全 文 ：第 １２卷第 ５期
２０１４年 ９月
生 物 加 工 过 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ １２ Ｎｏ ５
Ｓｅｐ ２０１４
ｄｏｉ：１０ ３９６９ ／ ｊ ｉｓｓｎ １６７２－３６７８ ２０１４ ０５ ００６
收稿日期：２０１３－０４－１７
基金项目：高等学校博士学科点专项（２００８０２９５１０３６）；国家自然科学基金（３０８０００１８、３０９７００５８）；工业生物技术教育部重点实验室主任基金
（ＫＬＩＢ ＺＲ２００８０１）
作者简介：顾春银（１９８６—），男，江苏泰州人，硕士研究生，研究方向：蛋白修饰与纯化；张震宇（联系人），教授， Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｚｙ＠ ｊｉａｎｇｎａｎ．ｅｄｕ．ｃｎ
利用蛋白标签纯化酿酒酵母 ＲＡＶＥ Ｖ１复合物
顾春银，张震宇
（江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 ２１４１２２）
摘 要：ＲＡＶＥ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｈ＋ ⁃ＡＴＰａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｃｕｏｌａｒ ａｎｄ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）是调节液泡 ＡＴＰ 酶（Ｖ ＡＴＰ 酶）
装配与拆卸过程的调节酶，由 Ｒａｖ１ｐ、Ｒａｖ２ｐ和 Ｓｋｐ１ｐ ３个亚基构成。 在酿酒酵母细胞中，当葡萄糖耗尽时，Ｖ ＡＴＰ
酶分解成 Ｖ１、Ｖ０两部分，此时，ＲＡＶＥ与 Ｖ１以复合物的形式存在于细胞质中。 本研究利用同源重组技术，构建在基
因 ＲＡＶ２的 ３′端定点插入 ＦＬＡＧ标签的重组菌株 ＢＹ４７４２ ＲＡＶ２ ＦＬＡＧ，通过亲和层析原理纯化 ＲＡＶＥ Ｖ１复合物，
为后续利用电子显微镜对其进行三维结构研究奠定坚实的基础。 结果表明：ＦＬＡＧ标签添加到 Ｒａｖ２ｐ 的 Ｃ 端可以
成功纯化出 ＲＡＶＥ Ｖ１复合物；结合质谱鉴定首次发现了 Ｌｅｕ１ｐ与 ＲＡＶＥ存在相互作用关系，这使得对 ＲＡＶＥ的研
究转向一个全新的方向；此外，本研究方案对其他调节蛋白及与之相互作用的蛋白组的分离纯化具有借鉴意义。
关键词：酿酒酵母；Ｖ ＡＴＰ 酶；亲和层析；同源重组；蛋白标签
中图分类号：Ｑ２９１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０５－００３４－０５
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＡＶＥ⁃Ｖ１ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｒｏｍ
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｖｉａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｇｇｉｎｇ
ＧＵ Ｃｈｕｎｙｉｎ，ＺＨＡＮＧ Ｚｈｅｎｙｕ
（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｏｎ⁃ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ ＡＴＰａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｖａｃｕｏｌａｒ ａｎｄ Ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ
（ＲＡＶＥ），ｉｓ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｖａｃｕｏｌａｒ ｐｒｏｔｏｎ⁃ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ ＡＴＰａｓｅｓ． Ｉｎ
ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌｓ， ｗｈｅｎ ｇｌｕｃｏｓｅ ｗａｓ ｅｘｈａｕｓｔｅｄ， ｔｈｅ Ｖ⁃ＡＴＰａｓｅ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｅｄ ｉｎｔｏ Ｖ１， Ｖ０， ａｎｄ ｔｈｅ ＲＡＶＥ
ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ Ｖ１ ｔｏ ｆｏｒｍ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ． Ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， ＲＡＶＥ⁃Ｖ１
ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｄｄｉｎｇ ｔｈｅ ＦＬＡＧ ｔａｇｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｃ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｏｆ Ｒａｖ２ｐ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｅｌｅｃｔｒｏｎ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ⁃ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＲＡＶＥ⁃Ｖ１ ｃｏｍｐｌｅｘ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｄｄｉｎｇ
ＦＬＡＧ ｔａｇ ｔｏ ｔｈｅ Ｃ ｅｎｄ ｏｆ Ｒａｖ２ｐ ｃｏｕｌｄ ｐｕｒｉｆｙ ＲＡＶＥ⁃Ｖ１ ｃｏｍｐｌｅｘ． Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ
ｂｅｔｗｅｅｎ Ｌｅｕ１ｐ ｗｉｔｈ ＲＡＶＥ ｗａｓ ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ｗｈｉｃｈ ｍａｄｅ ｔｈｅ ＲＡＶＥ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｏ
ａ ｎｅｗ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ； Ｖ⁃ＡＴＰａｓｅ； ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ； ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ；
ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｇ
液泡 ＡＴＰ 酶 （ｖａｃｕｏｌａｒ⁃ＡＴＰａｓｅｓ）广泛存在真核
生物细胞的内涵体、溶酶体和高尔基体等内膜系统
上，在维持细胞特定的酸性环境中起着核心作
用［１－４］。 此外，在许多正常的生理代谢过程中，它起
着关键的作用，如调节液泡的分裂与融合［５］、神经
递质的分泌［６］、细胞的胞饮与分泌、出芽与裂
殖［７－９］。 近年来，发现液泡 ＡＴＰ 酶与病毒感染、癌症
和老年痴呆症等疾病有关，其可能作为治疗相关疾
病的新药物靶点［１０－１２］。 目前，有关酿酒酵母液泡
Ｖ ＡＴＰ酶的研究最为深入［１３－１６］，酿酒酵母液泡
ＡＴＰ 酶由多亚基的 Ｖ１和 Ｖ０构成，亲水性 Ｖ１部分由
Ａ３、Ｂ３、Ｃ、Ｄ、Ｅ３、Ｆ、Ｇ３和 Ｈ 共 ８ 种亚基构成，暴露在
膜表面，水解 ＡＴＰ 为质子的转移提供能量；疏水性
的 Ｖ０由 ａ 、ｄ、ｅ、ｃ、ｃ′和 ｃ′′ ６ 种亚基构成，是定向泵
动质子的场所。
２００１年，研究者发现调节液泡 ＡＴＰ 酶活性的复
合物，并命名为 ＲＡＶＥ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｈ＋ ⁃ＡＴＰａｓｅ ｏｆ
ｔｈｅ ｖａｃｕｏｌａｒ ａｎｄ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ） ［１７］，由 Ｒａｖ１ｐ
（１ ５５×１０５）、Ｒａｖ２ｐ（４ ０×１０４）、Ｓｋｐ１ｐ（２ ２×１０４） ３
个亚基构成，参与 Ｖ１、Ｖ０的分离与组装过程，从而调
节液泡 ＡＴＰ 酶的活性［１８－２１］。 在 ＲＡＶＥ 参与 Ｖ１（除
Ｃ亚基）、Ｖ０、Ｖｍａ５ｐ（Ｃ亚基）组装过程中，Ｒａｖ１ｐ 结
合 Ｖ１部分的 Ｖｍａ４ｐ（Ｅ亚基）或 Ｖｍａ１０ｐ（Ｇ 亚基），
起运输 Ｖ１的作用［４］；Ｒａｖ２ｐ 结合 Ｃ 亚基，起运输 Ｃ
亚基的作用［２２］；当组装完成后，Ｓｋｐ１ｐ 促使 ＲＡＶＥ
从细胞膜上脱离，进入下一次循环过程［２３］。
目前，研究 ＲＡＶＥ与 Ｖ１的互相作用关系仍处在
通过酵母双杂交体系实验验证的阶段，ＲＡＶＥ Ｖ１
复合物的结构直接可以从分子水平阐述其互相作
用的机制。 但是，由于 ＲＡＶＥ 由多亚基组成，其中
Ｒａｖ１ｐ 相对分子质量较大且易降解，这使得从大肠
杆菌中表达纯化 ＲＡＶＥ 变得非常困难。 为此，本研
究通过在 Ｒａｖ２ｐ的 Ｃ 端标记 ＦＬＡＧ 标签，直接从对
野生型菌株改造后的酿酒酵母菌株 ＢＹ４７４２ ＲＡＶ２
ＦＬＡＧ细胞中纯化 ＲＡＶＥ Ｖ１复合物，以期为电镜研
究其结构及在分子水平上解释液泡 ＡＴＰ 酶的调节
机制打下坚实的基础，也为其他类似调控酶研究提
供了值得借鉴的纯化方案。
１ 材料与方法
１ １ 材料
１ １ １ 菌种
本研究中涉及的 ２ 种酿酒酵母：酿酒酵母
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＢＹ４７４２ 为江南大学食品
科学国家重点实验室史峰老师惠赠；酿酒酵母
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＳＦ８３８ ５Ａ ＲＡＶ１ Ｍｙｃ１３
为纽约州立大学医学院分子生物学与生物化学部
Ｐａｔｒｉｃｉａ Ｍ Ｋａｎｅ教授惠赠。
１ １ ２ 实验试剂
Ｐｆｕ ＤＮＡ 聚合酶、ｄＮＴＰｓ、ＳＤＳ、Ｔｒｉｓ、溴化乙啶、
β 巯基乙醇、琼脂糖 Ｍ、ＤＮＡ凝胶回收试剂盒、ＰＣＲ
产物纯化试剂盒、卡那霉素（Ｇ４１８ 硫酸盐），ＢＢＩ 公
司；辣根过氧化氢酶显色试剂盒、合成引物，上海生
工生物工程公司；１ ｋｂ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ Ｍａｒｋｅｒ，大连宝
生物公司；ＰａｇｅＲｕｌｅｒＴＭ预染色标准蛋白质，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ
公司；Ｌｙｔｉｃａｓｅ酵母破壁酶、ａｎｔｉ⁃ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｇｅｌ
与 ＦＬＡＧ ｐｅｐｔｉｄｅ， Ｓｉｇｍａ⁃Ａｌｄｒｉｃｈ 公 司； ０ ４５ μｍ
ＰＶＤＦ蛋白吸附膜，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ 公司；来源于小鼠的
ａｎｔｉ⁃ＦＬＡＧ单克隆抗体与 ＨＲＰ 标记的山羊抗小鼠免
疫球蛋白，Ｅａｒｔｈ ＯＸ；其他所有所涉及的试剂购自国
药集团有限公司。
１ ２ 方法
１ ２ １ 构建同源重组片段（ ＲＡＶ２ Ｆ ＫＡＮ Ｈ）
利用同源重组构建 ＦＬＡＧ标签标记 Ｒａｖ２ｐ 的 Ｃ
末端的重组菌株 Ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ４７４２ ＲＡＶ２ ＦＬＡＧ。
同源重组片段由 ３ 个片段构成，分别命名为
ＲＡＶ２ Ｆ、ＫＡＮ（ＫＡＮＭＸ６ 卡那霉素抗性基因）、Ｈ
（ＲＡＶ２下游同源片段，４０５ ｂｐ），其中 ＲＡＶ２ Ｆ 为
编码 Ｒａｖ２ｐ 氨基酸残基序列 ２３２ ～ ３５１ 与 ＦＬＡＧ 的
基因序列。 以酿酒酵母 ＢＹ４７４２ 基因组为模板，通
过引物 ＹＣＲ２ １：５′ ＧＧＴＧＡＣＴＡＡＡＡＡＡＣＣＴＴＧ⁃
Ｇ ３′和 ＹＣＲ２ ２：５′ ＴＴＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴ⁃
ＴＧＴＡＧＴＣＣＴＴＡＴＡＴＧＴＡＣＴＴＡＡＣＴＧＴＴＴＧＣＴＡ ３′扩
增 ＲＡＶ２ Ｆ，引物 ＹＣＲ２ ５：５′ ＴＣＴＡＣＴＡＧＣＧＡ⁃
ＴＡＡＣＡＴＴＡＡＣＡ ３′、ＹＣＲ２ ６ ：５′ ＡＴＴＡＧＡＴＴＴＧ⁃
ＡＴＴＧＡＡＧＡＧ ３′扩增 Ｈ 片段，产物用琼脂糖凝胶
电泳分离并切胶回收；以酿酒酵母 ＳＦ８３８ ５Ａ ＲＡＶ１
Ｍｙｃ１３基因组为模板，通过引物 ＹＣＲ２ ３ ：５′ ＧＡＣＴ⁃
ＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＴＡＡＡＡＴＴＴＣＴＴＡＴＧ⁃
ＡＴＴＴＡＴＧＡＴＴＴＴＴＡ ３′、ＹＣＲ２ ４：５′ ＴＧＴＴＡＡＴＧＴ⁃
ＴＡＴＣＧＣＴＡＧＴＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＡＡＡ ３′
扩增中间片段 ＫＡＮ，产物用琼脂糖凝胶电泳分离并
切胶回收；以 ３ 个片段的胶回收产物为模板（均为
０ ５～１ ｍｇ ／ ｍＬ），通过引物 ＹＣＲ２ １、ＹＣＲ２ ６ 来融
合这 ３ 个片段，形成 １ 条完整的同源重组片段
ＲＡＶ２ Ｆ ＫＡＮ Ｈ。 ＰＣＲ反应结束后将融合产物
５３ 第 ５期 顾春银等：利用蛋白标签纯化酿酒酵母 ＲＡＶＥ Ｖ１复合物
跑琼脂糖凝胶电泳分离，并切胶回收得到同源重组
片段 ＲＡＶ２ Ｆ ＫＡＮ Ｈ。
１ ２ ２ 酿酒酵母感受态的制备
从酵母膏胨葡萄糖（ＹＰＤ）培养基（２０ ｇ ／ Ｌ 蛋白
胨，１０ ｇ ／ Ｌ 酵母膏，２０ ｇ ／ Ｌ 葡萄糖，ｐＨ ６ ０）加 ２０
ｇ ／ Ｌ 琼脂粉的固体培养基上挑取酿酒酵母 ＢＹ４７４２
单菌落，接种于 ３０ ｍＬ 的 ＹＰＤ 液体培养基中，３０
℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ过夜培养至 ＯＤ６００≈２。 在 ４ ℃、３ ０００
ｒ ／ ｍｉｎ条件下离心 ５ ｍｉｎ收集细胞，用 ２５ ｍＬ 无菌水
洗涤后再离心收集细胞。 用 １ ｍＬ 醋酸锂 （ ０ １
ｍｏｌ ／ Ｌ）重悬细胞后转移至 １ ５ ｍＬ 离心管 ６ ０００
ｒ ／ ｍｉｎ离心 ５ ｓ 弃上清，加 ５００ μＬ 醋酸锂 （ ０ １
ｍｏｌ ／ Ｌ）轻轻混匀，取 ５０ μＬ悬液分装于 １ ５ ｍＬ试管
中备用。
１ ２ ３ 转化与筛选
取 ５０ μＬ酿酒酵母感受态细胞悬液 ６ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ
离心 ５ ｓ 弃上清，加入 ５０ μＬ ＰＥＧ４０００（质量分数
５０％）、３６ μＬ 醋酸锂 （ １ ｍｏｌ ／ Ｌ ）、 ＳＳ ＤＮＡ （ ５
ｍｇ ／ ｍＬ）、１０ μＬ融合产物（０ ５ μｇ ／ μＬ），剧烈振荡 １
ｍｉｎ；在 ３０ ℃孵育 ３０ ｍｉｎ 后 ４２ ℃热休克 ２０ ｍｉｎ，
６ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １５ ｓ去上清，重悬细胞后转移至装
有 ５ ｍＬ ＹＰＤ 液体培养基的试管中在 ３０ ℃、２００
ｒ ／ ｍｉｎ培养 ３ ～ ４ ｈ；６ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ ｓ 去上清，加
５００ μＬ 双蒸水重悬，取 ２００ μＬ涂布于含 Ｇ４１８（２００
μｇ ／ ｍＬ）的 ＹＰＤ固体培养基上，在 ３０ ℃培养箱中培
养 ２～３ ｄ［２４］。 验证同源重组片段是否整合进酿酒
酵母 ＢＹ４７４２的基因组，从抗性 ＹＰＤ 固体培养基上
挑取单菌落，接种于 ５ ｍＬ ＹＰＤ 液体培养基，在 ３０
℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ 条件下培养至 ＯＤ６００≈３，提取重组菌
株的基因组。 以重组菌株基因组为模板，通过测序
引物 ＣＲ２ １：５′ ＣＴＴＴＧＴＡＧＧＡＡＴＧＡＧＣＴＴＴＧＣ
３′、ＣＲ２ ２：５′ ＡＧＴＴＣＣＣＧＡＡＴＡＴＧＡＴＧＴＴＧ ３′来
扩增外源基因，根据 ＰＣＲ产物的测序结果筛选阳性
克隆菌株，命名为 Ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ４７４２ ＲＡＶ２ ＦＬＡＧ。
１ ２ ４ 从重组菌株纯化 ＲＡＶＥ Ｖ１复合物
从重组菌株 ＢＹ４７４２ ＲＡＶ２ ＦＬＡＧ细胞中纯化
ＲＡＶＥ Ｖ１复合物。 重组菌株接种于 ５０ ｍＬ ＹＰＤ种
子培养液上，在 ３０ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ 条件下，培养至
ＯＤ６００≈１，转接种子培养液至装有 １ Ｌ ＹＰＤ 液体培
养基的 ３ Ｌ三角烧瓶（共 ８ 瓶），在 ３０ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ
条件下过夜培养至饱和。 在 ８ ０００ ｇ、４ ℃离心 ５ ｍｉｎ
收集细胞， 用 ＴＢＳＥ （ ５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ、 １５０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ、 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＥＤＴＡ，ｐＨ ７ ４）洗涤后重
悬细胞，高压匀浆机在 １７２ ４ ＭＰａ破碎细胞，添加苯
甲基磺酰氟蛋白抑制剂，细胞裂解液在 ２０ ０００ ｇ、
４ ℃下离心 ２０ ｍｉｎ取上清液。 上清液过 １ ｍＬ ａｎｔｉ
ＦＬＡＧ Ｍ２ 凝胶填充柱后用 ２０ 倍柱体积 ＴＢＳＥ 洗去
非特异性结合蛋白，再用 ５ 倍柱体积的洗脱液（含
１００ μｇ ／ ｍＬ ＦＬＡＧ 多肽的 ＴＢＳＥ）洗脱得到 ＲＡＶＥ
Ｖ１复合物。
１ ２ ５ 免疫印迹验证（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）
将纯化的 ＲＡＶＥ复合物 ＳＤＳ ＰＡＧＥ 分析后电
转使蛋白转移至 ０ ４５ μｍ 的 ＰＶＤＦ 膜，用 ＴＢＳ （１０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ、１５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ，ｐＨ ７ ４）洗涤 ３
次，每次 ５ ｍｉｎ，在室温用封闭液（１０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ⁃
ＨＣｌ、１５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ，ｐＨ ７ ４；０ １ ｇ ／ Ｌ Ｔｗｅｅｎ ２０，
３０ ｇ ／ Ｌ 牛血清蛋白）封闭 ２ ｈ；然后，在 ４ ℃用 １ ∶
２ ０００稀释的抗 ＦＬＡＧ 标签单克隆抗体缓冲液孵育
过夜；用 ＴＢＳＴ （ １０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ、 １５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
ＮａＣｌ，ｐＨ ７ ４；０ １ ｇ ／ Ｌ Ｔｗｅｅｎ ２０）洗 ３ 次，每次 １０
ｍｉｎ；在室温下与山羊抗小鼠的多克隆抗体缓冲液孵
育 １ ｈ；最终，ＴＢＳＴ洗 ３次，每次 １０ ｍｉｎ，用辣根过氧
化氢酶显示试剂盒显色。
１ ２ ６ 质谱蛋白鉴定
质谱仪器与操作系统均为 Ｂｒｕｋｅｒ 公司的
ＦＬＥＸＴＭ系列。 将 ＲＡＶＥ复合物的 ＳＤＳ ＰＡＧＥ 电泳
结果，用手术刀片切下胶上目标条带，置于 ＥＰ 管中
（胶块切成约 １ ｍｍ３大小），同时切下空的胶块作对
照；加入 ４００ μＬ（１００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮＨ４ＨＣＯ３ ／ ３０％乙腈
（ＡＣＮ）洗脱液脱色，清洗至透明，去除上清，冻干；
每管加入 ９０ μＬ １００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮＨ４ＨＣＯ３、１０ μＬ １００
ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＤＴＴ，５６ ℃孵化 ３０ ｍｉｎ，还原蛋白质；去上
清，每管加 ５０ μＬ １００％ ＡＣＮ，５ ｍｉｎ后吸去；加入 ５０
μＬ １００％ ＡＣＮ，５ ｍｉｎ后吸去，吹干；吹干后，各加入
５ μＬ １０ ｎｇ ／ μＬ 胰蛋白酶溶液，置于 ４℃ 冰箱 ６０
ｍｉｎ，使胶块充分吸胀；再加入 ３０ μＬ ２５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
ＮＨ４ＨＣＯ３缓冲液，ｐＨ ７ ８ ～ ８ ０；３７ ℃反应过夜后，
吸出酶解液，转移至新 ＥＰ 管中，冻干；向离心管底
部各加入 ２ ５ μＬ ＡＣＮ与 ０ １％ 三氟乙酸（ＴＦＡ），振
荡后离心；样品取 １ ５ μＬ点样，同时取 １ μＬ标准品
点样，室温吹干后，每孔上 ０ ７ μＬ α 氰基 ４ 羟基
肉桂酸（ＣＨＣＡ，５００ ｎｇ）；最终进行分析。
２ 结果与讨论
２ １ Ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ４７４２ ＲＡＶ２ ＦＬＡＧ 的构建与
筛选
利用 ＰＣＲ技术扩增 ＲＡＶ２ Ｆ、ＫＡＮ、Ｈ ３ 个片
６３ 生 物 加 工 过 程 第 １２卷
段， ＰＣＲ产物进行凝胶电泳，结果见图 １。 将图 １
（ａ）中泳道 １、２、３ 分别切胶回收作为模板，以引物
ＹＣＲ２ １、ＹＣＲ２ ６ 进行融合 ＰＣＲ 扩增，得到 １ 个
完整的同源重组片段，电泳结果如图 １（ｂ）所示。 将
重组片段按 １ ２ ３ 所述步骤转化进酿酒酵母
ＢＹ４７４２中，用含 Ｇ４１８的 ＹＰＤ固体培养基筛选重组
菌株。 从培养基上挑取单菌落，扩大培养后提取基
因组，以基因组为模板，利用引物 ＣＲ２ １、ＣＲ２ ２
来扩增插入的重组片段，产物进行琼脂糖凝胶电
泳，如图 １（ｃ）。 将产物切胶回收，连接到 Ｔ 载体进
行测序，确定阳性克隆菌株基因序列无误，并命名
为 Ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ４７４２ ＲＡＶ２ ＦＬＡＧ。
图 １（ａ）：１为 ＲＡＶ２ Ｆ片段，２为 ＫＡＮ片段，
３为 Ｈ片段；图 １（ｂ）：１为 ＲＡＶ２ Ｆ ＫＡＮ Ｈ片段；
图 １（ｃ）：１为插入的重组片段，Ｍ均为 １ ｋｂ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ Ｍａｒｋｅｒ
图 １ Ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ４７４２ ＲＡＶ２ ＦＬＡＧ的构建与筛选
Ｆｉｇ １ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＢＹ４７４２ ＲＡＶ２⁃ＦＬＡＧ
２ ２ ＲＡＶＥ Ｖ１复合物的纯化
将重组菌株 Ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ４７４２ ＲＡＶ２ ＦＬＡＧ
大规模培养后离心收集菌体，湿重约为 ７０ ｇ。 细胞
破碎处理后，上清液过 １ ｍＬ 抗 ＦＬＡＧ 凝胶柱后用
２０倍柱体积 ＴＢＳＥ 洗去非特异性结合蛋白；每次用
１ ｍＬ 体积的洗脱液（含 １００ μｇ ／ ｍＬ ＦＬＡＧ 多肽的
ＴＢＳＥ）洗脱，重复 ５次，得到 ５管 ＲＡＶＥ Ｖ１复合物，
标记为 １ ～ ５ 号；分别取 ２０ μＬ 样品加 ５ μＬ ５ ×
ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ 进行 ＳＤＳ ＰＡＧＥ 分析，结果见图 ２。
由图 ２ 可知：２、３ 号中蛋白的浓度明显高于其他几
份洗脱液，丙烯酰胺凝胶中同样出现了条带 Ｖｍａ１ｐ
（Ａ亚基）、Ｖｍａ２ｐ （Ｂ 亚基），此外还出现了 Ｖｍａ４ｐ
（Ｅ亚基）、Ｖｍａ８ｐ （Ｄ 亚基）。 由此可见：当 ＦＬＡＧ
添加到 ＲＡＶＥ的 Ｒａｖ２ｐ亚基的 Ｃ 端时，可以纯化得
到 ＲＡＶＥ Ｖ１复合物，细胞中 ＲＡＶＥ 的 ３ 个亚基的
浓度比较接近，说明细胞中单独存在的 Ｒａｖ２ｐ 的数
量较少；同样的出现了 Ｖｍａ１ｐ 及 Ｖｍａ２ｐ，说明添加
到 Ｒａｖ２ｐ亚基 Ｃ端的 ＦＬＡＧ标签不会影响 ＲＡＶＥ与
Ｖ１的相互作用。 纯化产物的凝胶电泳图 ２ 中在
９ ５×１０４附近都出现了 １ 条清晰的条带，与 Ｖ１部分
的其他亚基的大小都不一致，需要进一步做质谱鉴
定蛋白。
１－５为洗脱样品 １－５号；Ｍ为标准蛋白
图 ２ 纯化后 ＲＡＶＥ Ｖ１复合物的 ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析图
Ｆｉｇ ２ ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＲＡＶＥ⁃Ｖ１ ｃｏｍｐｌｅｘ
２ ３ 免疫印迹验证与质谱蛋白鉴定
取 ２０ μＬ图 ２ 中的泳道 ２ 号和 ３ 号样品，进行
ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析后，４ ℃、２００ ｍＡ、２ ５ ｈ，电转使蛋
白转移至 ＰＶＤＦ膜，封闭后分别与一抗和二抗孵育，
最后用用二氨基联苯胺（ＤＡＢ）作为底物，与带有辣
根过氧化氢酶的抗体结合反应，在过氧化氢存在的
条件下被还原，失去电子而形成浅棕色的不溶性产
物，结果如图 ３。 由图 ３ 可知：Ｒａｖ２ｐ 确实被标记上
ＦＬＡＧ，并且 Ｒａｖ２ｐ比较稳定，没有形成明显的降解
条带。
１为洗脱样品 ２号；２为洗脱样品 ３号；Ｍ为标准蛋白
图 ３ Ｒａｖ２ｐ ＦＬＡＧ融合蛋白的免疫印迹检测
Ｆｉｇ ３ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｆｏｒ ＲＡＶＥ Ｒａｖ２ｐ⁃ＦＬＡＧ
将图 ２中标记的 ８个条带取点进行质谱蛋白鉴
定，编号为①～⑧，将样品按 １ ２ ６ 中所述的步骤处
理后，点靶后将板装入仪器操作分析。 其中②号蛋
白的总离子流峰图见图 ４。 ①～⑧号蛋白经 Ｍａｓｃｏｔ
７３ 第 ５期 顾春银等：利用蛋白标签纯化酿酒酵母 ＲＡＶＥ Ｖ１复合物
搜索鉴定为 Ｒａｖ１ｐ、Ｌｅｕ１ｐ、Ｖｍａ１ｐ、Ｖｍａ２ｐ、Ｒａｖ２ｐ、
Ｖｍａ８ｐ、Ｖｍａ４ｐ和 Ｓｋｐ１ｐ，如表 １所示。 由表 １可知：
Ｌｅｕ１ｐ蛋白的出现是意料之外的发现，目前尚未有
报道显示 Ｌｅｕ１ｐ 可以与 ＲＡＶＥ 或 Ｖ１部分的任何亚
基具有相互作用的能力，这或许是关于 ＲＡＶＥ 研究
的一个新的发现。
图 ４ Ｌｅｕ１ｐ总离子流谱峰图
Ｆｉｇ ４ Ｔｏｔａｌ ｉｏｎ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｐｅｃｔｒｕｍ
ｐｅａｋ ｆｉｇｕｒｅ ｏｆ Ｌｅｕ１ｐ
表 １ 质谱鉴定结果
Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ
片断 相对分子质量 得分 匹配数 肽
１ １５６ ２９７ ２２３ ５（２） Ｒａｖ１ｐ
２ ８６ ３６８ １４６ ３（１） Ｌｅｕ１ｐ
３ １１９ ２４６ １８２ ３（２） Ｖｍａ１ｐ
４ ５７ ７７０ ２００ ４（０） Ｖｍａ２ｐ
５ ２７ ３８７ ７４ ２（１） Ｒａｖ２ｐ
６ ２７ ７７３ ２０３ ３（３） Ｖｍａ８ｐ
７ ２６ ４５１ １０３ ３（３） Ｖｍａ４ｐ
８ ２２ ３７４ １１０ ２（１） Ｓｋｐ１ｐ
３ 结 论
ＲＡＶＥ 复合物为液泡 ＡＴＰ 酶调节酶对细胞具
有重要的生理作用，但是在野生型菌株中其含量非
常低，加上其中 Ｒａｖ１ｐ 亚基很容易降解，这些因素
导致了对 ＲＡＶＥ的研究一直裹足不前。
本研究通过在 Ｒａｖ２ｐ亚基的 Ｃ 末端添加 ＦＬＡＧ
标签，从酿酒酵母细胞中成功纯化得到 ＲＡＶＥ Ｖ１
复合物，并且保证了其天然的结构，为深入研究
ＲＡＶＥ以及 ＲＡＶＥ Ｖ１复合物的结构与功能奠定了
基础。
根据质谱结果，利用 ＦＬＡＧ 标签从酿酒细胞破
碎液上清纯化的复合物包含 ＲＡＶＥ 复合物的 ３个亚
基，Ｖ１复合物的 ４ 个亚基及 Ｌｅｕ１ｐ。 ＲＡＶＥ 与 Ｖ１相
互作用早有文献报告，但 ＲＡＶＥ Ｖ１复合物与 Ｌｅｕ１ｐ
具有相互作用的能力未有文献报告，这促使后续的
研究方向偏向于和 ＲＡＶＥ 相关的蛋白组学领域
发展。
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（下转第 ６８页）
８３ 生 物 加 工 过 程 第 １２卷