全 文 ：第 １３卷第 ２期
２０１５年 ３月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ２
Ｍａｒ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０２􀆰 ００２
收稿日期：２０１４－０３－１３
基金项目：浙江省重大科技专项重大社会发展项目（２０１２Ｃ０３００５ ２）
作者简介：马红叶（１９８６—），女，河南南阳人，硕士研究生，研究方向：工业生物技术；郑裕国（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｈｅｎｇｙｇ＠ ｚｊｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
重组大肠杆菌产疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶
分批补料发酵工艺
马红叶，郑仁朝，赵川东，郑裕国
（浙江工业大学 生物工程研究所 教育部生物转化与生物净化工程研究中心，浙江 杭州 ３１００３２）
摘　 要：为了获得低成本的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶（ＴＬＬ），在 ５ Ｌ 发酵罐发酵中对工程菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ＤＥ３） ／
ｐＥＴ２８ｂ ＴＬＬ的分批补料发酵工艺进行研究。 结果表明：以葡萄糖为碳源的补料培养基，采用溶氧（ＤＯ）反馈补料
策略进行补料，当 ＯＤ６００ ＝ ６０时降温至 ２８ ℃，分 ２次加入终质量浓度为 ３０ ｇ ／ Ｌ乳糖进行诱导表达。 优化后 ＴＬＬ的
表达量提高到 ７９８􀆰 ５ Ｕ ／ Ｌ，是优化前的 ２􀆰 ４倍。 本研究为规模化发酵重组菌生产 ＴＬＬ奠定了基础。
关键词：疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶；分批补料；发酵；大肠杆菌
中图分类号：Ｑ８１５　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０２－０００９－０４
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ ｌｉｐａｓｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａ ｃｏｌｉ
ＭＡ Ｈｏｎｇｙｅ，ＺＨＥＮＧ Ｒｅｎｃｈａｏ，ＺＨＡＯ Ｃｈｕａｎｄｏｎｇ，ＺＨＥＮＧ Ｙｕｇｕｏ
（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００３２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｃｏｓｔ⁃ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ ｌｉｐａｓｅ （ ＴＬＬ） ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ， ｆｅｄ⁃
ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ＤＥ３） ／ ｐＥＴ２８ｂ⁃ＴＬＬ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｉｎ ａ ５⁃Ｌ
ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ． Ｔｈｅ ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｓ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ ｗａｓ ｆｅｄ ｂｙ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｏｘｙｇｅｎ
（ＤＯ） ｆｅｅｄｂａｃｋ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ｌｏｗｅｒｅｄ ｄｏｗｎ ｔｏ ２８ ℃ ｕｎｔｉｌ ｔｈｅ ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ａｔ ６００ ｎｍ
ｒｅａｃｈｅｄ ａｂｏｕｔ ６０． Ａｎｄ ｌａｃｔｏｓｅ ｗａｓ ａｄｄｅｄ ｔｗｉｃｅ ａｔ ａ ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ３０ ｇ ／ Ｌ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．
Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＴＬＬ ｒｅａｃｈｅｄ ７９８􀆰 ５ Ｕ ／ Ｌ ｔｈａｔ ｗａｓ ２􀆰 ４⁃ｆｏｌｄ
ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｂｅｆｏｒｅ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ． Ｔｈｉｓ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｗｉｌｌ ｐｒｏｖｉｄｅ ｂａｓｉｓ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＬＬ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ ｌｉｐａｓｅ；ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａ ｃｏｌｉ
　 　 疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶 （ Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ
ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ ｌｉｐａｓｅ，ＴＬＬ）是一种嗜碱性、热稳定脂肪
酶，其最适反应温度为 ６０ ℃ ［１］。 ＴＬＬ与其他嗜热真
菌脂肪酶相比，具有更高的催化效率［２］。 目前，ＴＬＬ
已被 Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ 公司制成商品化脂肪酶 Ｌｉｐｏｌａｓｅ􀳏
和 Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ􀳏 ，广泛应用于食品、洗涤、生物
柴油和精细化学品等领域［２－３］。 近年来，随着绿色
制药的兴起，ＴＬＬ 在手性医药中间体制备中的应用
越来越多，如利用 Ｌｉｐｏｌａｓｅ􀳏 选择性水解外消旋 ２
羧乙基 ３ 氰基 ５ 甲基己酸乙酯（ＣＮＤＥ）合成
（３Ｓ） ２ 羧乙基 ３ 氰基 ５ 甲基己酸，用于普瑞
巴林的生产［４］。
由于 ＴＬＬ商品化酶价格昂贵，一定程度上限制
了其大规模应用。 通过前期研究，笔者所在课题组
成功实现了 ＴＬＬ 在大肠杆菌中的活性表达，并优化
了其在摇瓶中的表达条件［５］。 分批补料技术通过
控制培养过程基质浓度，解除细胞生长底物抑制，
实现工程菌的高密度生长与目标酶的高表达，已成
为微生物发酵工艺研究和工业化应用的重要策略
之一［６－７］。
本研究中，笔者采用分批补料培养技术，在 ５ Ｌ
发酵罐中对基因工程菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ ＤＥ３ ） ／
ｐＥＴ２８ｂ ＴＬＬ分批补料培养工艺进行研究，优化培
养控制条件，以期实现 ＴＬＬ 的高表达，用于水解
ＣＮＤＥ制备普瑞巴林手性中间体。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 菌种
从 Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ ＺＪＢ０９２２２ 中克隆获
得的 ＴＬＬ基因，插入 ｐＥＴ２８ｂ的 ＮｃｏⅠ和 Ｘｈｏ Ⅰ酶切
位点之间，构建基因工程菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ ＤＥ３） ／
ｐＥＴ２８ｂ ＴＬＬ［５］。
１􀆰 １􀆰 ２　 培养基
斜面培养基（ｇ ／ Ｌ）：蛋白胨 １０、酵母粉 ５、ＮａＣｌ
１０、琼脂粉 ２０。
种子培养基（ｇ ／ Ｌ）：蛋白胨 １０、酵母粉 ５、ＮａＣｌ
１０，ｐＨ ７􀆰 ０ 。
产酶培养基（ ｇ ／ Ｌ）：蛋白胨 ７、酵母粉 ８、甘油
３、Ｋ２ＨＰＯ４ ２、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ２、ＮａＣｌ １；ｐＨ ７􀆰 ０。
补料培养基 Ａ（ｇ ／ Ｌ）：甘油 １００、酵母粉 ２５、蛋白
胨 ２５、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ １０、ＫＨ２ＰＯ４ ７、ＮａＣｌ ５。
补料培养基 Ｂ（ｇ ／ Ｌ）：甘油 １００、酵母粉 ５０、蛋白
胨 ５、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ １０、ＫＨ２ＰＯ４ ７、ＮａＣｌ ５。
补料培养基 Ｃ （ ｇ ／ Ｌ） ：葡萄糖 ５００、酵母粉
５０、蛋 白 胨 ７５、 ＭｇＳＯ ４·７Ｈ ２ Ｏ ７、 柠 檬 酸 ３、
ＫＨ ２ＰＯ ４ ７、 （ ＮＨ ４） ２ＳＯ ４ ５、 Ｎａ２ＨＰＯ ４·１２Ｈ ２Ｏ ３、
ＭｇＣｌ２ ５、ＮＨ ４Ｃｌ ０􀆰 １。
１􀆰 １􀆰 ３　 仪器与设备
ＧＣ １４Ｃ型气相色谱仪，岛津苏州仪器有限公
司；ＤＵ ８００型紫外分光光度计，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ有
限公司；ＲＡＬＦｐｌｕｓ ５Ｌ 生物反应器，上海宝兴生物
器材有限公司；ＳＢＡ４０Ｅ 型生物传感器分析仪，山东
省生物科学研究所。
１􀆰 ２　 培养方法
１􀆰 ２􀆰 １　 种子液培养
从活化斜面挑取菌落接种至 ＬＢ 培养基（含终
质量浓度为 ５０ μｇ ／ ｍＬ 的卡那霉素）中，３７ ℃、１５０
ｒ ／ ｍｉｎ振荡培养 ８ ｈ，作为种子液。
１􀆰 ２􀆰 ２　 初始发酵培养条件
种子液按 ２％（体积分数）的接种量接入装有
２􀆰 ５ Ｌ基础发酵培养基的 ５ Ｌ发酵罐中，在 ３７ ℃、搅
拌速率 ５００ ｒ ／ ｍｉｎ、通气量 ２ Ｌ ／ ｍｉｎ 条件下发酵。 当
ＯＤ６００达到一定值时，降温至 ２８ ℃，加入乳糖进行
诱导。
１􀆰 ３　 分析方法
１􀆰 ３􀆰 １　 菌体干质量和葡萄糖含量测定
发酵过程中通过测定 ６００ ｎｍ 下的吸收值
ＯＤ６００，并根据菌体生物量（ＤＣＷ）（ｙ）与 ＯＤ６００（ｘ）线
性回归方程为 ｙ ＝ ０􀆰 ０６１ ６＋０􀆰 ０３６ ６ｘ（Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９９７ １）
得到菌体生物量；发酵液中葡萄糖含量使用生物传
感器分析仪测定。
１􀆰 ３􀆰 ２　 酶活测定
以 ＣＮＤＥ为底物，检测水解产物 ２ 羧乙基 ３
氰基 ５ 甲基己酸的生成量测定大肠杆菌全细胞的
ＴＬＬ活力。 将 １０ ｍＬ发酵液离心，得到菌体，转移至
转化瓶，用 １０ ｍＬ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ 缓冲液（５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，ｐＨ
８􀆰 ０）悬浮细胞，加入 １５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 醋酸钙解除产物抑
制［４］。 置于 ４０ ℃ 水浴摇床，加入 １００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
ＣＮＤＥ，１５０ ｒ ／ ｍｉｎ，反应 ６０ ｍｉｎ后取样。 样品经乙酸
乙酯萃取，有机相用于气相色谱分析，色谱柱为
Ａｓｔｅｃ ＣＨＩＲＡＬＤＥＸ Ｇ ＴＡ （３０ ｍ × ０􀆰 ２５ ｍｍ，０􀆰 ２５
μｍ），柱温为 １３５ ℃，检测器和进样口温度均为
２２０ ℃ ［８］。
酶活（Ｕ）单位定义：在 ｐＨ ８􀆰 ０，４０ ℃条件下，每
分钟水解 ＣＮＤＥ产生 １ μｍｏｌ （３Ｓ） ２ 羧乙基 ３
氰基 ５ 甲基己酸所需的酶量定义为 １ 个酶活
单位。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 补料培养基对菌体生长和脂肪酶表达的影响
分别以葡萄糖补料培养基和甘油补料培养基
进行补料分批发酵，考察不同补料培养基对工程菌
生长和脂肪酶表达的影响，结果见图 １。 由图 １ 可
知：补料培养基 Ａ 和 Ｂ 均以甘油为碳源，但氮源含
量不同，菌体生长速度较慢，发酵后期出现菌体自
溶现象，菌体量较低，分别为 １６􀆰 ５ 和 １８􀆰 ４ ｇ ／ Ｌ。 补
０１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
料培养基 Ｃ以葡萄糖作为碳源，发酵前期菌体生长
速度较快，整个发酵过程菌体持续生长，未出现菌
体自溶，菌体密度比以甘油为碳源时高，且脂肪酶
比酶活（４９６􀆰 ３ Ｕ ／ Ｌ）也高于以甘油做碳源的补料培
养基 Ａ（３３９􀆰 ０ Ｕ ／ Ｌ）和 Ｂ（４０２􀆰 １ Ｕ ／ Ｌ）。 其原因可
能是菌体代谢甘油效率低，无法满足菌体生长需
要，菌体量较低。 此外，发酵过程中甘油残留量高，
导致发酵液黏度系数上升，供氧不足，菌体出现自
溶。 综合考虑培养基成本和脂肪酶表达量，选择补
料培养基 Ｃ进行流加补料。
图 １　 补料培养基对细胞生长和脂肪酶表达的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ ｍｅｄｉｕｍ ｏｎ ｃｅｌｌ
ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２􀆰 ２　 补料控制工艺对菌体生长和脂肪酶表达的影响
发酵过程中 ｐＨ 和溶解氧（ＤＯ）受菌体代谢基
质影响，当发酵液的 ｐＨ和溶解氧过高或过低时，均
会抑制菌体的生长代谢和表达［９］。 根据分批补料
培养不同控制方式特点［１０－１１］，选择在 ｐＨ ７􀆰 ２ 时进
行 ｐＨ反馈流加补料，当发酵液 ｐＨ 低于 ７􀆰 ２ 时，便
以一定的速率及时补入补料培养基；溶氧反馈补料
则控制 ＤＯ为 ５０％，当 ＤＯ大于 ５０％时，流加补料培
养基，降低搅拌转速，维持 ＤＯ 的稳定。 考察 ｐＨ 反
馈流加和溶氧反馈流加 ２种补料策略对菌体生长及
酶表达的影响，结果分别见图 ２和图 ３。
由图 ２和图 ３可知：ｐＨ反馈补料（图 ２）和溶氧
反馈补料（图 ３）均维持葡萄糖浓度在较低水平，减
弱葡萄糖效应，实现脂肪酶的高效表达。 溶氧反馈
补料时，菌体量和比酶活分别为 ２６􀆰 ９ ｇ ／ Ｌ 和 ５０１􀆰 ７
Ｕ ／ Ｌ，均优于 ｐＨ反馈补料时的菌体量（２３􀆰 １ ｇ ／ Ｌ）和
比酶活（４３５􀆰 ３ Ｕ ／ Ｌ）。 因此选择控制溶氧进行分批
补料培养。
２􀆰 ３　 诱导时机对菌体生长和脂肪酶表达的影响
前期研究表明，当 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ＤＥ３） ／ ｐＥＴ２８ｂ
图 ２　 ｐＨ反馈补料对细胞生长和脂肪酶表达的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｆｅｅｄ⁃ｂａｃｋ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｅｅｄｉｎｇ
ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
图 ３　 溶氧反馈补料对细胞生长和脂肪酶表达的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｏｘｙｇｅｎ ｆｅｅｄ⁃ｂａｃｋ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ
ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｅｅｄｉｎｇ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｌｉｐａｓｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ＴＬＬ的 ＯＤ６００大于 ７０时进行诱导，细胞生长速率和酶
活较低，在乳糖诱导终质量浓度为 １５ ｇ ／ Ｌ条件下，对
诱导时机（ＯＤ６００分别为 ２０、４０和 ６０）进行优化，结果
见图 ４。 图 ４可知：菌体生物量和体积酶活均随诱导
时菌体浓度的增加而增加。 当选择在 ＯＤ６００ ＝ ２０诱导
时，所得到的菌体生物量和比酶活最低，分别仅为
２５􀆰 ８ ｇ ／ Ｌ 和 ４９６􀆰 ５ Ｕ ／ Ｌ；ＯＤ６００ ＝ ６０诱导时，菌体生物
量（３１􀆰 ６ ｇ ／ Ｌ）和比酶活（５６６􀆰 ９ Ｕ ／ Ｌ）均达最大值。 综
合菌体生物量和脂肪酶表达量，选择在菌体密度
ＯＤ６００ ＝６０时诱导。
２􀆰 ４　 诱导剂浓度对菌体生长和脂肪酶表达的影响
在重组菌发酵过程中，诱导剂浓度过高或过低均
不利于宿主细胞生长和目的蛋白表达。 一定范围内，
目的蛋白表达与诱导剂浓度成正比。 诱导剂浓度对
工程菌生长的影响见图 ５。 由图 ５可知：选择乳糖质
量浓度 １０和 ２０ ｇ ／ Ｌ 进行诱导时，诱导剂浓度不足，
不能充分诱导蛋白表达，发酵终期，比酶活分别为
５７１􀆰 ３ Ｕ ／ Ｌ 和 ６４５􀆰 ７ Ｕ ／ Ｌ；当诱导剂质量浓度为 ３０
ｇ ／ Ｌ时，比酶活可达 ７２６􀆰 ３ Ｕ ／ Ｌ，继续提高乳糖诱导质
量浓度至 ４０ ｇ ／ Ｌ时，诱导剂浓度过大抑制菌体生长，
１１　 第 ２期 马红叶等：重组大肠杆菌产疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶分批补料发酵工艺
图 ４　 诱导时机对菌体生长和脂肪酶表达的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ
ａｎｄ ｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
目的蛋白表达降低，比酶活仅为 ６５２􀆰 １ Ｕ ／ Ｌ。 因此，选
择乳糖质量浓度为 ３０ ｇ ／ Ｌ进行诱导。
图 ５　 诱导剂浓度对细胞生长和脂肪酶表达的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ
ａｎｄ ｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２􀆰 ５　 诱导方式对工程菌生长和脂肪酶表达的影响
为了获得较好的诱导效果，提高重组菌的产酶
效率，考察乳糖添加次数对工程菌生长和脂肪酶表
达的影响，结果见图 ６。 由图 ６ 可知：一次性加入乳
糖诱导时，造成诱导强度过大，对宿主菌造成代谢负
担，发酵结束时 ＯＤ６００为 １０３􀆰 １，比酶活仅为 ７２１􀆰 ５
Ｕ ／ Ｌ。 采用分 ３次加入乳糖的诱导效果更低（ＯＤ６００
９７􀆰 ７，比酶活 ５８９􀆰 ９ Ｕ ／ Ｌ），可能是分次加入时乳糖
诱导强度不够，影响了目的基因的表达。 而分 ２ 次
加入诱导剂更有利菌体生长和脂肪酶的表达，
ＯＤ６００为 １０６􀆰 ２，比酶活达到 ７９２􀆰 ４ Ｕ ／ Ｌ。
图 ６　 诱导方式对细胞生长和脂肪酶表达的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ
ａｎｄ ｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２􀆰 ６　 优化后的分批补料发酵
通过对补料培养基、补料方法、诱导等条件进
行优化，最终确定 ５ Ｌ发酵罐中分批补料发酵工艺：
溶氧反馈 分批补料发酵，选择补料培养基 Ｃ 进行
分批补料，当 ＤＯ高于 ５０％时，补料泵以 １０ ｍＬ ／ ｍｉｎ
速率进行补加补料培养基，当 ＤＯ低于 ５０％时，停止
补加。 菌体生长阶段温度控制在 ３７ ℃，１２ ｈ后降温
至 ２８ ℃诱导表达，分别在 １２ ｈ 和 １８ ｈ 时加入 ４５ ｇ
乳糖，使诱导剂终质量浓度为 ３０ ｇ ／ Ｌ，２６ ｈ 时终止
发酵。 发酵过程中通过流加 ２０％氨水控制 ｐＨ 为
７􀆰 ２。 图 ７ 显示了发酵过程中的 ｐＨ、残糖（ＲＳＣ）、
ＤＯ、比酶活及 ＯＤ６００变化。 由图 ７ 可知：发酵终期菌
体生物量为 ３８􀆰 ４ ｇ ／ Ｌ，比酶活为 ７９８􀆰 ５ Ｕ ／ Ｌ，与优化
图 ７　 工程菌溶氧反馈分批补料发酵过程
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｉｔｈ ＤＯ ｆｅｅｄ⁃ｂａｃｋ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｅｅｄｉｎｇ
（下转第 １８页）
２１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｆｔｅｒ Ｋｊｅｌｄａｈｌ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ［ Ｊ］ ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｔｅｓｔｉｎｇ，２０１１，
３０（７）：７７３⁃７７８．
［１１］ 　 Ｋｈｏｓｈｎｏｏｄｋｉａ Ｍ， Ｍｏｈｓｅｎｉ Ｈ， Ｒａｈｍａｎｉ Ｏ， ｅｔ ａｌ． ＴＯＣ
ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇａｄｖａｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｏｕｔｈ Ｐａｒｓ ｇａｓ ｆｉｅｌｄ，ｕｓｉｎｇ
ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｇｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｄａｔａ［ Ｊ］ ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１１，７８（１）：１１９⁃１３０．
［１２］ 　 许海，王洁琼，徐俊，等．土壤重金属测定中不同消解方法的
比较［Ｊ］ ．常州工学院学报：自然科学版，２００８，２１（４）：７０⁃７４．
［１３］ 　 Ｆａｒａｊｉ Ｍ，Ｙａｍｉｎｉ Ｙ，Ｓａｌｅｈ Ａ，ｅｔ ａｌ． Ａ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ⁃ｂａｓｅｄ ｓｏｌｉｄ⁃
ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ
ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ⁃ｏｐｔｉｃａｌ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｓｏｍｅ
ｈｅａｖｙ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ ｉｎ ｗａｔｅｒ ｓａｍｐｌｅｓ［ Ｊ］ ．Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，
２０１０，６５９（１）：１７２⁃１７７．
［１４］ 　 南艳艳，邹华，严群，等．秸秆厌氧发酵产沼气的初步研究［ Ｊ］ ．
食品与生物技术学报，２００７，２６（６）：６４⁃６８．
［１５］ 　 Ｚｈｏｎｇ Ｗ，Ｚｈａｎｇ Ｚ，Ｑｉａｏ Ｗ，ｅｔ ａｌ． ＲＥＴＲＡＣＴＥＤ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ
ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｒｎ ｓｔｒａｗ ｆｏｒ ｂｉｏｇａｓ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ［ Ｊ］ ．Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ Ｅｎｅｒｇｙ，２０１１，
３６（６）：１８７５⁃１８７９．
［１６］ 　 郭小品，毕东苏．剩余污泥厌氧消化过程中的物质转化及其
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（责任编辑　 周晓薇）
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（上接第 １２页）
前的菌体量 １６􀆰 ６ ｇ ／ Ｌ，比酶活 ３３９􀆰 ０ Ｕ ／ Ｌ相比，优化
后的分批补料发酵工艺明显提高了菌体量和和比
酶活（２􀆰 ４倍），为生物酶法制备普瑞巴林关键中间
体奠定了基础。
３　 结论
通过对 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ＤＥ３） ／ ｐＥＴ２８ｂ ＴＬＬ 在 ５
Ｌ发酵罐中分批补料发酵工艺的优化，最终确定溶
氧反馈补料的控制工艺。 选择葡萄糖为碳源的补
料培养基进行补料，诱导时机为 ＯＤ６００ ＝ ６０，２ 次分
批加入终质量浓度为 ３０ ｇ ／ Ｌ 乳糖进行诱导。 在优
化后发酵条件进行分批补料发酵，ＴＬＬ 的比酶活由
优化前的 ３３９􀆰 ０ Ｕ ／ Ｌ 提高到 ７９８􀆰 ５ Ｕ ／ Ｌ，是优化前
的 ２􀆰 ４倍。
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（责任编辑　 荀志金）
８１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷