全 文 ：第 １２卷第 ５期
２０１４年 ９月
生 物 加 工 过 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ １２ Ｎｏ ５
Ｓｅｐ ２０１４
ｄｏｉ：１０ ３９６９ ／ ｊ ｉｓｓｎ １６７２－３６７８ ２０１４ ０５ ００２
收稿日期：２０１４－０１－１７
基金项目：国家自然科学基金（２１２０６０５５） ；江苏省自然科学基金（ＢＫ２０１２１２７）
作者简介：熊 雷（１９８８—），男，湖北武汉人，硕士研究生，研究方向：生物催化；史劲松（联系人），教授， Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｓｈｉｊｓ＠ １６３ ｃｏｍ
腈水解酶 ｐｓｎ基因工程菌的发酵及产酶条件优化
熊 雷，李 恒，龚劲松，杨 涛，朱小燕，许正宏，史劲松
（江南大学 药学院，无锡 ２１４１２２）
摘 要：来自恶臭假单胞菌的腈水解酶具有高效催化 ３ 氰基吡啶产烟酸的能力，对表达该酶的基因 ｐｓｎ 进行发酵
和产酶条件优化，通过对 Ｃ源、Ｎ源、磷酸盐、金属离子、温度、诱导剂浓度和诱导时间进行单因素考察，获得最适培
养基条件（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ５、蛋白胨 １５、酵母粉 ５、（ＮＨ４） ２ＳＯ４ ５、Ｋ２ＨＰＯ４ ２４ ５、ＫＨ２ＰＯ４ ５ ７６、ＭｇＳＯ４ ０ ４８；最佳诱导
条件：培养 ２ ５ ｈ后添加 ＩＰＴＧ诱导，浓度 ０ ２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，诱导温度 ３０ ℃。 在该条件下培养，重组大肠杆菌的腈水解酶
比酶活可达到 ４５ ６７ Ｕ ／ ｍＬ，比优化前提高了 ２ ２６倍。 在此基础上，于 ５ Ｌ发酵罐上进行 Ｃ、Ｎ源的补料研究，获得
最适分批补料策略，发现其腈水解酶活力可达到 ７５ ４０ Ｕ ／ ｍＬ，是优化前的 ３ ７４倍。
关键词：腈水解酶；烟酸；发酵；分批补料培养
中图分类号：Ｑ７８ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０５－０００７－０７
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ
ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｓｎ ｇｅｎｅ
ＸＩＯＮＧ Ｌｅｉ，ＬＩ Ｈｅｎｇ，ＧＯＮＧ Ｊｉｎｓｏｎｇ，ＹＡＮＧ Ｔａｏ，ＺＨＵ Ｘｉａｏｙａｎ，ＸＵ Ｚｈｅｎｇｈｏｎｇ，ＳＨＩ Ｊｉｎｓｏｎｇ
（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｎｉｔｒｉｌａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｏｗａｒｄ ３⁃ｃｙａｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ ａｎｄ ｃｏｕｌｄ
ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｓｎ ｇｅｎｅ， ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ，ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ，ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ，
ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ＩＰＴＧ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｔｉｍｅ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅ ｃｏｌｉ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｓｎ
ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔ Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｔｒｉｌａｓｅ ａｒｅ ａｓ
ｆｏｌｌｏｗｓ：ｇｌｕｃｏｓｅ ５ ｇ ／ Ｌ， ｔｒｙｐｔｏｎｅ １５ ｇ ／ Ｌ，ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ ｇ ／ Ｌ，（ＮＨ４） ２ ＳＯ４ ５ ｇ ／ Ｌ，Ｋ２ ＨＰＯ４ ２４ ５ ｇ ／ Ｌ，
ＫＨ２ＰＯ４ ５ ７６ ｇ ／ Ｌ，ＭｇＳＯ４ ０ ４８ ｇ ／ Ｌ Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔ， ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
ｗｉｔｈ ＩＰＴＧ ｗｅｒｅ ａｔ ２ ５ ｈ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ，０ ２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ａｎｄ ３０ ℃，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｎｉｔｒｉｌａｓｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ ｃｏｌｉ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｒｅａｃｈｅｄ ｕｐ ｔｏ ４５ ６７ Ｕ ／ ｍＬ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ
２ ２６ ｔｉｍｅｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｌｅｖｅｌ Ａｎｄ ｔｈｅ ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｎｉｔｒｉｌａｓｅ
ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｅ ｃｏｌｉ ｉｎ ５ Ｌ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅａｃｈｅｄ ７５ ４０ Ｕ ／ ｍＬ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ３ ７４ ｔｉｍｅｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ
ｌｅｖｅｌ
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｎｉｔｒｉｌａｓｅ； ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ； ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ
腈水解酶（ＥＣ ３ ５ ５ １）是一类能够将腈化合
物水解生成羧酸和氨的催化剂，其立体选择性可用
于解决化学工艺中手性催化效率低的问题［１－２］。 腈
水解酶具有来源广泛、反应条件温和、特异性高和
选择性强的特点，在有机合成领域具有很好的潜在
应用价值［３－５］。 目前已有较多的研究是围绕腈类化
合物的生物转化展开，并已有多种腈水解酶应用于
工业生产，然而仍然存在着诸如比酶活低、稳定性
差和底物谱窄等问题［６］。 因此，筛选发掘新功能的
腈水解酶并通过异源表达提高其产酶水平，是目前
生物转化腈化合物的重要任务。
烟酸又名维生素 Ｂ３，被广泛用作药物中间体和
食品添加剂［７］，是人体和动物体不可缺少的营养组
分，目前全球市场需求量在 ３ ５ 万 ｔ 左右。 烟酸的
传统生产工艺是以吡啶为原料，通常需要强酸（或
强碱）、高温和高压等反应条件，存在副产物多、产
量低和环境污染严重等缺点［８－９］。 目前，生物法直
接水解 ３ 氰基吡啶生成烟酸已成为新的工艺研究
热点，而腈水解酶活性是影响其工艺效益的关键。
Ｓｈａｒｍａ等［１０－１１］报道了以 ３ 氰基吡啶为原料，在微
生物腈水解酶的作用下转化生成烟酸的工艺，所获
产品的纯度大大提高，但其腈水解酶活力偏低，仅
为 ６ ６７ Ｕ ／ ｍｇ （以细胞干质量计）；同样， Ｐｒａｓａｄ
等［１２］从 Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ ＮＤＢ １１６５ 中获得的腈水解
酶活力也仅为 ２ ３９ Ｕ ／ ｍｇ （以细胞干质量计），导致
最终合成烟酸产量不高而影响其工业应用。
笔者所在课题组朱小燕等［１３］筛选到 １ 株产腈
水解 酶 的 恶 臭 假 单 胞 菌 （ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ
ＣＧＭＣＣ３８３０），并已成功扩增获得腈水解酶基因 ｐｓｎ，
再将该 ｐｓｎ克隆到大肠杆菌中，发现其重组菌在腈化
合物的生物转化中表现出良好的应用前景［１４］。 在此
基础上，笔者通过对重组工程菌产酶条件的优化，以
期实现腈水解酶工程菌的高菌体浓度和高酶活发酵，
为将来烟酸的生物法生产创造有利条件。
１ 材料与方法
１ １ 实验材料
１ １ １ 菌株与质粒
恶臭假单胞菌腈水解酶基因 ｐｓｎ 由本实验室成
功扩增获得，并在宿主 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ ｇａｍｉ
（ＤＥ３）中进行表达，构建了腈水解酶基因工程菌株
Ｅ ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ ｇａｍｉ （ＤＥ３） ／ ｐＥＴ ２８ａ （＋） ｐｓｎ。
１ １ ２ 主要试剂
３ 氰基吡啶、烟酸（纯度≥９８％），Ｓｉｇｍａ 公司；氯
霉素、卡那霉素、异丙基 β Ｄ 硫代半乳糖苷
（ＩＰＴＧ），上海生工生物工程有限公司；酵母粉和葡萄
糖（生化等级试剂），购于国药集团化学试剂有限
公司。
１ １ ３ 主要仪器
ＤＨＺ ＤＡ型恒温摇床，太仓市实验设备厂；电
子天平，美国 Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ 公司；高效液相色谱仪，美国
Ｄｉｏｎｅｘ公司；５ Ｌ 发酵罐，上海保兴生物设备工程有
限公司；立式冷冻高速离心机，日本日立公司。
１ １ ４ 培养基
种子培养基（ ｇ ／ Ｌ）：蛋白胨 １０、酵母粉 ５、ＮａＣｌ
１０；ｐＨ ７ ２。
发酵培养基（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ５、蛋白胨 １５、酵母
粉 ５、（ＮＨ４ ） ２ ＳＯ４ ５、Ｋ２ ＨＰＯ４ ２４ ５、ＫＨ２ ＰＯ４ ５ ７６、
ＭｇＳＯ４ ０ ４８；ｐＨ ７ ２。
Ｃ源补料培养基：配制一定体积 １００ 和 ２００ ｇ ／ Ｌ
葡萄糖溶液。
Ｎ源补料培养基Ⅰ：蛋白胨 １５ ｇ，酵母粉 ５ ｇ，
（ＮＨ４） ２ＳＯ４ ５ ｇ；定容到 ３００ ｍＬ。
Ｎ源补料培养基Ⅱ：蛋白胨 ３０ ｇ，酵母粉 １０ ｇ，
（ＮＨ４） ２ＳＯ４ １０ ｇ；定容到 ３００ ｍＬ。
１ ２ 实验方法
１ ２ １ 摇瓶培养
取－８０ ℃保存的菌株甘油管，摇瓶活化（３７ ℃、
２００ ｒ ／ ｍｉｎ、１０ ｈ）后，涂布于平板，３７ ℃培养 １２ ｈ。
挑取单菌落于 ５０ ｍＬ摇瓶培养基中，３７ ℃、２００
ｒ ／ ｍｉｎ培养 １０ ｈ。
以 １％接种量将种子液接入到 ２５０ ｍＬ 摇瓶中，
３７ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ振荡培养，于适当时间加入诱导剂
ＩＰＴＧ，诱导产酶。
１ ２ ２ ５ Ｌ发酵罐培养
取上述种子液，按 １％接种量接入 ５ Ｌ 发酵罐
中，３７ ℃培养，搅拌转速 ４００ ｒ ／ ｍｉｎ，待适当时间，加
入 ＩＰＴＧ诱导产酶。
１ ２ ３ 流加方法
发酵 ６ ｈ开始补加，流速控制在 ０ ５ ｍＬ ／ ｍｉｎ，发
８ 生 物 加 工 过 程 第 １２卷
酵 １４ ｈ停止补料。
１ ３ 检测方法
菌体浓度的测定：菌液稀释适当倍数后，在 ６００
ｎｍ下测定吸光值，ＯＤ６００ ＝吸光值×稀释倍数。
菌体干质量的测定：取菌液离心，用生理盐水
洗涤，稀释不同的倍数，放入 １０５ ℃烘箱中烘干至恒
质量，称质量，绘制出菌体浓度与菌体干质量的标
准曲线，即细胞干质量＝ ０ ３９５ＯＤ６００。
残糖的测定方法：以 ＢＡ ４０Ｄ型生物传感器测
定残糖浓度。
ＨＰＬＣ检测条件：采用戴安 ＨＰＬＣ （Ｕｌｔｉｍａｔｅ
３０００）， Ｃ１８柱（Ｗａｔｅｒｓ，４ ６ ｍｍ×１５０ ｍｍ，５ μｍ），流
动相为乙腈和 ０ ０２５％（体积分数）Ｈ３ＰＯ４混合缓冲
溶液，体积比 ３ ∶ ２，流速 １ ｍＬ ／ ｍｉｎ，柱温 ３０ ℃，进样
量 １０ μＬ，检测波长 ２６８ ｎｍ。
酶活定义：每分钟产生 １ μｍｏｌ烟酸所需的酶量
定义为 １个酶活单位（Ｕ）；每毫克菌体干质量所含
的酶活单位为 １ ＤＣＷ；每毫升菌液所含酶活单位定
义为 １ Ｕ ／ ｍＬ。
取 １００ μＬ菌液，１０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ２ ｍｉｎ，弃上
清，加入 １００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＰＢＳ 缓冲液洗涤菌体，１０ ０００
ｒ ／ ｍｉｎ离心 ２ ｍｉｎ，弃上清，最后加入 ７５０ μＬ ＰＢＳ 缓
冲液，２００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ３ 氰基吡啶（终浓度 ５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ）
２５０ μＬ 进行反应，３０ ℃下反应 １０ ｍｉｎ 后，加入 ２
ｍｏｌ ／ Ｌ盐酸 ２００ μＬ 终止反应，取上清稀释 １０ 倍后
用 ＨＰＬＣ检测 ３ 氰基吡啶和烟酸的含量。
２ 结果与讨论
２ １ 发酵培养基的优化
２ １ １ Ｃ源及其质量浓度对产酶的影响
以 ＬＢ培养基为起始培养基进行 Ｃ 源种类的优
化。 在 ＬＢ培养基中分别添加 ５ ｇ ／ Ｌ葡萄糖、甘油、蔗
糖、麦芽糖和可溶性淀粉作为 Ｃ 源进行单因素实验，
结果见图 １。 由图 １ 可知，以葡萄糖为 Ｃ 源，菌体生
长最好，酶活最大，因此选择葡萄糖为最佳 Ｃ 源。 进
一步设定葡萄糖质量浓度为 １、５、１０、１５、２０和 ２５ ｇ ／ Ｌ
６个水平，考察不同葡萄糖质量浓度对菌体和酶活的
影响，结果如图 ２ 所示。 由图 ２ 可知：最适宜的葡萄
糖质量浓度为 ５ ｇ ／ Ｌ时，比酶活达到 ３８ ２２ Ｕ ／ ｍＬ，而
继续增加葡萄糖质量浓度至 １５ ｇ ／ Ｌ，菌体生物量增
加，但酶活几乎不变，而且葡萄糖浓度过高，会抑制菌
体生长和酶的表达。 从生产成本和酶活角度考虑，最
终将葡萄糖质量浓度选定为 ５ ｇ ／ Ｌ。
图 １ Ｃ源对重组菌生长及产酶的影响
Ｆｉｇ １ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎ
Ｅ ｃｏｌｉ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
图 ２ 葡萄糖质量浓度对重组菌生长及产酶的影响
Ｆｉｇ ２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ
ｏｎ Ｅ ｃｏｌｉ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２ １ ２ Ｎ源及其质量浓度对产酶的影响
通过改变 ＬＢ培养基中不同 Ｎ 源来考察对菌体
和产酶的影响，主要比较了不同有机 Ｎ 源及无机 Ｎ
源对产酶的影响，结果见表 １和表 ２。
表 １ 有机 Ｎ源对重组菌生长及产酶的影响
Ｔａｂｌｅ １ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎ
Ｅ ｃｏｌｉ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
有机 Ｎ源 ρ ／（ｇ·Ｌ－１）
ρ（ＤＣＷ） ／
（ｇ·Ｌ－１）
比酶活 ／
（Ｕ·ｍＬ－１）
蛋白胨 １０ １ ３±０ １５ ５ ０±２ ０１
酵母粉 １０ ２ ０±０ １３ １２ ０±１ ４２
牛肉膏 １０ ２ ４±０ １４ ２１ １±２ ２４
酵母粉＋蛋白胨 ５＋５ ４ ２±０ １７ ３７ ７±２ ０４
牛肉膏＋蛋白胨 ５＋５ ２ ５±０ １５ ２２ ２±１ １７
９ 第 ５期 熊 雷等：腈水解酶 ｐｓｎ基因工程菌的发酵及产酶条件优化
表 ２ 无机 Ｎ源对重组菌生长及产酶的影响
Ｔａｂｌｅ ２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎ
Ｅ ｃｏｌｉ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
无机 Ｎ源 ρ ／（ｇ·Ｌ－１）
ρ（ＤＣＷ） ／
（ｇ·Ｌ－１）
比酶活 ／
（Ｕ·ｍＬ－１）
ＮＨ４Ｃｌ ２ ４ ７±０ ２３ ４３ ４±２ ０４
（ＮＨ４） ２ＳＯ４ ２ ４ ４±０ ２６ ３９ ３±２ ２５
ＮＨ４ＮＯ３ ２ ４ １±０ ４７ ３２ ４±２ １５
尿素 ２ ５ ０±０ ３２ ４１ ７±２ ８２
由表 １可知：蛋白胨和酵母粉复合 Ｎ 源能有效
促进酶的表达；进而优化复合 Ｎ 源的浓度，结果见
图 ３ 和图 ４。 当蛋白胨质量浓度为 １５ ｇ ／ Ｌ，比酶活
达到 ４１ ２ Ｕ ／ ｍＬ，当蛋白胨质量浓度继续提高至 ２０
ｇ ／ Ｌ时，菌体生物量仅有微弱的提升，而酶活无显著
变化，因此最终仍选定蛋白胨质量浓度为 １５ ｇ ／ Ｌ。
当酵母粉质量浓度为 ５ ｇ ／ Ｌ 时，产酶及比酶活达到
最高，为 ４２ ４６ Ｕ ／ ｍＬ（图 ３和图 ４）。 在此基础上考
察（ＮＨ４） ２ＳＯ４、ＮＨ４Ｃｌ、ＮＨ４ＮＯ３和尿素等无机 Ｎ 源
的影响，发现再添加（ＮＨ４） ２ＳＯ４为 ５ ｇ ／ Ｌ 时，菌体比
酶活达到 ４４ ７ Ｕ ／ ｍＬ（图 ５）。
图 ３ 蛋白胨质量浓度对菌体生长和产酶的影响
Ｆｉｇ ３ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｒｙｐｔｏｎｅ
ｏｎ Ｅ ｃｏｌｉ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２ １ ３ 磷酸盐添加量的影响
磷酸盐是微生物生长和维持渗透压的必需物
质，对重组质粒的稳定性、菌体生物量和外源蛋白
的表达有影响。 实验考察了不同浓度磷酸盐对重
组菌生长和产酶的影响，结果见图 ６。 由图 ６ 可知，
磷酸盐浓度在 １５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 时，酶活达到最高，进一
步增加将不利于菌体生长，产酶能力相应降低。
２ １ ４ 金属离子的影响
为考察金属离子对重组菌生长和产酶的影响，
图 ４ 酵母粉质量浓度对菌体生长和产酶的影响
Ｆｉｇ ４ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ
ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｎ Ｅ ｃｏｌｉ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ
ｎｉｔｒｉｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
图 ５ （ＮＨ４） ２ＳＯ４ 质量浓度对菌体生长和产酶的影响
Ｆｉｇ ５ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ （ＮＨ４） ２ＳＯ４
ｏｎ Ｅ ｃｏｌｉ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
图 ６ 磷酸盐浓度对重组菌生长及产酶的影响
Ｆｉｇ ６ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｏｎ Ｅ ｃｏｌｉ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
分别在培养基中添加 ２ ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ金属离子，结果见
图 ７。 由图 ７可知，Ｃｕ２＋对菌体生长有一定的抑制作
用，这与 Ｃｕ２＋对 Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ Ｊ１生长与产
腈水解酶特性基本一致［１６］。 Ｍｇ２＋对菌体产酶有一
定的促进，经浓度优化，得出其适宜的浓度为 ４
ｍｍｏｌ ／ Ｌ。
０１ 生 物 加 工 过 程 第 １２卷
图 ７ 金属离子对重组菌生长及产酶的影响
Ｆｉｇ ７ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔａｌｌｉｃ ｉｏｎｓ ｏｎ Ｅ ｃｏｌｉ
ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２ ２ 发酵条件的优化
２ ２ １ 诱导温度的优化
温度是影响菌体生长和外源蛋白表达的重要
因素，实验考察不同诱导温度对重组菌生长和产酶
的影响（图 ８）。 由图 ８ 可知，在较为广泛的温度范
围内（２６～３７ ℃）进行诱导，均可以获得 ４ ０ ｇ ／ Ｌ 以
上的菌体量和较好的产酶水平，其中以 ３０ ℃相对
较优。
图 ８ 诱导温度对重组菌生长及产酶的影响
Ｆｉｇ ８ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ Ｅ ｃｏｌｉ ｇｒｏｗｔｈ
ａｎｄ ｎｉｔｒｉｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２ ２ ２ 诱导剂浓度和诱导时间对菌体和产酶的
影响
采用 ＩＰＴＧ作为诱导剂，考察不同添加浓度和
不同诱导时机对菌体生长和产酶的影响，结果见
图 ９。 由图 ９ 可知，对本工程菌而言，诱导剂浓度
对菌体生长没有太大影响，其中 ＩＰＴＧ 在 ０ ２
ｍｍｏｌ ／ Ｌ时酶活相对较高。 诱导时间对酶活和菌
体生长的影响较大，在接种后 ２ ５ ｈ 时诱导，菌浓
和比酶活都达到最大值，分别为 ５ １４ ｇ ／ Ｌ 和
４４ ８２ Ｕ ／ ｍＬ（图 １０）。
图 ９ 诱导剂浓度对重组菌生长及产酶的影响
Ｆｉｇ ９ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＰＴＧ ｏｎ Ｅ ｃｏｌｉ
ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
图 １０ 诱导时间对重组菌生长及产酶的影响
Ｆｉｇ １０ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｉｍｅ ｏｆ ａｄｄｉｎｇ ＩＰＴＧ ｏｎ Ｅ ｃｏｌｉ
ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２ ２ ３ ５ Ｌ发酵罐培养过程研究
基于摇瓶培养条件，开展 ５ Ｌ罐上的发酵研究，
分析培养过程的菌体浓度、残糖、ｐＨ和酶活等参数，
为小罐发酵的优化提供思路，图 １１为未进行流加控
制的重组菌发酵过程。 由图 １１可知：随着葡萄糖的
消耗，发酵液 ｐＨ从 ７ ４ 开始逐步下降，至 ８ ｈ 葡萄
糖利用完全时，ｐＨ 降至 ６ ７５，之后有所回升（图 １１
（ａ））。 而采用 ＮＨ３·Ｈ２Ｏ流加控制 ｐＨ后，菌体浓度
有所提高，菌体量达到 ５ ６９ ｇ ／ Ｌ（图 １１（ｂ））。
发酵 ８ ｈ后，葡萄糖大幅度消耗，菌体生长减缓
（图 １１（ａ）和图 １１（ｂ）），因此，考虑补充营养物质来
提高菌体浓度。 首先考察葡萄糖的流加，从发酵 ６ ｈ
开始补料，分别补加葡萄糖终质量浓度为 １和 ２ ｇ ／ Ｌ
（图 １２ （ａ）和图 １２（ｂ）），发现补糖 １ ｇ ／ Ｌ 时，菌体量
可以达到 ８ ２９ ｇ ＤＣＷ／ Ｌ，比酶活达到 ５０ ７８ Ｕ ／ ｍＬ；
补糖 ２ ｇ ／ Ｌ时，菌体量可达到 １２ ４６ ｇ ＤＣＷ／ Ｌ，比酶活
达到 ５７ ２１ Ｕ ／ ｍＬ。
考虑不同 Ｃ、Ｎ比对菌体生长和产酶的影响，即
１１ 第 ５期 熊 雷等：腈水解酶 ｐｓｎ基因工程菌的发酵及产酶条件优化
图 １１ ５ Ｌ发酵罐上重组菌的发酵曲线
Ｆｉｇ １１ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｏｆ Ｅ ｃｏｌｉ ｉｎ ５ Ｌ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ
图 １２ 葡萄糖补加策略对菌体生长和产酶的影响
Ｆｉｇ １２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆｅｅｄｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｎ
Ｅ ｃｏｌｉ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
在补加 Ｃ源的同时补加不同浓度的 Ｎ源；方案 １ 采
用 Ｎ源补料培养基Ⅰ，发现菌浓和酶活都有所提高
（图 １３ （ａ））；方案 ２ 采用 Ｎ 源补料培养基Ⅱ，发现
菌体浓度在 ６～１０ ｈ 内快速增长，至 １４ ｈ 仍呈增长
趋势，最终可达 １５ ３６ ｇ ／ Ｌ，且比酶活提高到 ７５ ４０
Ｕ ／ ｍＬ（图 １３ （ｂ））。
图 １３ 补加 Ｎ源策略对菌体生长和产酶的影响
Ｆｉｇ １３ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆｅｅｄｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ
ｏｎ Ｅ ｃｏｌｉ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２ ３ ＳＤＳ ＰＡＧＥ对腈水解酶表达量的分析
为比较不同发酵条件下腈水解酶的表达量，采用
ＳＤＳ ＰＡＧＥ 对菌体全细胞蛋白进行分析，结果见图
１４。 由图 １４可知：优化后腈水解酶的表达量显著提升。
Ｍ—标准蛋白；１—诱导前的菌体；
２—优化的 ＬＢ培养菌体；３—培养基优化后菌体；
４—５ Ｌ发酵罐补料优化后菌体
图 １４ 发酵优化后菌体 ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳图
Ｆｉｇ １４ ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｇｒｏｗｔｈ ｕｎｄｅｒ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
２１ 生 物 加 工 过 程 第 １２卷
３ 结 论
对腈水解酶的基因工程大肠杆菌培养基组分
进行研究，考察了 Ｃ、Ｎ 源、磷酸盐和金属离子对重
组大肠杆菌生长和产酶的影响，确定了最佳培养基
成分，经过浓度优化，得到培养基组分（ ｇ ／ Ｌ）：葡萄
糖 ５、蛋白胨 １５、酵母粉 ５、（ＮＨ４） ２ ＳＯ４ ５、Ｋ２ＨＰＯ４
２４ ５、ＫＨ２ＰＯ４ ５ ７６ 和 ＭｇＳＯ４ ０ ４８。 在此条件下在
３０ ℃培养 ２ ５ ｈ后添加终浓度 ０ ２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ的 ＩＰＴＧ
进行诱导，发现比酶活从初始的 ２０ １７ Ｕ ／ ｍＬ 提高
到 ４５ ６７ Ｕ ／ ｍＬ。 随后在 ５ Ｌ发酵罐进行控制 ｐＨ和
进行流加策略的优化，得到最终的产酶水平为
７５ ４０ Ｕ ／ ｍＬ，相比优化前提高了 ３ ７４ 倍，亦为工业
上开展烟酸的生物转化奠定了良好的技术基础。
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ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｎｚｏｎｉｔｒｉｌａｓｅ ｂｙ Ｒｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ
ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ｊ１［Ｊ］ ．Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９８８，１５０（１）：８９⁃９４．
（责任编辑 周晓薇）
３１ 第 ５期 熊 雷等：腈水解酶 ｐｓｎ基因工程菌的发酵及产酶条件优化