全 文 ：第 １４卷第 ２期
２０１６年 ３月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １４ Ｎｏ􀆰 ２
Ｍａｒ􀆰 ２０１６
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１６􀆰 ０２􀆰 ０１０
收稿日期：２０１４－０１－０２
基金项目：国家自然科学基金（３０８０００１８、３０９７００５８）
作者简介：高堂杰（１９８７—），男，湖南浏阳人，研究方向：生物化学、发酵工程，；张震宇（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｚｙ＠ ｊｉａｎｇｎａｎ．ｅｄｕ．ｃｎ
Ｌｅｕ１ｐ参与调节 Ｖ ＡＴＰ酶的活性
高堂杰，张震宇
（江南大学 糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，２１４１２２）
摘　 要：ＲＡＶＥ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｈ＋ ⁃ＡＴＰａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｃｕｏｌａｒ ａｎｄ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）由 Ｒａｖ１ｐ、Ｒａｖ２ｐ和 Ｓｋｐ１ｐ３个亚基
组成，是 Ｖ ＡＴＰ 酶活性调节机制中一个关键的多亚基复合物调节因子； Ｌｅｕ１ｐ 能够与 ＲＡＶＥ 相互作用。 通过融
合 ＰＣＲ、同源重组分别构建了酿酒酵母 ＢＹ４７４２的 Ｒａｖ１、Ｒａｖ２、Ｌｅｕ１和 Ｖｍａ２缺陷型菌株。 进一步研究重组菌株对
ｐＨ及 ＣａＣｌ２的耐受能力发现：Ｌｅｕ１缺陷型菌株（３ 异丙基苹果酸异构酶（Ｌｅｕ１ｐ）缺失）的生长状况与 Ｒａｖ１、Ｒａｖ２ 缺
陷型菌株的生长状况基本一致，表明 ＲＡＶＥ对 Ｖ ＡＴＰ 酶的活性调节极有可能需要通过与 Ｌｅｕ１ｐ 结合才能实现。
笔者所在实验室为进一步研究 ＲＡＶＥ与 Ｌｅｕ１ｐ的相互关系及其对 Ｖ ＡＴＰ 酶的活性调节提供了重要依据。
关键词：Ｖ ＡＴＰ 酶；ＲＡＶＥ；Ｌｅｕ１ｐ；同源重组；融合 ＰＣＲ
中图分类号：Ｑ９３６　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１６）０２－００５１－０７
Ｌｅｕ１ｐ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ Ｖ⁃ＡＴＰａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
ＧＡＯ Ｔａｎｇｊｉｅ，ＺＨＡＮＧ Ｚｈｅｎｙｕ
（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，
Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＲＡＶＥ （ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｈ＋ ⁃ＡＴＰａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｃｕｏｌａｒ ａｎｄ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ） ｃｏｍｐｌｅｘ
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｒａｖ１ｐ， Ｒａｖ２ｐ ａｎｄ Ｓｋｐ１ｐ， ｉｓ ａ ｋｅｙ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ Ｖ⁃ＡＴＰａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ
ｍｅｃｈａｎｉｓｍ． Ｌａｔｅｓｔ ｎｅｗｓ ｓｈｏｗｅｄ Ｌｅｕ１ｐ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＲＡＶＥ． Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ｗｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ４
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ４７４２ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｔｈａｔ ｗｅｒｅ ｌａｃｋ ｏｆ Ｒａｖ１，Ｒａｖ２， Ｖｍａ２ ａｎｄ Ｌｅｕ１
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｂｙ ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ ａｎｄ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ． ＲＡＶＥ ｆｏｒ Ｖ⁃ＡＴＰａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｓ
ｌｉｋｅｌｙ ｔｏ ｂｅ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｂｙ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｌｅｕ１ｐ． Ｏｕｒ ｓｔｕｄｙ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｔｈｅ
ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ＲＡＶＥ ａｎｄ Ｌｅｕ１ｐ，ａｌｓｏ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｖ⁃ＡＴＰａｓｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｖ⁃ＡＴＰａｓｅ；ＲＡＶＥ；Ｌｅｕ１ｐ；ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ；ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ
　 　 Ｖ ＡＴＰ 酶（ ｖａｃｕｏｌａｒ ＡＴＰａｓｅ）又称液泡 ＡＴＰ
酶，广泛存在于生物的细胞膜和细胞器膜中。 它
能够通过水解 ＡＴＰ 产生的能量来转移质子，从而
调节细胞内外的 ｐＨ，使细胞处于一个相对稳定的
ｐＨ环境［１］ ；同时，Ｖ ＡＴＰ 酶担负着调节细胞内部
分离子浓度的功能，如 Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋等［２－３］ 。 Ｖ ＡＴＰ
酶的质子泵效应与生物体内的许多生化反应及代
谢活动息息相关，同时也与一系列疾病（如癌症、
艾滋等）的产生与治疗有关［４－６］ 。 目前，医学人员
已越来越多地以 Ｖ ＡＴＰ 酶为目标来研发靶向性
药物。 Ｖ ＡＴＰ 酶由 Ｖ１和 Ｖ０两部分组成。 Ｖ１位于
细胞质当中，其主要功能是水解 ＡＴＰ；Ｖ０镶嵌于细
胞膜当中，负责转移质子。 单独的 Ｖ１、Ｖ０是没有活
性的，只有当二者结合形成完整的 Ｖ ＡＴＰ 酶，才
能发挥各自的功能，共同起到调节细胞内环境稳
定的作用［７－９］ 。 Ｖ ＡＴＰ 酶的活性调节受诸多因素
的影响，其调节机制目前尚未研究透彻，但文献
［１０－１１］的研究表明，ＲＡＶＥ（ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｈ＋
ＡＴＰａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｃｕｏｌａｒ ａｎｄ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）在
Ｖ ＡＴＰ 酶的活性调节当中具有重要作用。 ＲＡＶＥ
由 Ｒａｖｌｐ、Ｒａｖ２ｐ和 Ｓｋｐｌｐ ３ 个亚基组成。 当细胞内
环境发生变化时，ＲＡＶＥ 可以通过与 Ｖ１的结合或
分离来调节 Ｖ１与 Ｖ０的分离与结合，从而起到调节
Ｖ ＡＴＰ酶活性的作用，ＲＡＶＥ 的缺失会导致 Ｖ
ＡＴＰ 酶的形成严重受阻，且形成的 Ｖ ＡＴＰ 酶活性
也严重受到影响。
目前，关于 ＲＡＶＥ 研究最多的是 Ｓｋｐｌｐ，且已经
得到其晶体结构［１１］。 但是对 Ｒａｖｌｐ、Ｒａｖ２ｐ 的研究
还相对较少。 笔者所在实验室致力于 ＲＡＶＥ 复合
物的研究，目前通过亲和纯化及质谱鉴定，确定了
一系列能与 ＲＡＶＥ产生相互作用的蛋白，其中 ３ 异
丙基苹果酸异构酶（Ｌｅｕ１ｐ）与 ＲＡＶＥ 具有相互作用
关系的发现尚属首次［１２］。 Ｌｅｕ１ｐ 在亮氨酸合成途
径第一步反应中将 α 异丙基苹果酸异构为 β 异丙
基苹果酸，为亮氨酸的合成提供前体［１３］。 为了进一
步研究 Ｌｅｕ１ｐ 与 ＲＡＶＥ 及 Ｖ ＡＴＰ 酶之间的关系，
本实验通过构建重组菌株来研究 Ｌｅｕ１ｐ 是否影响
Ｖ ＡＴＰ酶的功能活性。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 菌株与质粒
大肠杆菌 ＪＭ１０９、质粒 ｐＲＳ４２５（带有 Ｌｅｕ２ 基因
序列）及 ｐＵＣｍ Ｔ 载体，保存于笔者所在实验室。
用到的酵母菌株如表 １所示。
表 １　 本实验用到的酵母菌株
Ｔａｂｌｅ １　 Ｙｅａｓｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
菌株 基因型
ＢＹ４７４２ ＭＡＴａ ｈｉｓ３ ｌｅｕ２ ｌｙｓ２ ｕｒａ３
ＢＹ４７４２Ｆｌａｇ Ｒ２ ＭＡＴａ ｈｉｓ３ ｌｅｕ２ ｌｙｓ２ ｕｒａ３
ＢＹ４７４２ ｒａｖ１Δ ＭＡＴａ ｈｉｓ３ ｌｅｕ２ ｌｙｓ２ ｕｒａ３ ｒａｖ１Δ：：ＬＥＵ２
ＢＹ４７４２ ｒａｖ２Δ ＭＡＴａ ｈｉｓ３ ｌｅｕ２ ｌｙｓ２ ｕｒａ３ ｒａｖ２Δ：：ＬＥＵ２
ＢＹ４７４２ ｖｍａ２Δ ＭＡＴａ ｈｉｓ３ ｌｅｕ２ ｌｙｓ２ ｕｒａ３ ｖｍａ２Δ：：ＬＥＵ２
ＢＹ４７４２ ｌｅｕ１Δ ＭＡＴａ ｈｉｓ３ ｌｅｕ２ ｌｙｓ２ ｕｒａ３ ｌｅｕ１Δ：：ＬＥＵ２ＫａｎＭＸ６
１􀆰 １􀆰 ２　 试剂
Ｐｆｕ ＤＮＡ聚合酶、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ 混合
物、十二烷基磺酸钠（ ＳＤＳ）、Ｔｒｉｓ、溴化乙锭（ＥＢ）、
异丙基 β Ｄ 硫代半乳糖苷（ ＩＰＴＧ）、琼脂糖 Ｍ、
小量质粒提取试剂盒、ＤＮＡ 凝胶回收试剂盒、ＰＣＲ
产物纯化试剂盒、氨苄青霉素、卡那霉素（Ｇ４１８ 硫
酸盐）、１ ｋｂ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ，ＢＢＩ 公司；限制性内切酶
ＢａｍＨ Ｉ、Ｎｄｅ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ，１ ｋｂ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ Ｍａｒｋｅｒ，λ
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ，ＴａＫａＲａ 公司；Ｔ４ ＤＮＡ
ｌｉｇａｓｅ， Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ 公 司； Ｌｙｔｉｃａｓｅ 酵 母 破 壁 酶，
Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ公司；其余试剂均购自国药集团化
学试剂有限公司。
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 酿酒酵母基因组 ＤＮＡ提取
挑取酿酒酵母 ＢＹ４７４２ Ｆｌａｇ Ｒ２ 单菌落于
ＹＰＤ液体培养基中，３０ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ过夜培养 １８～
２０ ｈ。 参照文献［１４］的方法提取基因组 ＤＮＡ。
１􀆰 ２􀆰 ２　 目的基因的融合与克隆
酿酒酵母 ＢＹ４７４２ 是 Ｌｅｕ２ 缺陷型菌株，通过融
合 ＰＣＲ（图 １）在 Ｒａｖ１、Ｒａｖ２ 和 Ｖｍａ２ 片段中插入
Ｌｅｕ２基因的同时敲除原基因的部分片段，得到与基
因组 ＤＮＡ 具有同源互补序列的重组基因片段：
Ｒ１Ｆ Ｒ１ＬＥＵ２ Ｒ１Ｄ、Ｒ２Ｆ Ｒ２ＬＥＵ２ Ｒ２Ｄ、Ｖ２Ｆ
Ｖ２ＬＥＵ２ Ｖ２Ｄ （其中 Ｒ１Ｆ、 Ｒ２Ｆ 和 Ｖ２Ｆ 分别为
Ｒａｖ１、Ｒａｖ２和 Ｖｍａ２ 的上游同源序列；Ｒ１Ｄ、Ｒ２Ｄ 和
Ｖ２Ｄ分别为 Ｒａｖ１、Ｒａｖ２和 Ｖｍａ２的下游同源序列）。
融合后的目的片段转化酵母 ＢＹ４７４２，经同源重组整
合到其基因组当中，通过 ＳＤ Ｌｅｕ 培养基筛选到重
组菌株。
图 １　 融合 ＰＣＲ示意图
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｄｉａｇｒａｍ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ
由于 Ｌｅｕ１ｐ 与 Ｌｅｕ２ｐ 同为亮氨酸合成途径当
中的酶，因此在构建 Ｌｅｕ１缺陷型菌株时不能以ＳＤ
Ｌｅｕ培养基进行筛选，故选取 ＫａｎＭＸ６ 作为抗性标
记，以含 Ｇ４１８的 ＹＰＤ 固体培养基进行筛选。 通过
２５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
融合 ＰＣＲ 及酶切连接等方法，在 Ｌｅｕ１ 基因片段当
中插入 Ｌｅｕ２ 及 ＫａｎＭＸ６ 基因，同时敲除 Ｌｅｕ１ 的部
分核苷酸序列，得到与基因组 ＤＮＡ具有同源互补序
列的重组片段：ＬＥＵ１Ｆ ＬＥＵ２ ＫａｎＭＸ６ ＬＥＵ１Ｄ
（其中 ＬＥＵ１Ｆ、ＬＥＵ１Ｄ分别为 Ｌｅｕ１的上游同源序列
及下游同源序列）。 重组片段转化酵母 ＢＹ４７４２ 经
同源重组整合到基因组当中，通过选择培养基进行
筛选得到重组菌株。
以酿酒酵母 ＢＹ４７４２ Ｆ Ｒ２ 基因组为模板，通
过 ＰＣＲ 扩增 Ｒ１Ｆ、 Ｒ１Ｄ、 Ｒ２Ｆ、 Ｒ２Ｄ、 Ｖ２Ｆ、 Ｖ２Ｄ、
ＬＥＵ１Ｆ、ＬＥＵ１Ｄ 及 ＫａｎＭＸ６， ＰＣＲ 引物对分别为
Ｒ１ｐ１ ／ Ｒ１ｐ２、 Ｒ１ｐ５ ／ Ｒ１ｐ６、 Ｒ２ｐ１ ／ Ｒ２ｐ２、 Ｒ２ｐ５ ／ Ｒ２ｐ６、
Ｖｐ１ ／ Ｖｐ２、 Ｖｐ５ ／ Ｖｐ６、 Ｌｐ１ ／ Ｌｐ２、 Ｌｐ５ ／ Ｌｐ６、 Ｌｐ７ ／ Ｌｐ８
（表 ２）。 ＰＣＲ反应程序：９４ ℃预变性 ４ ｍｉｎ；然后 ９８
℃变性 １ ｍｉｎ，５８ ℃退火 ３０ ｓ，７２ ℃延伸 １ ｍｉｎ，３０
个循环；最后 ７２ ℃延伸 １０ ｍｉｎ。 扩增产物通过 ＰＣＲ
产物纯化试剂盒纯化回收。
以质粒 ｐＲＳ４２５ 为模板， Ｒ１ｐ３ ／ Ｒ１ｐ４、 Ｒ２ｐ３ ／
Ｒ２ｐ４、Ｖｐ３ ／ Ｖｐ４、Ｌｐ３ ／ Ｌｐ４ 为引物，分别扩增 Ｌｅｕ２。
ＰＣＲ反应程序：９４ ℃预变性 ４ ｍｉｎ；然后 ９８ ℃变性 １
ｍｉｎ，５８ ℃退火 ３０ ｓ，７２ ℃延伸 １ ｍｉｎ ２０ ｓ，３０ 个循
环；最后 ７２ ℃延伸 １０ ｍｉｎ。 扩增产物通过 ＰＣＲ 产
物纯化试剂盒纯化回收。
以上述 ＰＣＲ 产物为模板，Ｒ１ｐ１ ／ Ｒ１ｐ６、Ｒ２ｐ１ ／
Ｒ２ｐ６、Ｖｐ１ ／ Ｖｐ６为引物，先采用 ＫＯＤ Ｐｌｕｓ Ｎｅｏ 通过
融合 ＰＣＲ 分别扩增 Ｒ１Ｆ ＬＥＵ２ Ｒ１Ｄ、 Ｒ２Ｆ
ＬＥＵ２ Ｒ２Ｄ及 Ｖ２Ｆ Ｖ２ＬＥＵ２ Ｖ２Ｄ；然后通过 Ｔａｑ
ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ 在 ３′末端加 Ａ。 ＰＣＲ 反应程序：９４
℃预变性 ２ ｍｉｎ；９８ ℃变性 ３０ ｓ，５８ ℃退火 ３０ ｓ，６８
℃延伸 １ ｍｉｎ１０ ｓ，３０ 个循环。 最后加入 １ μＬ Ｔａｑ
ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，７２ ℃延伸 ３０ ｍｉｎ。 扩增产物经琼
脂糖凝胶电泳割胶后，用胶回收试剂盒回收。
纯化后的融合 ＰＣＲ 产物，经 Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ 作
用连接到 ｐＵＣｍ Ｔ载体，通过蓝白斑进行筛选。 挑
选白色单菌落培养后，提取质粒，经双酶切及 ＰＣＲ
验证重组载体，并选取二者验证皆正确的重组载体
进行测序验证。
ＬＥＵ１Ｆ ＬＥＵ２ ＫａｎＭＸ６ ＬＥＵ１Ｄ 由于片段
较长，很难通过融合 ＰＣＲ进行连接，故先通过融合
ＰＣＲ 分别连接 ＬＥＵ１Ｆ ／ ＬＥＵ２、 ＫａｎＭＸ６ ／ ＬＥＵ２Ｄ。
然后通过酶切连接的方式依次将二者连接到载体
ｐＥＴ２８ａ上，再通过 ＰＣＲ 扩增，得到全长的目的
片段。
表 ２　 所使用的核苷酸序
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｐｒｉｍｅｒ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ
引物名称 核苷酸序列 ５′→３′
Ｒ１ｐ１ ＧＣＧＧＴＣＧＡＴＡＴＴＡＡＣＡＧＣＣＡＧ
Ｒ１ｐ２ ＧＡＧＣＡＴＧＡＧＡＧＧＣＡＧＴＧＴＴＧ
Ｒ１ｐ３ ＣＡＡＣＡＣＴＧＣＣＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＣＣ⁃ＣＴＡＡＧＡＡＧＡＴＣＧ
Ｒ１ｐ４ ＧＣＴＣＴＡＴＣＣＴＴＧＧＴＧＧＧＧＣＴＣＣＣＴＧＴＡＴＴＣＣ⁃ＴＴＴＡＣＴＡＴＣＣＴＣＣ
Ｒ１ｐ５ ＧＡＧＣＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＴＡＧＡＧＣ
Ｒ１ｐ６ ＴＣＡＴＡＣＡＡＡＧＴＣＡＴＣＴＡＧＴＡ ＡＧ
Ｒ２ｐ１ ＡＴＧＡＧＴＧＴＴＧＡＴＴＴＧＴＴＴＣＣ
Ｒ２ｐ２ ＣＴＧＴＡＧＣＴＡＣＴＴＧＡＡＧＴＴＧＡＴＴＣＡＧ
Ｒ２ｐ３ ＣＴＧＡＡＴＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＴＡＧＣＴＡＣＡＧＡＴＧＴＣ⁃ＴＧＣＣＣＣＴＡＡＧＡＡＧＡＴＣＧ
Ｒ２ｐ４ ＣＴＡＴＣＡＡＴＣＴＣＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＣＣＴＧＴＡＴＴＣ⁃ＣＴＴＴＡＣＴＡＴＣＣＴＣＣ
Ｒ２ｐ５ ＡＣＣＴＴＧＧＴＧＣＧＡＧＡＴＴＧＡＴＡＧ
Ｒ２ｐ６ ＣＴＴＡＡＣＴＧＴＴＴＧＣＴＡＧＣＴＡＣＣ
Ｖｐ１ ＡＴＡＣＧＧＴＣＡＧＴＧＧＴＧＴＧＡＡＣＧＧ
Ｖｐ２ ＧＡＣＣＴＣＴＧＧＣＡＡＴＧＧＡＧＴＴＣＡＴＴＧ
Ｖｐ３ ＣＡＡＴＧＡＡＣＴＣＣＡＴＴＧＣＣＡＧＡＧＧＴＣＡＴ⁃ＧＴＣＴＧＣＣＣＣＴＡＡＧＡＡＧＡＴＣＧ
Ｖｐ４ ＧＧＣＡＡＧＡＣＧＴＴＧＡＴＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＴＧＴ⁃ＡＴＴＣＣＴＴＴＡＣＴＡＴＣＣＴＣＣ
Ｖｐ５ ＡＣＣＣＡＣＣＡＡＴＣＡＡＣＧＴＣＴＴＧＣＣ
Ｖｐ６ ＡＴＣＴＴＣＧＴＣＧＧＣＡＴＣＧＴＣＴＣＴＧＧＣ
Ｌｐ１ ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧ
１ＡＣＡＣＴＣＣＡＴＣＣＡＡＧＧＧＴ⁃
ＣＣＡＡＧ
Ｌｐ２ ＡＣＣＡＡＡＧＧＣＡＣＣＧＴＧＡＧＴＡＧＡＧＧ
Ｌｐ３ ＣＣＴＣＴＡＣＴＣＡＣＧＧＴＧＣＣＴＴＴＧＧＴＡＴＧＴＣＴＧＣ⁃ＣＣＣＴＡＡＧＡＡＧＡＴＣＧ
Ｌｐ４ ＣＧＣＧＧＡＴＣＣ
２ＣＣＴＧＴＡＴＴＣＣＴＴＴＡＣＴＡＴＣＣＴ⁃
ＣＣ
Ｌｐ５ ＣＧＣＧＧＡＴＣＣ２ＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧＣＣＣＡＧＡＡＴＡＣＣＣ
Ｌｐ６ ＣＡＧＣＴＴＣＣＣＴＣＣＡＡＧＧＴＴＣＡＡＣＣＡＧＴＡＴＡＧ⁃ＣＧＡＣＣＡＧＣＡＴＴＣＡＣ
Ｌｐ７ ＧＴＴＧＡＡＣＣＴＴＧＧＡＧＧＧＡＡＧＣＴＧ
Ｌｐ８ ＣＣＧＣＴＣＧＡＧ３ＧＡＴＣＣＡＣＣＴＴＣＣＡＡＧＡＡＴＧＡＧ
　 注：１、２、３分别为 Ｎｄｅ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ酶切位点。
１􀆰 ２􀆰 ３　 酿酒酵母 ＢＹ４７４２感受态细胞的制备
酿酒酵母 ＢＹ４７４２感受态细胞的制备参照文献
［１２］。
１􀆰 ２􀆰 ４　 目的基因的转化及其筛选
参照文献［１５］的方法将目的基因分别转化酿
３５　 第 ２期 高堂杰等：Ｌｅｕ１ｐ参与调节 Ｖ ＡＴＰ 酶的活性
酒酵母 ＢＹ４７４２，重组菌株通过 ＳＤ Ｌｅｕ培养基或含
２００ μｇ ／ ｍＬ Ｇ４１８的 ＹＰＤ培养基进行筛选。
挑取上述转化后长出的单菌落于 １０ ｍＬ ＳＤ
Ｌｅｕ 培养基中，过夜培养 １８ ～ ２０ ｈ，提取基因组
ＤＮＡ，以其为模板进行 ＰＣＲ验证。
１􀆰 ２􀆰 ５　 酿酒酵母 ＢＹ４７４２重组菌不同 ｐＨ培养基中
生长差异的研究
分别挑取酿酒酵母 ＢＹ４７４２ 及各重组菌株单菌
落接种于 ５０ ｍＬ 的 ＹＰＤ 液体培养基中过夜培养
１６～１８ ｈ，用分光光度计测其吸光度 ＯＤ６００，取少量
菌液稀释至相同 ＯＤ值，按 １％的接种量接种至 １００
ｍＬ的 ＹＰＤ液体培养基中（３ 个平行样），于 ３０ ℃、
２００ ｒ ／ ｍｉｎ摇床培养，每隔 ２ ｈ 取样测其 ＯＤ６００，直至
３６ ｈ，并测培养结束时的菌液 ｐＨ，绘制生长曲线。
１􀆰 ２􀆰 ６　 重组菌株对 ＣａＣｌ２ 的耐受性研究
分别挑取酿酒酵母 ＢＹ４７４２ 及各重组酿酒酵母
单菌落接种于 ５０ ｍＬ 的 ＹＰＤ 液体培养基中过夜培
养 １６～１８ ｈ，用分光光度计测其 ＯＤ６００，取少量菌液
稀释至相同 ＯＤ 后，按梯度 １、１０－１和 １０－２取相同量
的菌液分别涂布于 ｐＨ 为 ５􀆰 ５、７􀆰 ５ 含 １００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
ＣａＣｌ２的 ＹＰＤ固体培养基上（各 ３ 个平行），同时接
种相同菌液至不含 ＣａＣｌ２的培养基作为对照，３０ ℃
恒温培养 ３～５ ｄ。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 通过融合 ＰＣＲ获取重组基因
按照 １􀆰 ２􀆰 ２ 节的方法分别扩增各待融合的
ＤＮＡ片段。 各片段的理论大小如表 ３ 所示；ＰＣＲ产
物的电泳检测如图 ２所示。
表 ３　 各基因片段的理论大小
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｓｉｚｅ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ
待融合片段 大小 ／ ｂｐ
Ｒ１Ｆ＋Ｒ１ＬＥＵ２＋Ｒ１Ｄ ４８１＋１ ３０８＋４４５
Ｒ２Ｆ＋Ｒ２ＬＥＵ２＋Ｒ２Ｄ ４３６＋１ ３１３＋３６３
Ｖ２Ｆ＋Ｖ２ＬＥＵ２＋Ｖ２Ｄ ４１７＋１ ３１３＋３７７
ＬＥＵ１Ｆ＋ＬＥＵ２＋ＫａｎＭＸ６＋ＬＥＵ１Ｄ ４５９＋１ ４００＋１ ３８８＋４４６
按照 １􀆰 ２􀆰 ２节的方法通过融合 ＰＣＲ扩增各重组
ＤＮＡ片段：Ｒ１Ｆ Ｒ１ＬＥＵ２ Ｒ１Ｄ、Ｒ２Ｆ Ｒ２ＬＥＵ２
Ｒ２Ｄ、Ｖ２Ｆ Ｖ２ＬＥＵ２ Ｖ２Ｄ、ＬＥＵ１Ｆ ＬＥＵ２、ＫａｎＭＸ６
ＬＥＵ２Ｄ，其结果分别如图 ３所示。
经融合 ＰＣＲ 所得到的目的基因经纯化后连接
Ｍ均为 １ｋｂ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；（ａ）：１～６分别为 Ｒ２Ｆ、Ｒ２ＬＥＵ２、
Ｒ２Ｄ、Ｒ１Ｆ、Ｒ１ＬＥＵ２、Ｒ１Ｄ；（ｂ）：１～４分别为 ＬＥＵ１Ｆ、ＬＥＵ２、
ＫａｎＭＸ６、ＬＥＵ１Ｄ；（ｃ）：１～３分别为 Ｖ２Ｆ、ＬＥＵ２、Ｖ２Ｄ
图 ２　 各待融合 ＤＮＡ片段 ＰＣＲ产物
Ｆｉｇ􀆰 ２　 ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｔｏ ｂｅ ｆｕｓｅｄ
Ｍ均为 １ ｋｂ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；（ａ）１—Ｒ１Ｆ、Ｒ１ＬＥＵ，２—Ｒ１Ｄ融合 ＰＣＲ产物
Ｒ１Ｆ Ｒ１ＬＥＵ２ Ｒ１Ｄ；（ｂ）１—Ｒ２Ｆ、Ｒ２ＬＥＵ２、Ｒ２Ｄ融合 ＰＣＲ产物
Ｒ２Ｆ Ｒ２ＬＥＵ２ Ｒ２Ｄ；（ｃ）１—Ｖ２Ｆ、 ＬＥＵ２、Ｖ２Ｄ融合 ＰＣＲ产物
Ｖ２Ｆ Ｖ２ＬＥＵ２ Ｖ２Ｄ；（ｄ）１、２分别为 ＬＥＵ１Ｆ与 ＬＥＵ２、ＫａｎＭＸ６与
ＬＥＵ１Ｄ的融合 ＰＣＲ产物 ＬＥＵ１Ｆ ＬＥＵ２及 ＫａｎＭＸ６ ＬＥＵ１Ｄ
图 ３　 经融合 ＰＣＲ所得到的目的基因
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｆｕｓｉｎｏｎ ＰＣＲ
到克隆载体进行克隆。 其中 Ｒ１Ｆ Ｒ１ＬＥＵ２ Ｒ１Ｄ、
Ｒ２Ｆ Ｒ２ＬＥＵ２ Ｒ２Ｄ及 Ｖ２Ｆ Ｖ２ＬＥＵ２ Ｖ２Ｄ经 ＴＡ
克隆连接到 ｐＵＣｍ Ｔ 载体上，分别命名为 ｐＵＣｍ
Ｔ Ｒ１、ｐＵＣｍ Ｔ Ｒ２、ｐＵＣｍ Ｔ Ｖ２；ＬＥＵ１Ｆ ＬＥＵ２
４５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
及 ＫａｎＭＸ６ ＬＥＵ１Ｄ，通过酶切连接的方式依次连接
到 ｐＥＴ ２８ａ载体上，命名重组载体为 ｐＥＴ２８ａ ＬＥＵ１，
从而可以通过 ＰＣＲ 得到完整的目的片段：ＬＥＵ１Ｆ
ＬＥＵ２ ＫａｎＭＸ６ ＬＥＵ１Ｄ。 连接好的重组载体分别
转化大肠杆菌 ＪＭ１０９感受态进行克隆。 重组克隆载
体经双酶切、ＰＣＲ及测序验证均正确。
２􀆰 ２　 目的基因转化酵母 ＢＹ４７４２及其验证
以上述构建的重组载体为模板，通过 ＰＣＲ分别
扩增各目的片段，经割胶回收纯化后，按 １􀆰 ２􀆰 ４ 节的
方法转化酵母 ＢＹ４７４２ 感受态细胞，筛选出目的菌
株，提取基因组 ＤＮＡ 进行 ＰＣＲ 验证，同时以酵母
ＢＹ４７４２的基因组 ＤＮＡ 为模板，进行 ＰＣＲ 对照，验
证结果分别如图 ４所示。
Ｍ均为 １ ｋｂ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；箭头所指条带分别为以各筛选到
的重组菌株基因组为模板进行 ＰＣＲ所得片段；
非箭头所指条带为采用相对应的引物并以 ＢＹ４７４２
基因组 ＤＮＡ为模板进行 ＰＣＲ所得片段
图 ４　 各重组菌株 ＰＣＲ验证
Ｆｉｇ􀆰 ４　 ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ
２􀆰 ３　 重组酵母菌株在不同 ｐＨ条件下的生长状况
图 ５ 为重组酵母菌株在 ｐＨ ５􀆰 ５ 条件下的生长
曲线。 由图 ５可知：在 ｐＨ 为 ５􀆰 ５ 的 ＹＰＤ 液体培养
基中，原始菌株及 ４株缺陷型重组菌（ ｒａｖ１Δ、ｒａｖ２Δ、
ｖｍａ２Δ和 ｌｅｕ１Δ）的生长曲线基本一致，在 １０ ｈ左右
进入对数生长期，１５ ｈ 左右进入稳定期，且菌密度
也基本一致。 这是因为酿酒酵母的最适生长 ｐＨ 为
５􀆰 ５左右，所以五者的生长趋势基本一致。
图 ５　 酵母 ＢＹ４７４２及其各重组菌在 ｐＨ为 ５􀆰 ５的
ＹＰＤ液体培养基中的生长曲线
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ＢＹ４７４２ ａｎｄ ｔｈｅ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ＹＰＤ
ｍｅｄｉｕ（ｐＨ＝５􀆰 ５）
图 ６ 为重组酵母菌株在 ｐＨ ７􀆰 ５ 条件下的生长
曲线。 由图 ６可知：在 ｐＨ 为 ７􀆰 ５ 的培养基中，原始
菌株及 ４ 株缺陷型重组菌（ ｒａｖ１Δ、ｒａｖ２Δ、ｖｍａ２Δ 和
ｌｅｕ１Δ）均在 １３ ｈ左右开始进入对数生长期，但是原
菌 ＢＹ４７４２生长迅速，较快达到稳定期，而缺陷型重
组菌生长缓慢，直到 ２５ ｈ 左右才达到稳定生长期，
且菌密度相较于原始菌要低，尤以 Ｖｍａ２ 缺陷型菌
株生长最为缓慢，其稳定期的菌密度最低，ＯＤ６００只
达到 ３􀆰 ８左右。
图 ６　 酵母 ＢＹ４７４２及其各重组菌在 ｐＨ为 ７􀆰 ５的
ＹＰＤ液体培养基中的生长曲线
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ＢＹ４７４２ ａｎｄ ｔｈｅ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ＹＰＤ
ｍｅｄｉｕ（ｐＨ＝７􀆰 ５）
同时，在培养结束时测得的 ｐＨ显示，在 ｐＨ ５􀆰 ５
的培养基中，最终的 ｐＨ 变化不大，均在 ５􀆰 ３ 左右；
在 ｐＨ ７􀆰 ５的培养基中，原始菌株及 ４株缺陷型重组
菌（ ｒａｖ１Δ、 ｒａｖ２Δ、 ｖｍａ２Δ 和 ｌｅｕ１Δ）的 ｐＨ 分别为
５􀆰 ６、６􀆰 ４、６􀆰 ２、６􀆰 ９ 和 ６􀆰 ５。 由此可见，Ｒａｖ１、Ｒａｖ２、
Ｖｍａ２、Ｌｅｕ１的敲除使得酵母菌对 ｐＨ 的调节受到了
严重阻碍，从而影响其生长。 同时，菌株生长及培
５５　 第 ２期 高堂杰等：Ｌｅｕ１ｐ参与调节 Ｖ ＡＴＰ 酶的活性
养基 ｐＨ的结果显示 Ｌｅｕ１ 的敲除所产生的影响与
Ｒａｖ１、Ｒａｖ２ 的敲除所产生的影响基本一致，而与
Ｖｍａ２ 的敲除有较大差别，这从一定程度上说明
Ｌｅｕ１ｐ通过与 ＲＡＶＥ 结合，参与对 Ｖ ＡＴＰ 酶的活
性调节，因为 Ｖｍａ２ 的缺失导致 Ｖ ＡＴＰ 酶完全不
能形成；而 ＲＡＶＥ 的缺失则只是使其组装严重受
阻，且活性下降。
２􀆰 ４　 重组酵母菌株对 ＣａＣｌ２的耐受性
按照 １􀆰 ２􀆰 ６ 节的方法将各菌液分别涂布于含
１００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＣａＣｌ２、ｐＨ ５􀆰 ５ 及 ７􀆰 ５ 的 ＹＰＤ 培养基
上，３０ ℃恒温培养 ３ ～ ５ ｄ，其结果如图 ７ 所示。 由
图 ７ 可知：在含 １００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＣａＣｌ２、ｐＨ 为 ５􀆰 ５ 的
ＹＰＤ 固体培养基中，酿酒酵母 ＢＹ４７４２ 的 Ｒａｖ１、
Ｒａｖ２、Ｖｍａ２ 及 Ｌｅｕ１ 的缺陷型菌株的生长受到了
极大抑制，相同菌量的涂布，其菌落数目要远远小
于酿酒酵母 ＢＹ４７４２，而四者之中，又以 Ｖｍａ２ 缺陷
型菌株的生长状况最差，这可能是由于缺少
Ｖｍａ２ｐ，导致 Ｖ ＡＴＰ 酶的 Ｖ１部分无法形成，不能
组装成为完整的 Ｖ ＡＴＰ 酶，从而失去了对 ＣａＣｌ２
及 ｐＨ的调控作用。 由图 ２ 可知，Ｌｅｕ１ 缺陷型菌株
的生长状况与 Ｒａｖ１、Ｒａｖ２ 缺陷型菌株的生长状况
基本一致，这从一个方面说明， Ｌｅｕ１ｐ 通过与
ＲＡＶＥ 结合，共同调节 Ｖ ＡＴＰ 酶的分离与集装，
从而起到调控其活性的作用，不过 Ｌｅｕ１ｐ 也有可
能通过其他途径影响菌株对 ＣａＣｌ２及 ｐＨ 的耐受
性，有待进一步的实验验证。
图 ７　 各重组菌株对 ＣａＣｌ２及 ｐＨ的耐受性
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｔｏ ＣａＣｌ２ ａｎｄ ｐＨ
　 　 Ｖ ＡＴＰ 酶的活性调节机制相当复杂。 普遍认
为 ＲＡＶＥ复合物在其调节机制中扮演重要角色，但
具体的调节机制尚不清楚。 ＲＡＶＥ 复合物主要由
Ｒａｖ１ｐ、Ｒａｖ２ｐ 和 Ｓｋｐ１ｐ 构成，与 Ｖ ＡＴＰ 酶的众多
亚基具有相互作用关系；同时由于 Ｓｋｐｌｐ 是组成
ＳＣＦ复合物的一个关键骨架蛋白，还能与其他众多
蛋白产生作用关系，故其调节机制可能还要受到其
他蛋白的影响。
３　 结论
Ｌｅｕ１ｐ 是笔者所在实验室最新发现的能与
ＲＡＶＥ相互结合的蛋白。 笔者通过融合 ＰＣＲ 及同
源重组的方法分别构建了酿酒酵母 ＢＹ４７４２ 的
Ｒａｖ１、Ｒａｖ２、 Ｖｍａ２ 和 Ｌｅｕ１ 的缺陷型菌株，研究
Ｌｅｕ１ｐ与 ＲＡＶＥ之间的相互功能关系。 上述结论表
明 Ｌｅｕ１ｐ对酿酒酵母 ＢＹ４７４２ 的 ｐＨ 及 ＣａＣｌ２ 耐受
性产生极大影响，且通过与重组菌株（ ｒａｖ１Δ、ｒａｖ２Δ、
ｖｍａ２Δ）的对照实验发现，ＲＡＶＥ 对 Ｖ ＡＴＰ 酶活性
的调节极有可能需要通过与 Ｌｅｕ１ｐ 结合才能得以
实现。
Ｖ ＡＴＰ 酶在生物体内的重要作用正越来越多
地受到人们的关注，随着研究的深入，解开 Ｖ ＡＴＰ
酶的活性调节机制，使其服务于医疗卫生已是新的
方向和热点。 本研究的发现为进一步研究 ＲＡＶＥ
与 Ｌｅｕ１ｐ的相互关系及其对 Ｖ ＡＴＰ 酶的活性调节
提供了重要依据。
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ＤＮＡ［Ｊ］ ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９７５，１２：３９⁃４４．
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ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｌｋａｌｉ ｃａｔｉｏｎｓ［ Ｊ］ ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９８３，１５３
（１）：１６３⁃１６８．
（责任编辑　 荀志金）
７５　 第 ２期 高堂杰等：Ｌｅｕ１ｐ参与调节 Ｖ ＡＴＰ 酶的活性