全 文 ：第24卷 第6期
2012年6月
Vol. 24, No. 6
Jun., 2012
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2012)06-0521-05
表观遗传学新视点——DNA羟甲基化
王学静，黄　庆，黄君富，府伟灵*
(第三军医大学西南医院检验科，重庆 400038)
摘　要：5-羟甲基胞嘧啶 (5hmC)是新发现的一种的修饰碱基，以低水平存在于哺乳动物的多种细胞类型中。
5hmC是 10-11易位（TET)家族的酶通过氧化 5-甲基胞嘧啶 (5mC)产生的。5hmC不仅能够降低MeCP蛋
白的甲基化结合结构域 (MBD)与甲基化 DNA的亲和性，具有潜在的参与基因表达调控的转录调节功能，
而且参与了 DNA去甲基化过程。因此关于 5hmC的研究日益受到学者们的青睐，随着 5hmC甲基化分析和
检测方法学日益发展，发现 5hmC分布具有组织特异性，并且 5hmC在肿瘤组织中含量显著降低，可能成
为某些肿瘤早期诊断的分子标志物。
关键词：表观遗传学；DNA羟甲基化；肿瘤
中图分类号：Q344 文献标志码：A
A new sight of epigenetics—5-hydroxymethylcytosine
WANG Xue-Jing, HUANG Qing, HUANG Jun-Fu, FU Wei-Ling*
(Department of Laboratory Medicine, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
Abstract: 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) is a new modified base, and presents at low levels in diverse cell types
in mammals. 5hmC is generated by the TET(ten-eleven translocation, TET) family of enzymes through oxidation of
5-methylcytosine (5mC). 5hmC can decrease the affiliation between the methyl-CpG binding domain(MBD) of
methylcytosine binding proteins(MeCP) and methlated DNA, revealing it has the potential function of epigenetic
gene regulation. 5hmC also has been proposed as a potential intermediate in active DNA demethylation. Therefore,
5hmC has attracted increasing attention from researchers and more techniques and methods are used to detect
5hmC. Studies report that 5hmC differes in different tissues and is significantly decreased in tumor tissues, which
suggest it may be used as a useful molecular marker for tumor diagnosis.
Key words: epigenetics; 5-hydroxymethylcytosine; tumor
收稿日期：2012-03-22； 修回日期：2012-05-03
基金项目：国家自然科学基金项目(81071429, 8107-
1430)
*通信作者：E-mail：weilingfu@yahoo.com
甲基化胞嘧啶 (5-methylated cytosine, 5mC)被
称之为人类 DNA的第 5种碱基。已有的研究结果
表明，人类基因组 CpG岛 (CpG islands)的 5mC可
以通过影响染色质的结构与功能而影响相关基因
的表达水平，在发育与疾病发生过程中具有重要
作用 [1-4]。最近，研究者又在哺乳动物中发现了被
称之为 DNA第 6种碱基的一种表观遗传学新修饰，
即 5-羟甲基胞嘧啶 (5-hydroxymethylcytosine, 5hmC)。
目前，5hmC的生物学功能尚不是很清楚，但是，
初步研究结果表明，它在基因表达的调控过程中具
有较为重要的作用，正在成为当前表观遗传学领域
的研究热点之一 [5]。
1　5hmC研究的重要性
1.1　5hmC与5mC的相关性
DNA甲基化是在 DNA甲基化转移酶 (DNA
methytransferase, DNMT)的作用下，在基因 DNA
序列 CpG二核苷酸 (CpG dinucleotides，基因序列
中 5→ 3方向紧随相连的 CG碱基，即 5-CG-3)
的胞嘧啶 5-碳位共价键结合一个甲基基团 (methyl
∙ 技术与应用 ∙
生命科学 第24卷522
group, -CH3) 而形成 5mC[6]。5-hmC 是 5-mC 的羟
基化形式，1952年在噬菌体 DNA中首次发现 [7]。
5mC转变成 5hmC的关键酶是 10-11易位 (ten-eleven
translocation, TET)家族蛋白 [8]。TET蛋白具有加氧
酶 (dioxygenase)结构域，在铁离子 (Fe2+)与 α酮戊
二酸 (2-oxoglutarate, 2OG)存在的条件下，可以把
5mC氧化为 5hmC[9-10]。动物实验发现，在 DNMT1
或Np95/Uhrf1基因敲除的小鼠胚胎干细胞 (embryonic
stem, ES)中 5hmC含量显著少于野生型小鼠 ES细
胞，而在 DNMT1、DNMT3a及 DNMT3b三基因敲
除的小鼠 ES细胞中 5hmC几乎全部消失，提示并
证实了 5hmC来源于之前存在的 5mC[11-14]。
1.2　5hmC的生物学功能预测
自 1952年Wyatt 和 Cohen [7]在噬菌体 DNA中
首次发现 5hmC以来，5hmC的功能研究一直围绕
着它对于噬菌体 DNA的保护作用 [15]。直至最近，
研究者才发现它在人和小鼠大脑以及胚胎干细胞中
广泛存在，5hmC的功能研究也成为当前表观遗传
学领域的研究热点之一。5hmC的功能还知之甚少，
但普遍认为它参与了 DNA基因表达调控或去甲基
化 [16-17]。DNA甲基化所致相关基因沉默的机制之
一是甲基化胞嘧啶结合蛋白 (methylcytosine binding
proteins, MeCP)与甲基化 DNA结合并形成复合物，
该复合物诱导染色质组蛋白脱乙酰基 (deacetylation)
而导致染色质构象改变，最终抑制基因转录 [18-19]。
5hmC能够降低 MeCP蛋白的甲基化结合结构域
(methyl-CpG binding domain, MBD)与甲基化 DNA
的亲和性，提示 5hmC具有潜在的参与基因表达调
控的转录调节功能 [16, 20-22]。目前多个实验室报道了
5hmC与基因转录活性相关性研究结果，但结论不
一致：5hmC富含基因与其转录水平不相关 [12]、正
相关 [14, 23-24]或负相关 [13]。因此，5hmC水平与相关
基因转录活性之间的相关性还有待于进一步的研究
与证实。
另外，也有研究提示 5hmC是 DNA去甲基化
过程中的中间产物 [25-27]，但因缺乏直接证据未得以
证实。近来 Guo等 [17]研究发现，将 TET1转染到
细胞中进行表达，某些 5mC转化为了 5hmC，而
某些则逆转为普通的胞嘧啶 (cytosine, C)；将另一
种脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽 1 (apolipoprotein
B mRNA-editing enzyme-catalytic polypeptide-like 1,
APOBEC1)转染到细胞中表达时，发现脱甲基化过
程得以进一步增强。随后，He等 [28]发现 DNA中
的 5mC转化为 5hmC，二者都可以被 TET蛋白氧
化为 5-羧基胞嘧啶 (5-carboxylcytosine, 5caC)，而
5caC又进一步被胸腺嘧啶 DNA糖基化酶 (thymine-
DNA glycosylase, TDG) 识别并切除，进而通过
DNA剪切修复途径替换为没有修饰的 C，从而初
步阐明了一条 DNA主动去甲基化的途径 (5mC→
5hmC→ 5caC→ C)，为研究 DNA去甲基化作用及
生理功能指明了方向。
2　5hmC检测的方法学
目前尽管已经有检测 DNA甲基化的多种分析
技术，如重亚硫酸盐修饰 (bisulfite modification)和
甲基化 DNA免疫沉淀 (methylated DNA immunopreci-
pitation, MeDIP)等，但这些技术均不能区分 5mC
和 5hmC，例如，在重亚硫酸盐修饰过程中，5mC
和 5hmC都会被转变成尿嘧啶，从而在后续的检测
方法中无法识别二者 [21, 23, 29-32]。近年来，随着分子
生物学检测技术的不断发展，目前，不仅可探测特
定位点的 5hmC，而且还能分析基因组 5hmC的水
平及其分布特征 [13, 24, 33-35]。
2.1　特定位点5hmC检测技术
是一类可分析特定基因或序列位点 5hmC状态
的分析技术。目前市场上出现了可探测特定位点
5hmC商品化试剂盒，主要是NEB公司的 EpiMark™
5-hmC and 5-mC Analysis Kit和 Zymo Research公司
的 Quest 5-hmC Detection Kit。它们的检测原理大致
相同，均是首先将 5hmC特异性地转变成 β-葡萄糖
基 -5羟甲基胞嘧啶 (β-glucosyl-5-hydroxymethylcy-
tosine, β-glu-5hmC or 5ghmC)，然后再基于甲基化
敏感限制性内切酶 (methylation sensitive restriction
enzyme, MSRE) 及其同裂酶识别和扩增 5-ghmC
和 5mC所在基因片段。具体步骤如下。第一步是
糖基化。用 T4-葡萄糖基转移酶 (T4-β-glucosyltrans-
ferases, T4-BGT)处理基因组 DNA，使所有 5hmC
的羟基上添加葡萄糖 (glucose)转换为 5ghmC，未
修饰胞嘧啶或 5mC则不受影响，从而将 5ghmC 和
5mC区分开来。第二步的是限制性内切酶消化。
MspI和 HpaII识别相同的序列 (CCGG)，但是对不
同的甲基化状态敏感。其中MspI识别并切割未修
饰胞嘧啶或 5mC，5ghmC除外，HpaII则识别并切
割未修饰胞嘧啶，5mC和 5ghmC则不受影响。第
三步是 PCR扩增和分析不同限制性内切酶的消化
产物。基因组 DNA先经糖基化，接着MspI消化后
检测到的是 5ghmC 含量，HpaII消化后检测到的是
5mC和 5ghmC总量，未经酶消化后检测的是 DNA
王学静，等：表观遗传学新视点——DNA羟甲基化第6期 523
总量。上述两款试剂盒的区别在于前一款包含了
MspI，而后一款不包含对 5-ghmC敏感的限制性内
切酶。内切酶处理之后，可开展多种下游分析，如
qPCR、新一代测序、Southern杂交、芯片等。此类
试剂盒的优点是操作简便，只需三步。
2.2　全基因组5hmC检测技术
全基因组 5hmC检测检测技术目前主要有两
类，分别是依赖抗原 -抗体免疫作用原理的沉淀检
测技术和不依赖于上述原理的非沉淀检测技术。
依赖于免疫原理的沉淀检测技术是利用一些酶
和化学反应的组合来分离出包含单个 5-hmC的 DNA
片段，然后采用沉淀或免疫沉淀技术可达到对
5hmC的特异性分析。该类技术主要包括 5hmC免
疫沉淀 (5hmC immunoprecipitation, 5hmC-IP)[24, 33-34]、
抗 5-亚甲基磺酸胞嘧啶 (antiserum to cytosine 5-methy-
lenesulphonate, anti-CMS)[13]、结合蛋白 J(J-binding
protein, JBP)沉淀 [35]、糖基化、高碘酸氧化和生物
素化 (glucosylation, periodate oxidation, biotinylation,
GLIB)处理等 [13]。
5hmC-IP是目前研究 5hmC较为常用的方法之
一，也是较其他沉淀技术更为直接的方法。5hmC-
IP采用的 5hmC特异抗体能够使 5hmC直接免疫沉
淀，具有良好的灵敏性 [24]。anti-CMS是基因组
DNA经重亚硫酸氢钠，将 5hmC转换成 5-亚甲基
磺酸胞嘧啶 (cytosine 5-methylenesulphonate, CMS)，
然后利用 CMS特异抗体免疫沉淀 CMS DNA序列。
JBP沉淀是 5hmC 在 T4-BGT作用下转换为 β-glu-
5hmC，然后磁珠偶联 JBP将其沉淀。GLIB是利用
T4-BGT 5hmC转换为 5ghmC，然后用高碘酸钠氧
化葡萄糖，它将邻近的羟基转化成醛基，之后用醛
基反应性探针进一步修饰，在每个 5hmC上添加两
个生物素分子，并利用链霉亲和素来沉淀。与
5hmC-IP相比，选择性标记 5hmC后再对标记物进
行免疫沉淀则具有不依赖 5hmC的浓度和更高灵敏
度的特点 [13, 35-36]。
不依赖于沉淀的检测技术主要包括薄层色谱法
(thin-layer chromatography)、高压液相色谱法 (high-
pressure liquid chromatography)、质谱法 (mass spectro-
metry)[37]、5hmC葡萄糖基化定量测定 (Quantitative
hmC glucosylation assay)[11]、单分子实时 DNA测序
(single-molecule real-time DNA sequencing, SMRT)[38]
和选择性化学标记 SMRT技术 [39]。前三种方法因
不适用于大样本实验检测而受到限制。5hmC葡萄
糖基化定量测定是在 T4-BGT作用下在 5hmC上添
加一个放射性标记 3H的葡萄糖，然后采用液体闪
烁计数器进行检测。其特点是不依赖于特定的设备，
不产生序列偏倚，并且所需样本量小。SMRT技术
采用的是对 DNA聚合酶的工作状态进行实时监测
的方法，属于第三代核酸测序技术。DNA聚合酶
催化荧光标记的核苷酸掺入到互补的核酸链中，核
苷酸的掺入产生荧光脉冲，然后依据荧光颜色鉴定
出核苷酸，当聚合酶切断连接在核苷酸末端的荧
光基团时，脉冲终止。荧光脉冲的到达时间和持续
时间与 DNA聚合酶的动力学相关，根据 5mC和
5hmC 等各种修饰对聚合酶动力学的影响不一，从
而能够将它们区分和检测。选择性化学标记 SMRT
是利用第三代单分子测序技术和 5hmC的选择性化
学标记方法来高通量检测 5hmC。首先 5hmC 在 T4-
BGT作用下转换为 N3-5-gmC，之后通过生物素连
接、磁珠富集和二硫键断裂一系列反应生成 HS-
N3-5-gmC，最后 SMRT测序。与单纯 SMRT技术
检测 5hmC相比，由于动力学信号的大幅增加，在
单分子读取中可准确指定 5hmC的位点，而无需与
未修饰的对照样品进行比较。
3　5hmC在人体组织学分布特征及其在疾病状
态下的变化特征
Li和 Liu[24]首次对人体正常组织中 5hmC分布
进行研究，发现人体不同类型组织中 5hmC分布存
在差异性，在脑组织中含量最高 (0.67℅)，肝脏
(0.46℅)、肾脏 (0.38℅)、结肠 (0.45℅)、直肠 (0.57℅)
组织含量次之，肺脏组织含量较低 (0.14℅)，胎盘
(0.06℅)、心脏、乳腺 (0.05℅)组织含量最低。随后
的研究也发现 5hmC分布具有组织特异性，脑组织
5hmC含量十分丰富，尤其是大脑皮质 [33, 40-41]。这
与 5hmC在小鼠不同组织中的分布相似 [11, 37, 42]。最
近，Nestor等 [41]报道推测 5hmC水平与组织增殖
率有关，低增殖能力组织中 5hmC含量较高，高增
殖能力组织中 5hmC含量较低。Haffner等 [43]研究
发现，5hmC水平与组织细胞分化程度存在相关性，
终末分化细胞中 5hmC含量最高，干细胞或者元祖
细胞中 5hmC含量较低。Szulwach等 [44]通过绘制
小鼠在 3个不同年龄阶段小脑和海马 2个脑区域中
5hmC的模式图谱，揭示了在发育和衰老过程中
5hmC是随着年龄维持在稳定状态或逐渐增长的分
布模式；该研究小组还发现，5hmC水平与MeCP
蛋白含量存在负相关性，提示 5hmC可能在雷特综
合征 (Rett syndrome)和孤独症等神经障碍性疾病的
生命科学 第24卷524
发生发展起着重要作用。
Li和 Liu[24]的研究还发现，结肠癌和直肠癌组
织中 5hmC含量明显降低。在 HeLa宫颈癌细胞系、
HCT116 和 SW620结肠癌细胞系及 AN3CA 子宫内
膜癌细胞系中几乎检测不到 5hmC。在后来的研究
中相继发现在其他肿瘤组织中 5hmC含量降低 [41, 43, 45]。
Jin等 [45]报道肺癌组织中 5hmC含量降低，大脑肿
瘤组织中 5hmC水平减少更为明显，几乎不到正常
组织含量的 1/30，同时在皮肤癌、乳腺癌、子宫癌、
胰腺癌、小肠癌、肝癌和肾脏肿瘤组织中 5hmC含
量也明显降低，结果推测肿瘤组织 5hmC含量降低
与肿瘤细胞高增殖率有关，并且肿瘤组织中 5hmC
生成与消除过程存在着异常。Haffner等 [43]发现前
列腺癌、乳腺癌和结肠癌组织中 5hmC水平显著降
低，研究结果提示 5hmC可能在肿瘤发生和发展过
程中起一定阻碍作用，其机制可能为 5hmC通过改
变 DNA甲基化状态来阻止肿瘤抑制基因和凋亡基
因失活，5hmC水平的降低使得上述基因缺乏保护
导致肿瘤发生。
4　结论
5hmC是 TET家族的酶通过氧化 5mC产生的，
可能参与了 DNA去甲基化或基因表达调控，具有
重要的生物学作用。但 5hmC与肿瘤关系的研究尚
处于初步探索阶段，肿瘤组织中 5hmC水平显著降
低，并且不同肿瘤组织中 5hmC含量变化不同，说
明其可能在肿瘤发生和发展过程中起一定作用，在
不同来源的肿瘤发生过程中发挥作用的方式及调控
机制可能不同。目前确切的作用和分子机制尚不十
分清楚，5hmC在肿瘤组织中含量的改变可能与其
在肿瘤细胞甲基化率及增殖率等机制的调控有关。
随着 5hmC甲基化分析和检测方法学的发展，人们
将进一步揭示 5hmC与肿瘤发展进程的相关性。
5hmC作为一种表观遗传学新修饰 , 在肿瘤中的特
异性使其有望成为肿瘤早期诊断和肿瘤患者预后的
标志物。
[参　考　文　献]
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