全 文 ：第 １３卷第 １期
２０１５年 １月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 １
Ｊａｎ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０１􀆰 ００４
收稿日期：２０１３－０６－２２
基金项目：国家自然科学基金（２１０７６１０５）；国家重点基础研究发展计划（９７３ 计划） （２００９ＣＢ７２４７０１）；国家高技术研究发展计划（８６３ 计划）
（２０１１ＡＡ０２Ａ２０３）；教育部新世纪优秀人才支持计划（ＮＣＥＴ⁃１２⁃０７３２）；江苏高校优势学科建设工程；江苏省高校自然科学研究项目
（１１ＫＪＢ５３０００３）
作者简介：陈　 旭（１９８８—），女，江苏连云港人，硕士研究生，研究方向：生物工程；姜　 岷（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｂｉｏｅｎｇｉｎｅ＠ ｎｊｔｅｃｈ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ
共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和烟酸转磷酸
核糖激酶提高重组大肠杆菌发酵木糖产丁二酸
陈　 旭，梁丽亚，刘嵘明，万　 青，吴明科，姜　 岷
（南京工业大学 生物与制药工程学院 材料化学工程国家重点实验室，江苏 南京 ２１０００９）
摘　 要：野生型 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ１２能够在厌氧条件下代谢木糖生长，但是丁二酸不是其主要的代谢终产物。 而在 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ
ＢＡ２０３（ΔｌｄｈＡ，ΔｐｆｌＢ，Δｐｐｃ）中，通过过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（ＰＣＫ），即 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＡ２０４，使其能够在厌氧
条件下利用木糖发酵生产丁二酸。 为了进一步提高生物量及丁二酸的产量，通过过量表达烟酸转磷酸核糖激酶
（ＮＡＰＲＴａｓｅ）提高 ＮＡＤ（Ｈ）的生成，从而提高木糖代谢速率。 因此采用 ２ 种方法构建了共表达烟酸转磷酸核糖激
酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的基因工程菌，即 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＡ２０８（ＢＡ２０３ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｃｋ）和 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＡ２０９
（ＢＡ２０３ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｃｋ ｔｒｃ ｐｎｃＢ）。 通过实验发现：厌氧发酵 ７２ ｈ，ＢＡ２０９消耗 １６􀆰 ７ ｇ ／ Ｌ木糖，生成 １５􀆰 ８ ｇ ／ Ｌ丁二
酸，乙酸含量有所降低，而丙酮酸的量几乎不变。 ＢＡ２０９中 ＮＡＤ（Ｈ）总量和 ＡＴＰ 含量较 ＢＡ２０８和 ＢＡ２０４都有明显
的提高。 这为考察 ＮＡＤ（Ｈ）和 ＡＴＰ ２种辅因子对重组大肠杆菌利用木糖合成丁二酸的影响提供了研究平台。
关键词：磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶；烟酸转磷酸核糖激酶；大肠杆菌；丁二酸；木糖
中图分类号：ＴＱ９２１　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０１－００１７－０４
Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｘｙｌｏｓｅ ｂｙ ｃｏ⁃ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ ａｎｄ
ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ⁃ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈｏｎｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＣＨＥＮ Ｘｕ，ＬＩＡＮＧ Ｌｉｙａ，ＬＩＵ Ｒｏｎｇｍｉｎｇ，ＷＡＮ Ｑｉｎｇ，ＷＵ Ｍｉｎｇｋｅ，ＪＩＡＮＧ Ｍｉｎ
（Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ⁃Ｏｒｉｅｎｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｉｌｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ｃａｎ ｕｓｅ ｘｙｌｏｓｅ ｔｏ ｇｒｏｗ ｕｎｄｅｒ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｂｕｔ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｉｓ ｎｏｔ
ｔｈｅ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ􀆰 Ｗｅ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ （ＰＣＫ） ｉｎ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ
ＢＡ２０３，ａ ｌｄｈＡ，ｐｆｌＢ，ａｎｄ ｐｐｃ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎ，ｎａｍｅｄ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＡ２０４􀆰 Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｃｏｕｌｄ ｕｓｅ ｘｙｌｏｓｅ ｔｏ
ｐｒｏｄｕｃｅ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｕｎｄｅｒ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ􀆰 Ｔｏ ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｔｈｅ
ＮＡＤ （ Ｈ ） ｐｏｏｌ ｓｉｚｅ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ
（ＮＡＰＲＴａｓｅ）􀆰 Ａｓ ａ ｒｅｓｕｌｔ，ｘｙｌｏｓｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒａｔｅ ｗａｓ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ􀆰 Ｉｎ ｔｈｉｓ ｃａｓｅ，ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ，Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＡ２０８（ＢＡ２０３ ／ ｐＴｒｃ９９ａ⁃ｐｎｃＢ⁃ｐｃｋ） ａｎｄ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＡ２０９（ＢＡ２０３ ／
ｐＴｒｃ９９ａ⁃ｐｃｋ⁃ｔｒｃ⁃ｐｎｃＢ） ｂｙ ｃｏ⁃ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＣＫ ａｎｄ ＮＡＰＲＴａｓｅ􀆰 Ａｆｔｅｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ７２ ｈ，１６􀆰 ７ ｇ ／ Ｌ ｏｆ
ｘｙｌｏｓｅ ｗａｓ ｃｏｎｓｕｍｅｄ ｉｎ ＢＡ２０９，ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ １５􀆰 ８ ｇ ／ Ｌ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ􀆰 Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｌｏｗｅｒ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｗａｓ
ｄｅｔｅｃｔｅｄ，ｐｙｒｕｖｉｃ ａｃｉｄ ｗａｓ ａｌｍｏｓｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ａｓ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎ􀆰 Ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ＮＡＤ（Ｈ） ａｎｄ
ＡＴＰ ｉｎ ＢＡ２０９ ｗｅｒｅ ｂｏｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ＢＡ２０８ ａｎｄ ＢＡ２０４．Ｏｕｒ ｓｔｕｄｙ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｔｈｅ
ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｃｏｎｓｉｄｅｒ ｔｈｅ ｔｗｏ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ＮＡＤ（Ｈ） ａｎｄ ＡＴＰ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｘｙｌｏｓｅ􀆰
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ； ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ； ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ； Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ；ｓｕｃｃｉｎａｔｅ；ｘｙｌｏｓｅ
　 　 丁二酸，俗称琥珀酸，作为一种优秀的 Ｃ４ 平台
化合物，可被广泛用于药物、精细化工产品以及可
生物降解聚合物的前体，美国能源部报告将丁二酸
列为未来 １２ 种最有潜力的生物基大宗化学品之
一［１］。 利用生物转化法转化可再生资源生产丁二
酸的过程中可固定大量的 ＣＯ２，有效减轻温室效应，
近年来受到了各国科研人员的关注［２］。 在众多的
丁二酸生产菌中，大肠杆菌具有培养条件简单、代
谢网络明确、易改造、易操作等特点，已成为生物法
合成丁二酸的研究热点［３－４］。
磷酸烯醇式丙酮酸 （ＰＥＰ）转化成草酰乙酸
（ＯＡＡ）是生成丁二酸的第一步，磷酸烯醇式丙酮酸羧
化酶（ＰＰＣ）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（ＰＣＫ）均能
催化 ＰＥＰ 到 ＯＡＡ的反应，但是，由 ＰＣＫ催化可以产
生能量 ＡＴＰ，由 ＰＰＣ 催化没有能量的产生［５］。
Ｍｉｌｌａｒｄ等［６］研究发现，ＰＣＫ只能在 ＰＰＣ 缺陷的大肠
杆菌中才能提高丁二酸的产量。 大肠杆菌 Ｋ１２厌氧
条件下能够利用木糖代谢生长，但是丁二酸不是其主
要的代谢产物，在厌氧发酵中，１ 分子的木糖转化为
丁二酸需要消耗 ２􀆰 ６７ 个 ＡＴＰ，但是整个发酵过程 １
分子木糖只能生成 １􀆰 ６７个 ＡＴＰ，因此，重组大肠杆菌
无法利用木糖生产丁二酸的根本原因是 ＡＴＰ 供给不
足。 Ｌｉｕ等［７］通过在 ＢＡ２０３（ΔｌｄｈＡ，ΔｐｆｌＢ，Δｐｐｃ）菌株
中过量表达 ＰＣＫ，增加 ＡＴＰ 供给，使重组大肠杆菌在
厌氧条件下能够利用木糖发酵生产丁二酸。 Ｚｈａｎｇ
等［８］通过过量表达 ＰＣＫ，提高 ＡＴＰ 的得率，使之满足
菌株生长的需要，从而进一步促进丁二酸的生成。 图
１为 ＢＡ２０４利用木糖产丁二酸的代谢途径。
分析大肠杆菌中 ＮＡＤ（Ｈ）的生物合成及分解
途径［９］ 可 以 发 现， 烟 酸 转 磷 酸 核 糖 激 酶
（ＮＡＰＲＴａｓｅ）是辅酶 ＮＡＤ（Ｈ）补救合成途径的限速
酶［１０］，Ｂｅｒｒｉｏｓ⁃Ｒｉｖｅｒａ 等［１１］和 Ｓａｎ 等［１２］在研究辅因
子调控对大肠杆菌代谢流分布的影响过程中，通过
过量表达烟酸转磷酸核糖激酶使胞内 ＮＡＤ（Ｈ）总
量提高了 ４１􀆰 ７％。 刘嵘明等［１３］通过在大肠杆菌中
表达烟酸转磷酸核糖激酶，恢复了菌株厌氧条件下
图 １　 ＢＡ２０４利用木糖厌氧发酵产丁二酸
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｘｙｌｏｓｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｂｙ ＢＡ２０４
ｆｏｒ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
的生长能力，葡萄糖的代谢速率进一步提高。
本文在 ＢＡ２０４基础上，为了进一步提高生物量
及丁二酸的产量，构建了共表达 ＰＣＫ 和 ＮＡＰＲＴａｓｅ
的基因工程菌，采用 ２ 种不同的构建方案，构建了
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＡ２０８（ＢＡ２０３ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｃｋ）和 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ
ＢＡ２０９（ＢＡ２０３ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｃｋ ｔｒｃ ｐｎｃＢ），考察这 ２
株菌株的发酵性能和产酸情况，进一步考察 ＮＡＤ
（Ｈ）和 ＡＴＰ ２种辅因子对重组大肠杆菌利用木糖合
成丁二酸的影响。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 菌株和质粒
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ１２、ＢＡ２０３ 及 ＢＡ２０４ 由姜岷课题组实
验室自主保藏；质粒 ｐＴｒｃ９９ａ 由邵蔚蓝教授惠赠；
８１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
ｐＴｒｃ９９ａ ｐｃｋ由笔者所在实验室构建并保藏。
１􀆰 １􀆰 ２　 主要试剂
限制性内切酶、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ聚合酶和 Ｓｏｌｕｔｉｏｎ
Ｉ快速连接酶均购自宝生物工程（大连）有限公司；
质粒小量快速提取试剂盒购自北京拜尔迪代理
Ｂｉｏｍｉｇａ公司；基因组提取试剂盒购自北京天根生化
科技有限公司；琼脂糖凝胶 ＤＮＡ回收试剂盒购自爱
思进生物技术（杭州）有限公司；氨苄青霉素购于上
海生工生物工程有限公司；酵母提取物和胰蛋白胨
购自 Ｏｘｏｉｄ公司；ＣＯ２气体购自南京三乐集团有限公
司气体供应中心；其他试剂均为国产分析纯。
１􀆰 １􀆰 ３　 引物
参照 ｐｎｃＢ 基因序列（来源于 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ１２ 基因
组，登录号为 ＥＣＫ３２２５）设计，由金斯瑞生物科技公
司合成。 扩增 ｐｎｃＢ基因的引物为 Ｐ１（５′ ＣＡＴＧＣＣ⁃
ＡＴＧＧＡＴＧＡＣＡＣＡＡＴＴＣＧＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＴ ３′） 和
Ｐ２（５′ ＣＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＣＧＡＴＴＡＧＣＴＣＣＣＴＧＡＴＧ
３′），加下划线的序列分别为限制性内切酶 ＮｃｏⅠ和
ＳａｃⅠ的酶切位点。 扩增带启动子 ｔｒｃ ｐｎｃＢ 基因的
引物为 Ｐ３（５′ ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣ⁃
ＣＧＧＣＴＣＧ ３′）和 Ｐ４（５′ ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＧＣＣＧ⁃
ＡＴＴＡＧＣＴＣＣＣＴＧＡＴＧ ３′），加下划线的序列为
ＸｂａⅠ限制性酶切位点。
１􀆰 １􀆰 ４　 培养基及培养条件
有氧培养基（ＬＢ培养基）：蛋白胨 １０ ｇ ／ Ｌ，酵母
粉 １０ ｇ ／ Ｌ，ＮａＣｌ ５ ｇ ／ Ｌ；ｐＨ ７􀆰 ０；氨苄青霉素的终质
量浓度为 １００ μｇ ／ ｍＬ。
厌氧 ３０ ｍＬ血清瓶发酵用培养基：３０ ｍＬ ＬＢ 液
体培养基，２０ ｇ ／ Ｌ木糖，添加 １６ ｇ ／ Ｌ碱式 ＭｇＣＯ３（加
入碱式 ＭｇＣＯ３ 的目的是为了控制发酵过程中的
ｐＨ，且中和反应产生的 ＣＯ２，对于厌氧环境的维持
和有机酸的积累都是有利的［１４］ ）。 添加终浓度为
１􀆰 ０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ的烟酸（ＮＡ），抗生素添加量同有氧培
养，添加终浓度为 ０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的诱导剂 ＩＰＴＧ 以诱
导表达 ＰＣＫ和 ＮＡＰＲＴａｓｅ。
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 ＰＣＲ扩增
以 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ１２为模板，Ｐ１、Ｐ２为引物，进行 ｐｎｃＢ
片段的扩增，反应条件：９４ ℃ ５ ｍｉｎ；９４ ℃ ４５ ｓ、
５５ ℃ ４５ ｓ、７２ ℃ １􀆰 ３ ｍｉｎ，３５个循环；７２ ℃ １０ ｍｉｎ。
同时，以 Ｐ３、Ｐ４为引物，进行 ｔｒｃ ｐｎｃＢ片段的扩增，
反应条件：９４ ℃ ５ ｍｉｎ；９４ ℃ ４５ ｓ、５７ ℃ ４５ ｓ、７２ ℃
１􀆰 ３ ｍｉｎ，３５个循环；７２ ℃ １０ ｍｉｎ。 反应体系：上下
游引物 （ ５０ ｐｍｏｌ ／ μＬ） 各 １ μＬ；模板 ＤＮＡ （ １００
ｎｇ ／ μＬ） １ μＬ； ｌ × １０ 倍缓冲液 ５ μＬ； ｄＮＴＰｓ （ １０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ）４ μＬ；ＤＮＡ 聚合酶 （ ２􀆰 ５ Ｕ ／ μＬ） ０􀆰 ５ μＬ；
ｄｄＨ２Ｏ ３７􀆰 ５ μＬ，总体积 ５０ μＬ。
１􀆰 ２􀆰 ２　 ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｃｋ质粒的构建
将纯化后的 ｐｎｃＢ 基因片段以及质粒 ｐＴｒｃ９９ａ
ｐｃｋ分别进行 ＮｃｏⅠ和 ＳａｃⅠ的双酶切反应，把双酶
切后得到的片段在 Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ⅰ快速连接酶的作用下
１６℃连接 ２ ｈ，构建重组质粒 ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｃｋ并
转化于 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＡ２０３ 中。 构建流程如图 ２ 所示，将
其命名为菌株 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＡ２０８。
图 ２　 ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｃｋ 表达载体的构建图谱
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐＴｒｃ９９ａ⁃ｐｎｃＢ⁃ｐｃｋ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ
１􀆰 ２􀆰 ３　 ｐＴｒｃ９９ａ ｐｃｋ ｔｒｃ ｐｎｃＢ质粒的构建
将纯化后的 ｔｒｃ ｐｎｃＢ 基因片段以及质粒
ｐＴｒｃ９９ａ ｐｃｋ进行 ＸｂａⅠ单酶切反应，把单酶切后得
到的片段在 ＤＮＡ连接酶的作用下 ３７ ℃连接过夜，
构建重组质粒 ｐＴｒｃ９９ａ ｐｃｋ ｔｒｃ ｐｎｃＢ 并转化于
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＡ２０３中。 构建流程如图 ３ 所示将其命名为
菌株 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＡ２０９。
１􀆰 ２􀆰 ４　 重组菌 ＰＣＫ和 ＮＡＰＲＴａｓｅ的酶活测定
样品处理：超声破碎时间 ３ ｓ，间隙时间 ５ ｓ，总
工作时间 ３ ｍｉｎ，然后于 ４ ℃、１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １５
ｍｉｎ，取上清即粗酶液，进行 ＰＣＫ 和 ＮＡＰＲＴａｓｅ 酶活
分析。
总蛋白浓度测定参照 Ｂｒａｄｆｏｒｄ 法［１５］，以牛血清
白蛋白（ＢＳＡ）为标准。
ＰＣＫ酶活检测参照文献［７］，ＮＡＰＲＴａｓｅ 酶活检
测参照文献［１６］，均通过检测样品 ３４０ ｎｍ 处吸光
９１　 第 １期　 陈　 旭等：共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和烟酸转磷酸核糖激酶提高重组大肠杆菌发酵木糖产丁二酸
图 ３　 ｐＴｒｃ９９ａ ｐｃｋ ｔｒｃ ｐｎｃＢ表达载体的构建图谱
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐＴｒｃ９９ａ⁃ｐｃｋ⁃ｔｒｃ⁃ｐｎｃＢ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ
值的变化，根据测定的标准曲线换算成底物浓度。
ＰＣＫ酶活定义为： １ ｍｉｎ 内催化 １ μｍｏｌ 的
ＮＡＤＨ 转 化 为 ＮＡＤ＋ 所 需 要 的 酶 量 为 １ Ｕ。
ＮＡＰＲＴａｓｅ酶活定义为：１ ｍｉｎ内催化 １ ｍｍｏｌ的烟酸
转化为烟酸单核苷酸所需要的酶量为 １ Ｕ。 比酶活
定义为每毫克蛋白含有的酶活（Ｕ ／ ｍｇ）。
１􀆰 ２􀆰 ５　 培养方法
摇瓶的有氧培养：把保存于－８０ ℃的菌株涂布
在加有相应抗生素的平板上进行菌种的活化，挑取
单菌落到 ５ ｍＬ ＬＢ试管中，并置于 ３７ ℃，２００ ｒ ／ ｍｉｎ
培养 １０ ｈ，然后按 １％接种量接种到含有 ５０ ｍＬ ＬＢ
培养基的 ５００ ｍＬ 的摇瓶中，３７ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ，好氧
培养 ６ ｈ。
厌氧血清瓶发酵：转接 ３ ｍＬ（１０％）的有氧培养
菌液到装有 ３０ ｍＬ ＬＢ 的血清瓶中，加入终浓度为
２０ ｇ ／ Ｌ 的木糖、１６ ｇ ／ Ｌ 碱式 ＭｇＣＯ３ 以保持 ｐＨ 在
６􀆰 ８ 左右，加入终浓度为 ０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ的 ＩＰＴＧ和 １􀆰 ０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮＡ，通入过滤除菌后的 ＣＯ２气体 ２ ｍｉｎ，保
证血清瓶中为厌氧环境，３０ ℃、１７０ ｒ ／ ｍｉｎ 厌氧发
酵，发酵周期 ７２ ｈ。
１􀆰 ２􀆰 ６　 分析方法
细胞干质量（ＤＣＷ，ｇ ／ Ｌ）由 ＤＣＷ 与 ＯＤ６００测定
的标准曲线换算得到，换算公式为 ＤＣＷ ＝ ０􀆰 ４ ×
ＯＤ６００。 培养基中的木糖、有机酸用高效液相色谱法
（ＨＰＬＣ）检测，木糖使用模型 ＲＩ１０１ 折射率检测器
（Ｓｈｏｄｅｘ，ＵＳＡ）和 Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ ８７Ｈ（７􀆰 ８ ｍｍ×３００
ｍｍ）的离子交换层析柱（Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ，ＵＳＡ）在波长 ２１５
ｎｍ处测定。 有机酸色谱柱为 Ｐｒｅｖａｉｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ａｃｉｄ，
流动相为 ２５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＫＨ２ ＰＯ４（ ｐＨ ２􀆰 ５），流速 １􀆰 ０
ｍＬ ／ ｍｉｎ，紫外检测波长 ２１５ ｎｍ。 产物中的辅酶
ＮＡＤＨ与 ＮＡＤ＋浓度的测定参照文献［１７］。 ＡＴＰ 的
检测采用 ＢａｃＴｉｔｅｒ ＧｌｏＴＭ微生物细胞活性检测。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 重组菌株 ＢＡ２０８和 ＢＡ２０９的构建
将构建好的菌株 ＢＡ２０８ 涂布于含氨苄青霉素
平板后挑选抗性克隆，提取质粒后进行 ＳａｃⅠ单酶
切鉴定，结果见图 ４。 由图 ４ 可知：单酶切鉴定的条
带大小为７ ０３６ ｂｐ，与预期的大小一致，并经测序后
目的基因序列与公布的序列 １００％匹配。
Ｍ—标准 ＤＮＡ；１—重组质粒 ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｃｋ ＳａｃⅠ
单酶切产物（７ ０３６ ｂｐ）；２，４—重组质粒 ｐＴｒｃ９９ａ ｐｃｋ ｔｒｃ
ｐｎｃＢ ＳａｃⅠ单酶切产物（７ １１０ ｂｐ）；３—重组质粒 ｐＴｒｃ９９ａ ｐｃｋ
ｔｒｃ ｐｎｃＢ ＥｃｏＲⅤ单酶切正连产物（３ ７６２和 ３ ３４８ ｂｐ）；
５—重组质粒 ｐＴｒｃ９９ａ ｐｃｋ ｔｒｃ ｐｎｃＢ ＥｃｏＲⅤ
单酶切反连产物（４ ６７９和 ２ ４３１ ｂｐ）
图 ４　 质粒 ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｃｋ和质粒 ｐＴｒｃ９９ａ ｐｃｋ
ｔｒｃ ｐｎｃＢ的酶切鉴定
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｃｋ ａｎｄ
ｐＴｒｃ９９ａ ｐｃｋ ｔｒｃ ｐｎｃＢ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ
ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
同样，将构建好的菌株 ＢＡ２０９ 涂布于含氨苄青
霉素平板后挑选抗性克隆，提取质粒后进行 ＳａｃⅠ
单酶切及 ＥｃｏＲⅤ的双酶切鉴定结果见图 ４。 由图 ４
可知：首先进行 ＳａｃⅠ单酶切，总长为 ７ １１０ ｂｐ，说明
目的基因 ｔｒｃ ｐｎｃＢ 已成功插入质粒中。 然后用
ＥｃｏＲⅤ进行双酶切，检查带质粒的片段连接方向是
否正确，正方向连接的大小分别为 ３ ７６２ 和 ３ ３４８
０２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
ｂｐ，反方向连接的大小分别为 ４ ６７９和 ２ ４３１ ｂｐ。 选
取正方向连接的重组质粒经测序后目的基因序列
与公布的序列 １００％匹配。
２􀆰 ２　 重组菌株的诱导表达
按 ２％的接种量转接菌液于摇瓶中，３７ ℃、２００
ｒ ／ ｍｉｎ摇床培养，当菌体 ＯＤ６００约 ０􀆰 ６左右，加入 ＩＰＴＧ
至终浓度为 ０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ， ＮＡ 至终浓度为 １􀆰 ０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ，接着放置于 ３０ ℃、１７０ ｒ ／ ｍｉｎ 的摇床中有氧
诱导。 ８ ｈ后，对 ＢＡ２０８、ＢＡ２０９和对照菌株 ＢＡ２０４进
行相应的粗酶液酶活测定，结果如表 １所示。
由表 １ 得知，重组菌 ＢＡ２０８ 和 ＢＡ２０９ 的 ＰＣＫ
和 ＮＡＰＲＴａｓｅ的酶活均提高了，ＰＣＫ 比酶活分别为
１􀆰 ５２ 和 １􀆰 ８１ Ｕ ／ ｍｇ。 ＮＡＰＲＴａｓｅ 的酶活分别为
１２􀆰 ８３和 ２３􀆰 ７６ Ｕ ／ ｍｇ，分别比 ＢＡ２０４ 高了 １４􀆰 １ 和
２７􀆰 ９ 倍，表明在 ＩＰＴＧ 和 ＮＡ 的诱导下， ＰＣＫ 和
ＮＡＰＲＴａｓｅ均表达良好。
表 １　 各菌株的 ＰＣＫ和 ＮＡＰＲＴａｓｅ酶活
Ｔａｂｌｅ １　 Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＰＣＫ ａｎｄ ＮＡＰＲＴａｓｅ
ｉｎ ｃｒｕｄｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ
菌株 ＰＣＫ比酶活 ／（Ｕ·ｍｇ－１）
ＮＡＰＲＴａｓｅ比酶活 ／
（Ｕ·ｍｇ－１）
ＢＡ２０４ ０􀆰 ４７±０􀆰 ０４ ０􀆰 ８５±０􀆰 ０２
ＢＡ２０８ １􀆰 ５２±０􀆰 ０５ １２􀆰 ８３±０􀆰 １４
ＢＡ２０９ １􀆰 ８１±０􀆰 ０６ ２３􀆰 ７６±０􀆰 １２
２􀆰 ３　 厌氧血清瓶发酵
按 １０％的接种量转接有氧培养菌液于厌氧血
清瓶中，使初始的 ＯＤ６００值为 ０􀆰 ６，添加终浓度为 ０􀆰 １
ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的 ＩＰＴＧ 和 １􀆰 ０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的 ＮＡ，然后置于
３０ ℃、１７０ ｒ ／ ｍｉｎ 摇床中培养。 厌氧发酵 ７２ ｈ 后测
定 ＯＤ６００、残糖和丁二酸的浓度及辅酶 ＮＡＤ
＋、ＮＡＤＨ
和 ＡＴＰ 的含量，结果如表 ２和表 ３所示。
表 ２　 厌氧血清瓶发酵 ７２ ｈ结果
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｅａｌｅｄ ｂｏｔｔｌｅｓ ｆｏｒ ７２ ｈ
ｇ ／ Ｌ
菌株 ρ（ＤＣＷ） ρ（木糖） ρ（丁二酸） ρ（乙酸） ρ（丙酮酸）
ＢＡ２０４ ２􀆰 ４８±０􀆰 ０２ １２􀆰 ８±０􀆰 １ １１􀆰 ０±０􀆰 １ ０􀆰 ７±０􀆰 ２ ０􀆰 ３±０􀆰 ２
ＢＡ２０８ ２􀆰 １５±０􀆰 ０２ １３􀆰 ９±０􀆰 ２ １３􀆰 ８±０􀆰 ３ ０􀆰 ２±０􀆰 １ ０􀆰 ３±０􀆰 １
ＢＡ２０９ ２􀆰 ５３±０􀆰 ０３ １６􀆰 ７±０􀆰 ３ １５􀆰 ８±０􀆰 １ ０􀆰 １±０􀆰 １ ０􀆰 ３±０􀆰 １
表 ３　 对照菌与重组菌的 ＰＣＫ和 ＮＡＰＲＴａｓｅ比酶活，ＮＡＤＨ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤ（Ｈ）和 ＡＴＰ含量及 ＮＡＤＨ ／ ＮＡＤ＋的比例
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＰＣＫ ａｎｄ ＮＡＰＲＴａｓｅ，ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ＮＡＤＨ，ＮＡＤ＋，ＮＡＤ（Ｈ），ＡＴＰ，ａｎｄ ｔｈｅ
ｒａｔｉｏ ｏｆ ＮＡＤＨ ／ ＮＡＤ＋ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ
菌株 ＰＣＫ比酶活 ／（Ｕ·ｍｇ－１）
ＮＡＰＲＴａｓｅ比酶活 ／
（Ｕ·ｍｇ－１）
ＡＴＰ 含量 ／
（ｎｍｏｌ·ｇ－１）
ＮＡＤ＋含量 ／
（μｍｏｌ·ｇ－１）
ＮＡＤＨ含量 ／
（μｍｏｌ·ｇ－１）
ＮＡＤ（Ｈ）含量 ／
（μｍｏｌ·ｇ－１）
ｎ（ＮＡＤＨ） ／
ｎ（ＮＡＤ＋）
ＢＡ２０４ １􀆰 ４５±０􀆰 ０５ ２􀆰 ３５±０􀆰 １４ １４５±５ ８􀆰 ０６±０􀆰 １５ ２􀆰 ０４±０􀆰 ０６ １０􀆰 １１±０􀆰 １２ ０􀆰 ２５±０􀆰 ０２
ＢＡ２０８ １􀆰 ６２±０􀆰 ０４ ２０􀆰 ８３±０􀆰 １４ １９８±６ １１􀆰 ５４±０􀆰 １５ ２􀆰 １５±０􀆰 ０４ １３􀆰 ６９±０􀆰 １４ ０􀆰 １９±０􀆰 ０１
ＢＡ２０９ １􀆰 ７３±０􀆰 ０４ ２６􀆰 ８３±０􀆰 １３ ２３６±５ １８􀆰 ６７±０􀆰 １４ ２􀆰 ２４±０􀆰 ０４ ２０􀆰 ９１±０􀆰 １５ ０􀆰 １２±０􀆰 ０１
　 　 由表 ２、表 ３ 可知：重组菌 ＢＡ２０８ 和 ＢＡ２０９ 的
ＮＡＰＲＴａｓｅ的酶活分别是 ＢＡ２０４ 的 ８􀆰 ９ 和 １１􀆰 ４ 倍，
ＮＡＤ（Ｈ）的总浓度较 ＢＡ２０４ 分别提高了 ３５％和
１００％，ＮＡＤＨ ／ ＮＡＤ＋从 ０􀆰 ２５降低到 ０􀆰 １９和 ０􀆰 １２，同
时，ＢＡ２０８ 和 ＢＡ２０９ 的丁二酸产量分别为 １３􀆰 ８ 和
１５􀆰 ８ ｇ ／ Ｌ，明显高于对照菌株 ＢＡ２０４，副产物特别是
乙酸的产量与 ＢＡ２０４相比有所降低。 因此，在高产
丁二酸大肠杆菌基因工程菌的过程中，辅酶系统
ＮＡＤ（Ｈ）的量是确保重组大肠杆菌细胞生长及高产
丁二酸的重要因素之一。 此外，由于高浓度的
ＮＡＤ（Ｈ）加快了底物消耗，ＡＴＰ 的合成速率也进一
步提高，而充足的 ＡＴＰ 供应可有利于 ＮＡＤ 的合成，
从而促进丁二酸的生成。 因此，ＮＡＰＲＴａｓｅ 和 ＰＣＫ
的共表达更有利于丁二酸的合成。 相较于 ＢＡ２０８，
ＢＡ２０９ 多启动子表达，进一步提高了 ＮＡＰＲＴａｓｅ 和
ＰＣＫ的表达效果，进而提高了 ＮＡＤ（Ｈ）和 ＡＴＰ 的供
给，满足代谢中 ＮＡＤ（Ｈ）和 ＡＴＰ 的需求，最终大大
提高了细胞生长和丁二酸的产量。 本文构建的菌
１２　 第 １期　 陈　 旭等：共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和烟酸转磷酸核糖激酶提高重组大肠杆菌发酵木糖产丁二酸
株是在辅酶补救途径过量表达烟酸转磷酸核糖激
酶来提高 ＮＡＤ（Ｈ）的总量，并且和磷酸烯醇式丙酮
酸羧化激酶共表达，为重组大肠杆菌产丁二酸提供
新的思路。
３　 结论
以自主构建的大肠杆菌 ＢＡ２０３ （ΔｐｆｌＢ，ΔｌｄｈＡ，
Δｐｐｃ）为出发菌株，共表达了磷酸烯醇式丙酮酸羧
化激酶和烟酸转磷酸核糖激酶，ｐｃｋ 基因的过量表
达使该菌株能有效地利用木糖，满足木糖代谢 ＡＴＰ
的供给。 ｐｎｃＢ基因的过量表达，提高了代谢中 ＮＡＤ
（Ｈ）的总量。 同时，ＮＡＤ（Ｈ）生物合成途径也需要
ＡＴＰ 的参与，基因 ｐｃｋ 的过量表达也满足了辅酶合
成途径中 ＡＴＰ 的供应，即构建了菌株 ＢＡ２０８ 和
ＢＡ２０９。 ＢＡ２０９在重组质粒构建上比 ＢＡ２０８多 １个
启动子，这样基因 ｐｃｋ 和 ｐｎｃＢ 各由 １ 个启动子操
纵，大大提高了基因的表达效果。 由发酵结果可
知，ＢＡ２０９的细胞生长和产酸能力均高于 ＢＡ２０８ 和
ＢＡ２０４，特别是 ＮＡＰＲＴａｓｅ和 ＰＣＫ的酶活明显提高，
使 ＮＡＤ（Ｈ）的总量和 ＡＴＰ 得到提高，使代谢流向更
有利于还原性三羧酸循环方向，从而提高丁二酸产
量。 另一方面，ＢＡ２０９ 菌株的构建进一步强调了
ＮＡＤ（Ｈ）的总量和 ＡＴＰ 含量是重组大肠杆菌厌氧
生产还原性末端产物的重要因素。 通过辅酶与能
量系统的耦合对提高细胞生长和丁二酸产量具有
重要的意义。
参考文献：
［ １ ］　 Ｗｅｒｐｙ Ｔ，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ Ｇ． Ｔｏｐ ｖａｌｕｅ ａｄｄｅｄ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｆｒｏｍ ｂｉｏｍａｓｓ
［Ｒ］．Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ：Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ，２００４：２２⁃２５．
［ ２ ］ 　 Ｚｅｉｋｕｓ Ｊ Ｇ，Ｊａｉｎ Ｍ Ｋ，Ｅｌａｎｋｏｖａｎ Ｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｒｋｅｔｓ ｆｏｒ ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ［ Ｊ］ ．Ａｐｐｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９９，５１（５）：５４５⁃５５２．
［ ３ ］ 　 岳方方，姜岷，马江锋，等．产琥珀酸大肠杆菌工程菌株的构
建［Ｊ］ ．中国酿造，２０１０（２）：２５⁃２７．
［ ４ ］ 　 姜岷，马江锋，陈可泉，等．重组大肠杆菌产琥珀酸研究进展
［Ｊ］ ．微生物学通报，２００８，３６（１）：１２０⁃１２４．
［ ５ ］ 　 Ｗｕ Ｈ，Ｌｉ Ｚ Ｍ，Ｚｈｏｕ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＺＮ１１１ ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ ｇｒｏｗｎ ｏｎ
ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｉｃ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ［Ｊ］ ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２００９，
４４：１６５⁃１６９．
［ ６ ］ 　 Ｍｉｌｌａｒｄ Ｃ Ｓ，Ｃｈａｏ Ｙ Ｐ，Ｌｉａｏ Ｊ Ｃ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｃｉｎｉｃ
ａｃｉｄ ｂｙ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｏｓｅ ｉｎ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ［ Ｊ ］ ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９６， ６２（５）：
１８０８⁃１８１０．
［ ７ ］ 　 Ｌｉｕ Ｒ Ｍ，Ｌｉａｎｇ Ｌ Ｙ，Ｃｈｅｎ Ｋ Ｑ，ｅｔ ａｌ． Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｘｙｌｏｓｅ ｔｏ
ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｂｙ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ＡＴＰ ｓｕｐｐｌｙ ｉｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ
ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ［Ｊ］ ．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１２，
９４：９５９⁃９６８．
［ ８ ］ 　 Ｚｈａｎｇ Ｘ Ｌ，Ｊａｎｔａｍａ Ｋ，Ｍｏｏｒｅ Ｔ Ｃ，ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ
ｅｎｅｒｇｙ⁃ｃｏｎｓｅｒｖｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｆｏｒ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ［Ｊ］ ．ＰＮＡＳ，２００９，１０６（４８）：２０１８０⁃２０１８５．
［ ９ ］ 　 苟冬梅，梁丽亚，刘嵘明，等．过量表达烟酸单核苷酸腺苷酰
转移酶对大肠杆菌 ＮＺＮ１１１产丁二酸的影响［Ｊ］ ．生物工程学
报，２０１２，２８（９）：１０５９⁃１０６９．
［１０］ 　 Ｉｍｓａｎｄｅ Ｊ， Ｐａｒｄｅｅ Ａ Ｂ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｙｒｉｄｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ［ Ｊ］ ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， １９６２， ２３７：
１３０５⁃１３０８．
［１１］ 　 Ｂｅｒｒｉｏｓ⁃Ｒｉｖｅｒａ Ｓ Ｊ， Ｓａｎ Ｋ Ｙ， Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｇ Ｎ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ
ＮＡＰＲＴａｓｅ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＮＡＤ，ｔｈｅ ＮＡＤＨ ／
ＮＡＤ＋ ｒａｔｉｏ，ａｎｄ ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
［Ｊ］ ．Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ，２００２，４（３）：２３８⁃２４７．
［１２］ 　 Ｓａｎ Ｋ Ｙ， Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｇ Ｎ， Ｂｅｒｒíｏｓ⁃Ｒｉｖｅｒａ Ｓ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ
ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ
ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｆｌｕｘ ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ［ Ｊ］ ．Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ，
２００２，４（２）：１８２⁃１９２．
［１３］ 　 刘嵘明，马江锋，梁丽亚，等．过量表达烟酸转磷酸核糖激酶
对大肠杆菌 ＮＺＮ１１１ 产丁二酸的影响［ Ｊ］ ．生物工程学报，
２０１１，２７（１０）：１４３８⁃１４４７．
［１４］ 　 Ｗｕ Ｈ，Ｌｉ Ｚ，Ｚｈｏｕ Ｌ，ｅｔ ａｌ． Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ
ｔｈｅ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｆｌＢ ｌｄｈＡ ｄｏｕｂｌｅ ｍｕｔａｎｔ
ａｓ ａ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎａｐｌｅｒｏｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｃｅｄｉｎｇ
ａｅｒｏｂｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ ［ Ｊ］ ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２００７， ７３ （ ２４ ）：
７８３７⁃７８４３．
［１５］ 　 Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｍ Ｍ．Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ
ｐｒｏｔｅｉｎ⁃ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ［Ｊ］ ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９７６，７２：２４８⁃２５４．
［１６］ 　 Ｖｉｎｉｔｓｋｙ Ａ，Ｇｒｕｂｍｅｙｅｒ Ｃ．Ａ ｎｅｗ ｐａｒａｄｉｇｍ ｆｏｒ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｅｒｇｙ
ｃｏｕｐｌｉｎｇ：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ｎｉｃｏｔｉｎａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓ
ｆｅｒａｓｅ［Ｊ］ ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９３，２６８：２６００４⁃２６０１０．
［１７］ 　 李建，陈可泉，黄秀梅，等．厌氧发酵有机酸体系中 ＮＡＤ＋和
ＮＡＤＨ测定方法的建立 ［ Ｊ ］ ． 食品科技， ２００８， ３３ （ １２ ）：
２５４⁃２５７．
（责任编辑　 荀志金）
２２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷