为 ７％以上
和 １０％以上，较优等烟叶明显偏高，致使吸食后香
气欠缺、较苦、刺激性大，目前只用于低档卷烟的配
方中，或者直接丢弃，严重影响了卷烟行业的经济
效益［２－４］。 如果能降低上部低次烟叶中淀粉和蛋白
质的含量，可有效减少烟叶在吸食过程中产生的辛
辣味和刺激性，提高烟叶的利用价值，减少资源的
浪费［５］。
烟叶表面定殖大量微生物，这些微生物在烟
叶的贮存过程中对于改进烟叶品质发挥一定的作
用。 目前，利用人工接种微生物对烟叶进行发酵
的研究也有不少报道，但是大多数研究均局限于
低水分 （发酵水分低于 ２０％） 下的贮存式发
酵［６－７］ 。 在固态低水分状态下，微生物的生长代谢
速度一般较为缓慢，因此会影响烟叶发酵陈化的
速度。 而烟叶在高水分发酵时，虽然可以加快发
酵速度，但是也极易引起霉菌的生长。 笔者在研
究中发现，当烟叶发酵温度超过 ４８ ℃时，未发现
烟叶发霉现象。 所以采用高温、高水分发酵的方
法值得探索。 从烟叶中筛选产淀粉酶和蛋白酶的
耐高温微生物，并将其应用于烟叶的固态发酵，有
可能加速并有效地降解低次烟叶中的淀粉和蛋白
质，从而提高烟叶的品质。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料与仪器
上部低次烟叶（２０１２年福建烟叶），由上海烟草
集团有限责任公司提供； Ｈ２ ２ 型电热恒温振荡水
槽，上海精宏实验设备有限公司； ＵＶ ３０００ 型紫
外 可见分光光度计，日本 Ｈｉｔａｃｈｉ 公司；ＦＡ １００４ 型
电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；
ＰＬ６０２ Ｓ型电子天平，ＭＥＴＴＬＥＲ ＴＯＬＥＤＯ 仪器上
海仪器有限公司；ＰＢ １０ 型 ｐＨ 计，ＳａｒｔｏｒｉＵｓ 公司；
Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＭＡ ４０型红外线水分测试仪，德国赛多利
斯公司；ＰＹＸ ＸＨＳ ４０５ 型电热恒温培养箱，上海
跃进医疗器械厂；ＳＷ ＣＪ ＩＦＤ 型超净工作台，苏
州安泰空气技术公司。
富集培养基（ ｇ ／ Ｌ）：牛肉膏 ５􀆰 ０，蛋白胨 １０􀆰 ０，
ＮａＣｌ ５􀆰 ０；ｐＨ ７􀆰 ０～７􀆰 ２。
种子液培养基：同富集培养基。
肉汤琼脂培养基 （ ｇ ／ Ｌ）：牛肉膏 ５􀆰 ０，蛋白胨
１０􀆰 ０，琼脂 ２０􀆰 ０，ＮａＣｌ ５􀆰 ０；ｐＨ ７􀆰 ０～７􀆰 ２。
斜面保藏培养基：同肉汤琼脂培养基。
淀粉液态培养基 （ ｇ ／ Ｌ）：蛋白胨 １０􀆰 ０， ＮａＣｌ
５􀆰 ０，可溶性淀粉 ２０􀆰 ０；ｐＨ ７􀆰 ０～７􀆰 ２。
淀粉琼脂培养基 （ ｇ ／ Ｌ）：蛋白胨 １０􀆰 ０， ＮａＣｌ
５􀆰 ０，可溶性淀粉 ２０􀆰 ０，酵母膏 ５􀆰 ０，琼脂 ２０􀆰 ０；ｐＨ
７􀆰 ０～７􀆰 ２。
奶粉液态培养基：酵母膏 ５􀆰 ０ ｇ，蛋白胨 １０􀆰 ０ ｇ，
ＮａＣｌ ５􀆰 ０ ｇ，琼脂 ２０􀆰 ０ ｇ，去离子水 ９００ ｍＬ。 脱脂奶
粉 １０ ｇ，溶于 １００ ｍＬ 去离子水中，１２１ ℃灭菌 ２０
ｍｉｎ。 将二者在无菌环境下混匀。
奶粉琼脂培养基：于奶粉液态培养基中加 ２０
ｇ ／ Ｌ的琼脂。
以上培养基都调节 ｐＨ 至 ７􀆰 ０ ～ ７􀆰 ２，于 １２１ ℃
灭菌 ２０ ｍｉｎ。
豆芽汁培养基：黄豆芽 ２００ ｇ，蒸馏水 １ Ｌ，煮沸
１５ ｍｉｎ，用纱布过滤，加葡萄糖 ２０􀆰 ０ ｇ，酵母膏 ０􀆰 ５
ｇ，ｐＨ自然，１２１ ℃灭菌 ２０ ｍｉｎ。
１􀆰 ２　 实验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 耐高温淀粉酶产生菌和蛋白酶产生菌的分
离筛选
耐高温菌的筛选　 取粉碎后的烟叶末 １􀆰 ０ ｇ，装
入盛有 １００ ｍＬ 富集培养基的 ５００ ｍＬ 三角瓶中，
５０ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ 摇床培养 ２４ ｈ。 将培养液涂布到
肉汤琼脂培养基平板中，于培养箱 ５０ ℃恒温培养
７２ ｈ，将生长出的细菌通过划线法获得单菌落后接
入斜面保存。
初筛　 将筛选出的单菌落分别点接种到淀粉
培养基平板和奶粉培养基平板中，５０ ℃培养 ２４ ｈ，
筛选出的菌株接入斜面保藏。
筛选菌株发酵液酶活测定 　 将初筛得到的单
菌落分别接种到含 １００ ｍＬ种子液培养基的 ５００ ｍＬ
三角瓶中，５０ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ 摇床培养 ２４ ｈ，然后分
别取 ２ ｍＬ菌液接种至 １００ ｍＬ淀粉液态培养基或奶
粉液态培养基的 ５００ ｍＬ三角瓶中，５０ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ
培养 ７２ ｈ；发酵液于 ８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 ５ ｍｉｎ，取上清
液测酶活。
６３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
菌株的复筛　 取 ５０ ｇ烟叶，分别喷洒单一菌株
的菌悬液 ５ ｍＬ，补水至烟叶水分质量分数为 ４０％，
将烟叶装入 ５００ ｍＬ 三角瓶中，５０ ℃下发酵 ３ ｄ，发
酵结束后测烟叶的淀粉和蛋白质含量。 分别筛选
出淀粉和蛋白质降解率最高的菌株，接入斜面保藏。
１􀆰 ２􀆰 ２　 种子菌悬液的制备
用接种针将斜面上的菌种点接到含 １００ ｍＬ 种
子液培养基的 ５００ ｍＬ 三角瓶中，３７ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ
摇床培养 ２４ ｈ，然后分别取 ２ ｍＬ 种子液接种至含
１００ ｍＬ豆芽汁培养基的 ５００ ｍＬ 三角瓶中，３７ ℃、
２００ ｒ ／ ｍｉｎ摇床培养 ２４ ｈ，４ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 ５ ｍｉｎ，取
菌体，加适量无菌水，配制成 ＯＤ６００ ＝ １ 的菌悬液，用
于人工接种发酵。
１􀆰 ２􀆰 ３　 双菌种固态发酵方法
量取优化后的菌株菌悬液 ３􀆰 ７５ ｍＬ、优化后的
菌种菌悬液 １０ ｍＬ均匀喷洒 ５０ ｇ烟叶（干基）中，补
水使烟叶水分质量分数为 ４５％。 将烟叶均匀装入
５００ ｍＬ三角瓶中，于培养箱中 ４８ ℃下发酵。
１􀆰 ３　 分析方法
１􀆰 ３􀆰 １　 发酵液淀粉酶和蛋白酶酶活的测定
采用 ３，５ 二硝基水杨酸（ＤＮＳ）法［８］测定淀粉
酶活性。 温度为 ５０ ℃时，１ ｍｉｎ 催化分解淀粉生成
１ ｍｇ麦芽糖所需酶量定义为 １ 个酶活（Ｕ），对 ３ 个
平行样品进行测定。
１􀆰 ３􀆰 ２　 蛋白酶酶活测定
采用 Ｆｏｌｉｎ 酚试剂显色法［９］测定蛋白酶活性。
温度为 ５０ ℃时，１ ｍｉｎ生成 １ μｇ酪氨酸所需酶量定
义为 １个酶活（Ｕ），对 ３个平行样品进行测定。
１􀆰 ３􀆰 ３　 细菌的形态特征
将 ３７ ℃培养 ４８ ｈ 的平板进行菌落形态观察，
将 ３７ ℃培养 ２４ ｈ 的种子液进行革兰氏染色，在油
镜下观察细菌的形态，参照文献［１０］。
１􀆰 ３􀆰 ４　 １６Ｓ ｒＤＮＡ序列分析
所用引物为细菌 １６Ｓ ｒＤＮＡ 的通用引物。
１６ＳＦ：５′ ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ ３′；１６ＳＲ：
５′ ＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ ３′由上海生工
生物工程技术服务有限公司合成。
扩增 （ ＰＣＲ）反应体系 （ ２５ μＬ）为 ｄＮＴＰ （ １０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ） ０􀆰 ５ μＬ，１０×ＰＣＲ 缓冲液 ２􀆰 ５ μＬ，Ｍｇ２＋（２０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ） ２ μＬ，引物（２０ μｍｏｌ ／ Ｌ） 各 ０􀆰 ５ μＬ，模板
ＤＮＡ（约 ５０ ｎｇ ／ μＬ）１ μＬ，Ｔａｑ酶（５ Ｕ ／ μＬ） ０􀆰 ２ μＬ，
补水至 ２５ μＬ 。
扩增（ＰＣＲ）程序：９５ ℃预变性 ５ ｍｉｎ，９４ ℃变
性 ３０ ｓ，５２ ℃退火 ４５ ｓ，７２ ℃延伸 ６０ ｓ，３５ 个循环；
最后 ７２ ℃延伸 ８ ｍｉｎ。 扩增产物用 ０􀆰 ７５％的琼脂糖
凝胶电泳回收，纯化后的产物进行测序，测序后获
得的 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列登录 ｈｔｔｐ： ／ ／ ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．
ｇｏｖ ／ Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ网站，用 ＢＬＡＳＴ 程序进行序列比对分
析，应用 ＣｌｕｓｔａｌＸ、Ｍｅｇａ４软件，采用 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ⁃Ｊｏｉｎｉｎｇ
法（邻接法）建立进化树状图。
１􀆰 ３􀆰 ５　 烟叶化学成分的测定
烟叶水分的测定采用红外快速水分测定仪测
定；烟叶水溶性总糖及淀粉的测定参照文献［１１］；
总氮、蛋白质测定采用凯氏定氮法；烟碱含量采用
紫外分光光度法。 淀粉和蛋白质的降解率的计算
见式（１）和式（２）。
淀粉降解率＝
ｗ（原烟叶淀粉）－ｗ（发酵后烟叶淀粉）
ｗ（原烟叶淀粉）
×１００％ （１）
蛋白质降解率＝
ｗ（原烟叶蛋白质）－ｗ（发酵后烟叶蛋白质）
ｗ（原烟叶蛋白质）
×１００％
（２）
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 耐高温淀粉酶产生菌的初筛结果
经 ５０ ℃平板培养，初筛获得 ５ 株耐高温细菌
（编号为 ＧＷ １ ～ ＧＷ ５）。 利用淀粉琼脂培养基
对这 ５ 株菌进行复筛，发现其中 ４ 株菌 ＧＷ １、
ＧＷ ２、ＧＷ ４和 ＧＷ ５具有淀粉降解能力，ＧＷ
３没有淀粉降解能力。 所测得的淀粉水解透明圈与
发酵液淀粉酶活力如表 １所示。
表 １　 ４株菌的淀粉水解透明圈及发酵液淀粉酶活力
Ｔａｂｌｅ １　 Ｓｔａｒｃｈ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｈａｌｏｓ ａｎｄ ａｍｙｌａｓｅ
ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ４ ｓｔｒａｉｎｓ
菌株
编号
透明圈
直径 ／ ｍｍ
菌落直
径 ／ ｍｍ
透明圈直径 ／
菌落直径
发酵液淀粉
酶活 ／ （Ｕ·ｍＬ－１）
ＧＷ １ ３０􀆰 ３ ２６􀆰 ４ １􀆰 １５ ３􀆰 ８４
ＧＷ ２ ３０􀆰 ４ １９􀆰 ６ １􀆰 ５５ ４􀆰 ９９
ＧＷ ４ ２４􀆰 ７ １６􀆰 ５ １􀆰 ５０ ４􀆰 ４３
ＧＷ ５ ２２􀆰 ２ １２􀆰 ７ １􀆰 ７４ ２􀆰 ２１
由表 １比较不同菌种在平板上的透明圈直径 ／菌
落直径值以及发酵液淀粉酶活力发现，ＧＷ ５ 的透
明圈直径 ／菌落直径比值最大，ＧＷ ２的发酵液淀粉
７３　 第 １期 李士林等：耐高温菌的分离及在固态发酵上部烟叶中的应用
酶活力最高。 鉴于鉴定培养基与烟草发酵基质成分
上存在差异性，本研究进一步将 ４株菌接种至烟叶发
酵基质进行发酵实验考察烟叶中淀粉的降解情况，对
照组为不接种烟叶，结果如图 １所示。
图 １　 不同菌株发酵后烟叶淀粉降解率的比较
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ
ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ｌｅａｆ ａｆｔｅｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
由图 １ 可见：４ 株淀粉酶产生菌均对烟叶中的
淀粉有不同程度的降解，其中 ＧＷ ２ 菌株的淀粉
降解率最高，故选择 ＧＷ ２ 为最佳发酵菌株。
２􀆰 ２　 耐高温蛋白酶产生菌株的筛选
利用奶粉琼脂培养基对 ５ 株菌进行复筛，发现
ＧＷ １、ＧＷ ２、ＧＷ ３、ＧＷ ４ 和 ＧＷ ５ 具有蛋
白质降解能力。 所测得的蛋白质水解透明圈与发
酵液淀粉酶活力如表 ２所示。
表 ２　 ５株菌的蛋白质水解透明圈及发酵液蛋白酶活力
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｈａｌｏｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ
ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ５ ｓｔｒａｉｎｓ
菌株
编号
透明圈
直径 ／ ｍｍ
菌落直
径 ／ ｍｍ
透明圈直径 ／
菌落直径
发酵液蛋白
酶活 ／ （Ｕ·ｍＬ－１）
ＧＷ １ ３４􀆰 ２ １９􀆰 ８ １􀆰 ７３ １６􀆰 ６５
ＧＷ ２ ３２􀆰 １ １５􀆰 ９ １􀆰 ２２ １６􀆰 ８４
ＧＷ ３ ３２􀆰 ３ ２６􀆰 ５ ２􀆰 ０２ ２７􀆰 ４１
ＧＷ ４ ２９􀆰 ２ １６􀆰 ４ １􀆰 ７８ ３３􀆰 ９７
ＧＷ ５ ５２􀆰 ３ ４１􀆰 ５ １􀆰 ２６ １９􀆰 ６９
由表 ２ 比较不同菌种在平板上的透明圈直
径 ／菌落直径比值以及发酵液蛋白酶活力发现，
ＧＷ ３的透明圈直径 ／菌落直径比值最大，ＧＷ ４
的发酵液蛋白酶活力最高。 鉴于鉴定培养基与烟
草发酵基质成分上存在差异性，本研究进一步将 ５
株菌接种至烟叶发酵基质进行发酵实验考察烟叶
中淀粉的降解情况，对照组为不接种烟叶，结果如
图 ２所示。
图 ２　 不同菌株发酵后烟叶蛋白质降解率的比较
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ
ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ｌｅａｆ ａｆｔｅｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
由图 ２可见：发酵结束后，５ 种菌对烟叶蛋白质
都有不同程度的降解，ＧＷ ２ 菌株虽然有蛋白酶酶
活性，但是在发酵过程中烟叶蛋白质降解率与对照
组相差不大，说明此菌株在烟叶发酵中没有表现出
蛋白酶酶活性。 ＧＷ ３的淀粉降解率最高，故选择
ＧＷ ３为最佳发酵菌株。
２􀆰 ３　 ＧＷ ２与 ＧＷ ３的形态观察
经平板培养 ４８ ｈ 后观察，ＧＷ ２菌落呈花瓣形
状，淡黄色不透明，菌落中间呈脉状；ＧＷ ３ 菌落呈
淡黄色不透明，边缘不整齐，中间凸起。 经液态培养
２４ ｈ后显微镜观察，ＧＷ ２菌株呈短杆状，ＧＷ ３菌
株呈球状或椭圆状，经革兰氏染色后，两株菌均呈
阳性。
２􀆰 ４　 ＧＷ ２与 ＧＷ ３的 １６Ｓ ｒＲＮＡ序列分析
ＧＷ ２菌株的 １６Ｓ ｒＲＮＡ序列全长为 １ ４１３ ｂｐ，
用 ＢＬＡＳＴ 进行比对，比对结果表明 ＧＷ ２ 与解淀
粉芽胞杆菌的同源性为 １００％，初步确定 ＧＷ ２ 菌
株为解淀粉芽胞杆菌。 菌株 ＧＷ ３ 菌株的 １６Ｓ
ｒＲＮＡ序列全长 １ ４０４ ｂｐ，用 ＢＬＡＳＴ 进行比对，比对
结果表明 ＧＷ ３ 与枯草芽胞杆菌的同源性为
１００％，初步确定 ＧＷ ３菌株为枯草芽胞杆菌，经比
对构建树状图，如图 ３所示。
２􀆰 ５　 双菌种固态发酵上部低次烟叶发酵条件的
确定
２􀆰 ５􀆰 １　 ＧＷ ３菌株菌悬液接种量的确定
由于上部低次烟叶蛋白质含量过高，从而导致
烟叶辛辣味，所以降低蛋白质的含量是首要目标。
本实验中，笔者设计 ＧＷ ３ 菌株菌悬液接种量为
２􀆰 ５～１５（ｍＬ ／ ｇ），发酵结束后测得烟叶蛋白质降解
率，如图 ４所示。
８３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
图 ３　 ＧＷ ２和 ＧＷ ３的 １６Ｓ ｒＤＮＡ序列系统发育进化树
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅｓ ｏｆ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｏｆ ＧＷ⁃２ ａｎｄ ＧＷ⁃３ ｓｔｒａｉｎ
图 ４　 ＧＷ ３接种量对烟叶蛋白质降解率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｏｆ ＧＷ⁃３′ｓ ｂａｃｔｅｒｉａｌ
ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｏｎ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ
　 　 由图 ４可见：蛋白质的降解率随着 ＧＷ ３菌悬
液用量的增加而升高，当接种量为 １０ ｍＬ ／ ｇ时，蛋白
质降解率达到最大值，之后随着接种量的增加，蛋
白质降解率基本不变。
２􀆰 ５􀆰 ２　 ＧＷ ２菌悬液接种量的确定
设计 ＧＷ ３接种量为 １０ ｍＬ ／ ｇ，ＧＷ ２接种量
为 ２􀆰 ５～１２􀆰 ５ ｍＬ ／ ｇ，发酵结束后烟叶淀粉和蛋白质
降解率如图 ５所示。
由图 ５ 可见：当 ＧＷ ２ 接种量达到 ７􀆰 ５ ｍＬ ／ ｇ
时，蛋白质的降解率开始有所下降，这可能是 ＧＷ
２生物量过多，影响了 ＧＷ ３ 的代谢。 故选择
ＧＷ ２的接种量为 ７􀆰 ５ ｍＬ ／ ｇ。
２􀆰 ５􀆰 ３　 物料填充度的影响
固态发酵时，烟叶物料填充度的大小会影响
Ｏ２的传递，进而影响微生物的生长。 设计物料填
充度范围为每 ５００ ｍＬ 三角瓶中 ３０ ～ ８０ ｇ 烟叶干
基，发酵结束后测得烟叶淀粉和蛋白质降解率，如
图 ６ 所示。
图 ５　 ＧＷ ２接种量对烟叶淀粉和蛋白质降解率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｏｆ ＧＷ⁃２′ｓ ｂａｃｔｅｒｉａｌ
ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｏｎ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ
ｓｔａｒｃｈ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ
图 ６　 物料填充度对烟叶淀粉和蛋白质降解率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆｉｌｌｉｎｇ ｄｅｇｒｅｅ ｏｎ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ
ｒａｔｅ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ
由图 ６可见：填充度为 ３０～５０ ｇ烟叶干基时，淀
粉和蛋白质的降解率维持较高且基本不变；当填充
度超过 ５０ ｇ烟叶干基时，淀粉和蛋白质的降解率会
随着填充度的增大而降低。 为了节省空间，最佳物
料填充度确定为每 ５００ ｍＬ三角瓶中填充 ５０ ｇ 烟叶
干基。
９３　 第 １期 李士林等：耐高温菌的分离及在固态发酵上部烟叶中的应用
２􀆰 ５􀆰 ４　 发酵温度的影响
当发酵水分质量分数达 ３０％以上时，发酵温度
只有到达 ４８ ℃以上时霉菌才不能生长，而发酵温度
过高会使烟叶变黑，故设置本实验发酵温度为 ４８、
５０、５２、５４ 和 ５６ ℃，烟叶淀粉和蛋白质降解率结果
如图 ７所示。
图 ７　 发酵温度对烟叶淀粉和蛋白质降解率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ
ｏｎ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ａｎｄ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ
由图 ７ 可见：烟叶淀粉和蛋白质的降解率随着
发酵温度的升高而下降，虽然 ２株菌都可以在 ４８ ℃
下生长，但温度的升高也会抑制菌体的生长活动。
所以本实验的发酵温度确定为 ４８ ℃。
２􀆰 ５􀆰 ５　 烟叶物料水分的影响
水分是影响固态发酵的重要条件，水分的高低
影响着微生物的生长代谢活动。 研究不同发酵水
分质量分数对发酵后烟叶的淀粉和蛋白质的降解
率的影响，结果如图 ８所示。
图 ８　 发酵水分质量分数对烟叶淀粉和
蛋白质降解率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ｌｅａｆ ｍｏｉｓｔｕｒｅ ｃｏｎｔｅｎｔ
ｏｎ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ａｎｄ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ
由图 ８ 可见：发酵结束后上部低次烟叶淀粉和
蛋白质降解率随着发酵水分的增加而逐渐提高。
当发酵水分质量分数超过 ４５％时，淀粉和蛋白质降
解率变化趋缓。 考虑到水分过高，发酵后烟叶的颜
色变深，发酵水分宜低不宜高，故发酵水分质量分
数选择 ４５％。
２􀆰 ５􀆰 ６　 发酵时间的影响
发酵时间对微生物生长及其代谢产物有重要
的影响。 在确定其他发酵条件下，设计不同的发酵
时间，发酵结束后烟叶淀粉和蛋白质的降解率如图
９所示。
烟叶在高水分高温度发酵过程中，烟叶的形
状和颜色随着发酵时间的延长而变化严重，因此
应该尽量缩短发酵时间。 本实验在发酵第 ５ 天
时，淀粉和蛋白 质 的 降 解 率 达 到 ２２􀆰 ３３％ 和
１６􀆰 ７４％。 淀粉和蛋白质的质量分数降低至
５􀆰 ８０％和 ８􀆰 ４９％，已经达到优等烟叶的含量要求，
而且从图 ９ 中还可看出，延长发酵时间，对提高烟
叶中淀粉和蛋白质的降解率没有明显的作用。 故
本实验决定发酵时间为 ５ ｄ。
图 ９　 发酵时间对烟叶淀粉和蛋白质降解率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ９　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ
ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ａｎｄ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ
２􀆰 ５􀆰 ７　 发酵结束后上部低次烟叶化学成分变化
将 ２􀆰 ５􀆰 ６中发酵结束的烟叶进行化学成分的测
定，结果如表 ３所示。
由表 ３ 可见：发酵结束后的烟叶较原烟叶淀粉
和蛋白质质量分数大幅度降低，水溶性总糖质量分
数略有上升，总氮和烟碱质量分数略有下降。 烟碱
的下降也会提高烟叶的利用价值。
施木刻值和糖氮比是衡量烟叶品质的重要标
准。 优等烟叶的施木刻值为 ２ ～ ２􀆰 ５，糖氮比为（６ ～
１０） ∶ １［１］。 发酵结束后的烟叶施木刻值更加接近 ２，
糖氮比更加接近 ６，烟叶的化学成分变得更加协调，
烟叶的品质得到了明显的改善。
０４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
表 ３　 双菌种发酵结束后烟叶的主要化学成分及其变化
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ａｆｔｅｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｗｏ ｓｔｒａｉｎｓ
组别 ｗ（水溶性总糖） ／ ％
ｗ（淀粉） ／
％
ｗ（蛋白质） ／
％
ｗ（总氮） ／
％
ｗ（烟碱） ／
％ 施木刻值 糖氮比
原烟叶 １２􀆰 ５４ ７􀆰 ４７ １０􀆰 ２０ ２􀆰 ７０ ２􀆰 ４０ １􀆰 ２３ ４􀆰 ６４
发酵烟叶 １３􀆰 ４３ ５􀆰 ８０ ８􀆰 ４９ ２􀆰 ５９ ２􀆰 ２３ １􀆰 ５８ ５􀆰 １８
　 注：施木刻值为水溶性总糖质量分数 ／蛋白质质量分数；糖氮比为水溶性总糖质量分数 ／总氮质量分数。
３　 结论
从上部低次烟叶中筛选出耐高温淀粉酶产生
菌 ＧＷ ２和耐高温蛋白酶产生菌 ＧＷ ３，通过对 ２
株菌菌落的形态观察和 １６Ｓ ｒＲＮＡ 的鉴定，初步鉴
定为解淀粉芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌。 利用 ２株菌
对上部低次烟叶进行双菌种固态发酵，并对发酵条
件进行优化，结果表明，上部低次烟叶双菌种固态
发酵的最佳发酵条件：ＧＷ ２ 菌悬液（ＯＤ６００ ＝ １）接
种量为 ７􀆰 ５ ｍＬ ／ ｇ，ＧＷ ３ 菌悬液（ＯＤ６００ ＝ １）接种量
为 １０ ｍＬ ／ ｇ，物料填充度为每 ５００ ｍＬ三角瓶中添加
５０ ｇ烟叶干基，发酵温度为 ４８ ℃，烟叶水分为 ４５％，
发酵时间为 ５ ｄ。 在该发酵条件下，上部低次烟叶的
淀粉降解率为 ２２􀆰 ３３％，蛋白质降解率为 １６􀆰 ７４％。
烟叶淀粉和蛋白质的含量得到了较大幅度的下降，
基本达到了优等烟叶的含量要求。
与传统的烟叶自然陈化相比，笔者所采用的高水
分双菌种固态发酵方法最大的优点在于能短时间内
大幅度降解上部低次烟叶中淀粉和蛋白质的含量，而
且由于采用高温发酵，基本上可杜绝霉菌的生长，避
免烟叶发霉产生异味。 但固态高温发酵对烟叶香气
成分及吸味的影响还有待于进一步考察。
参考文献：
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（责任编辑　 管　 珺）
１４　 第 １期 李士林等：耐高温菌的分离及在固态发酵上部烟叶中的应用