全 文 ：第 １４卷第 １期
２０１６年 １月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １４ Ｎｏ􀆰 １
Ｊａｎ􀆰 ２０１６
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１６􀆰 ０１􀆰 ０１１
收稿日期：２０１４－０９－０９
基金项目：国家星火计划（２０１５ＧＡ６９０００４）；江苏省科技项目（ＢＹ２０１５０１９－３６、ＢＥ２０１５３０６）
作者简介：张　 梁（１９７８—），男，江苏无锡人，教授，研究方向：工业生物技术与酶工程，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｌ＠ ｊｉａｎｇｎａｎ．ｅｄｕ．ｃｎ
饲用凝结芽孢杆菌高密度发酵及高纯度菌粉的制备
张　 梁１，辛　 瑜１，唐旭彪２，石孔泉３
（１． 江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡 ２１４１２２；２． 江苏大有生物科技发展有限公司，
江苏 无锡 ２１４１３１；３． 泰州绿圣元生物科技有限公司，江苏 泰州 ２２５５００）
摘　 要：对凝结芽孢杆菌的发酵工艺进行了研究，１５０ Ｌ 发酵罐发酵 ４４ ｈ，最终发酵液活菌数达到了 ２􀆰 ０１×１０１０
ｃｆｕ ／ ｍＬ，芽孢形成率达到 ９６􀆰 ８２％。 ３ ｍ３罐中试，发酵时间为 ４４ ｈ，发酵液中的活菌数达到 ２􀆰 １０×１０１０ ｃｆｕ ／ ｍＬ，芽孢
形成率达到 ９１􀆰 ７０％。 发酵液离心后，收集菌液进行喷雾干燥以收获菌粉（进风温度 １６０ ℃，出风温度 ８０ ℃），菌粉
收率为 ２􀆰 ５０％，芽孢收率 ８６􀆰 ０７％。
关键词：凝结芽孢杆菌；高密度发酵；高纯度菌粉
中图分类号：Ｑ８１５　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１６）０１－００５８－０３
Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｒａｙ ｄｒｙｉｎｇ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｓｐｏｒｅ ｐｏｗｄｅｒ
ＺＨＡＮＧ Ｌｉａｎｇ１，ＸＩＮ Ｙｕ１，ＴＡＮＧ Ｘｕｂｉａｏ２，ＳＨＩ Ｋｏｎｇｑｕａｎ３
（１． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｃｅｒｅａｌ Ｆｅｒｍｅｎｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ；
２． Ｊｉａｎｇｓｕ Ｄａｙｏｕ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＣＯ，ＬＴＤ􀆰 ，Ｗｕｘｉ ２１４１３１，Ｃｈｉｎａ； ３． Ｔａｉｚｈｏｕ ｌｕｓｈｅｎｇｙｕａｎ Ｃｏ，Ｌｔｄ． ，Ｔａｉｚｈｏｕ ２２５５００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｒａｙ ｄｒｙｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｓｐｏｒｅ ｐｏｗｄｅｒ ｗｅｒｅ
ｓｔｕｄｉｅｄ􀆰 Ｉｎ ａ １５０⁃Ｌ ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ，ｔｈｅ ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒｅａｃｈｅｄ ２􀆰 ０１×１０１０ ｃｆｕ ／ ｍＬ ｗｉｔｈｉｎ ４４ ｈ ａｎｄ
９６􀆰 ８２％ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒｍｅｄ ｓｐｏｒｅ． Ｉｎ ａ ３⁃ｍ３ ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ，ｔｈｅ ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒｅａｃｈｅｄ ２􀆰 １０×１０１０
ｃｆｕ ／ ｍＬ ｗｉｔｈｉｎ ４４ ｈ，ａｎｄ ９１􀆰 ７０％ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒｍｅｄ ｓｐｏｒｅ． Ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ ｗａｓ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ
ｐｅｌｌｅｔ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｍａｋｅ ｓｐｏｒｅ ｐｏｗｄｅｒ ｉｎ ａ ｓｐｒａｙｉｎｇ ｄｒｙｉｎｇ ｃｈａｍｂｅｒ （ｉｎｐｕｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ａｔ
１６０ ℃ ａｎｄ ｏｕｔｐｕｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ａｔ ８０ ℃） ｗｉｔｈ ａ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ２􀆰 ５０％，ａｎｄ ｖｉａｂｌｅ ｓｐｏｒｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ
８６􀆰 ０７％􀆰
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｓｐｒａｙ ｄｒｙｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ
　 　 凝结芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）是一种产乳
酸的芽孢杆菌，可用于调节肠道紊乱、维持肠道菌
群平衡，已被开发为微生态制剂，被广泛应用于畜
牧、水产等领域［１］。 凝结芽孢杆菌一般以芽孢状态
进行应用，这是因为芽孢不进行新陈代谢，能耐高
温、紫外线、多种溶剂、酸、碱等［２］，具有抗逆性强、
耐高温高压、易贮存等优势［３－４］。
近年来，凝结芽孢杆菌发酵工艺的研究日益
增多。 刘馨磊等［５］采用分批补料工艺，凝结芽孢
杆菌活菌数达 ４􀆰 ５×１０９ ｃｆｕ ／ ｍＬ。 Ｓｅｎ 等［６］通过构
建响应面模型，分析了温度、ｐＨ 和转速等关键工
艺参数的影响，凝结芽孢杆菌活菌数达到 ３􀆰 ６×１０９
ｃｆｕ ／ ｍＬ。 崔东良等［７］对工业发酵培养基进行了研
究，凝结芽孢杆菌活菌数达到 ９􀆰 ３ × １０９ ｃｆｕ ／ ｍＬ。
高书峰等［８］采用分段式补料批次发酵，凝结芽孢
杆菌发酵水平从 ６􀆰 ８×１０９ ｃｆｕ ／ ｍＬ 提高到 ８􀆰 ５×１０９
ｃｆｕ ／ ｍＬ。 尽管研究众多，但发酵规模普遍限于 ５０
Ｌ以内，鲜见更大规模的报道。 因此，研究吨级规
模的凝结芽孢杆菌发酵工艺对于其产业化具有十
分重要的意义。 本文中，笔者从工艺开发的角度
研究了 １５０ Ｌ、３ ｍ３规模的凝结芽孢杆菌产芽孢发
酵工艺以及从发酵液中高效获得芽孢干粉的工
艺，以期为产业化积累数据。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌种
凝结芽孢杆菌 ＺＳ０００７，由江南大学粮食发酵与
工艺国家工程技术实验室成员筛选并保藏。
１􀆰 ２　 主要设备
ＧＨＸ ９１６０Ｂ型恒温隔水式培养箱（上海南荣实
验室设备有限公司），生物光学显微镜 ＸＳＰ ３００（上
海蔡康光学仪器有限公司），ＰＨＨＦＥ２０ Ｋ 型 ｐＨ 计
（梅特勒托利多公司），ＣＵ ６００Ａ 型电热恒温水槽
（上海一恒科学仪器有限公司），ＸＯ ４２００ＤＴＤ 型超
声波清洗机（南京先欧仪器制造有限公司），１５０ Ｌ与
３ ｍ３发酵罐（泰州绿圣元生物科技有限公司），离心喷
雾干燥塔（无锡天阳干燥设备有限公司）。
１􀆰 ３　 培养基
斜面培养基（ＬＢ培养基，ｇ ／ Ｌ）：ＮａＣｌ １０，蛋白胨
１０，酵母粉 ５。
发酵培养基（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ４０，酵母膏 １０，蛋白
胨 １５， Ｋ２ＨＰＯ４ ５，ＭｎＳＯ４ ０􀆰 １，ＮａＮＯ３ ０􀆰 ５。
１􀆰 ４　 种子培养方法
将凝结芽孢杆菌保藏斜面在 ＬＢ 斜面传代培养
（３７ ℃活化培养 ２４ ｈ），得到活化的凝结芽孢杆菌
斜面。
将活化凝结芽孢杆菌斜面，接入装有 ２５ ｍＬ 发
酵培养基的 ２５０ ｍＬ三角瓶中，３７ ℃下 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ培
养 ２０ ｈ后，作为发酵种子接入发酵罐。
１􀆰 ５　 １５０ Ｌ发酵罐试验
按照发酵培养基配方配制培养基，于 １２１ ℃下
灭菌 ２０ ｍｉｎ，冷却到 ３７ ℃，按照 １％接种量接入凝结
芽孢杆菌，按照以下条件设置发酵过程：３７ ℃、４００
ｒ ／ ｍｉｎ，通气量 １ ∶ １ ｖｖｍ，罐压控制 ０􀆰 ０４～０􀆰 ０６ ＭＰａ。
发酵过程中，每隔 ２ ～ ４ ｈ 测定以下参数：ｐＨ、
ＤＯ、ＯＤ６００、活菌数、芽孢数。
１􀆰 ６　 ３ ｍ３发酵罐中试试验
中试时，搅拌转速 １００ ｒ ／ ｍｉｎ，其余参数及监测
同 １５０ Ｌ发酵罐。
１􀆰 ７　 喷雾干燥获取高浓度菌粉
中试获得的发酵液离心后，喷雾干燥收集菌粉，
喷塔参数设置为进风 １６０～２００ ℃，出风 ７５～９０ ℃。
１􀆰 ８　 检测方法
菌体浓度检测采用可见光分光光度计测定 ＯＤ６００。
总菌体数检测：发酵液取样，用无菌水进行梯
度稀释，平板涂布法检测含菌量，重复 ３次。 所用培
养基为 ＬＢ培养基，培养温度 ３７ ℃，培养时间 ２４ ｈ。
芽孢数检测：取 １０ ｍＬ发酵液，置于 ９０ ｍＬ无菌
水中，８０ ℃水浴热处理 １０ ｍｉｎ，用无菌水进行梯度
稀释，平板涂布法检测含菌量，重复 ３次。 所用培养
基为 ＬＢ培养基，培养温度 ３７ ℃，培养时间 ２４ ｈ。
测定菌粉中芽孢数时，取 １􀆰 ００ ｇ 菌粉梯度稀释
后，其余同测定发酵液中芽孢数方法。 芽孢形成率
为芽孢数与总菌体数的比值。 菌粉收率为喷干收
集的菌粉与发酵液质量的比值。 芽孢收率为干粉
芽孢总数与发酵液芽孢总数的比值。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 １５０ Ｌ发酵罐试验结果
１５０ Ｌ发酵罐试验结果如图 １所示，由图 １可以
看出：１５０ Ｌ罐中发酵 ４０ ｈ 时，发酵液活菌数最高可
达 ２􀆰 ２０×１０１０ ｃｆｕ ／ ｍＬ（ｌｇ（活菌数）＝ １０􀆰 ３４）。 最高芽
孢数出现在 ４４ ｈ，达到 ２􀆰 ０１×１０１０ ｃｆｕ ／ ｍＬ（ ｌｇ（芽孢
数）＝ １０􀆰 ３０）；最高芽孢形成率达 ９６􀆰 ８２％。
图 １　 １５０ Ｌ发酵罐过程数据
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｄａｔａ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｎ １５０ Ｌ ｔａｎｋ
２􀆰 ２　 ３ ｍ３发酵罐中试试验结果
在 ３ ｍ３机械搅拌好氧发酵罐上进行工艺放大，
结果如图 ２所示。 由图 ２ 可知：发酵液活菌数最高
值出现在 ３６ ｈ，达到 ２􀆰 ２９ × １０１０ ｃｆｕ ／ ｍＬ （ ｌｇ （活菌
数）＝ １０􀆰 ３６），最高芽孢数出现在 ４４ ｈ 左右，达到
２􀆰 １０×１０１０ ｃｆｕ ／ ｍＬ（ ｌｇ（芽孢数）＝ １０􀆰 ３２），最高芽孢
形成率达 ９１􀆰 ７０％。
９５　 第 １期 张　 梁等：饲用凝结芽孢杆菌高密度发酵及高纯度菌粉的制备
３ ｍ３发酵罐水平基本达到 １５０ Ｌ发酵罐水平。
图 ２　 中试 ３ ｍ３发酵罐过程数据
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｄａｔａ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｎ ３ ｍ３ ｔａｎｋ
２􀆰 ３　 喷塔干燥结果
将中试得到的发酵液，在 １００ Ｌ ／ ｈ 喷塔上进行
芽孢收获试验，对于进风和出风温度进行了试验，
结果见表 １。
表 １　 不同进风和出风温度对芽孢收率的影响
Ｔａｂｌｅ １　 Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓｐｏｒｅ ｙｉｅｌｄｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｐｒａｙ ｔｏｗｅｒ
ｉｎｌｅｔ ／ ｏｕｔｌｅｔ ａｉｒ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ
进风温度 ／
℃
芽孢收率 ／ ％
９０ ℃ ８５ ℃ ８０ ℃ ７５ ℃
２００ １１􀆰 ６７ １４􀆰 ２９ １７􀆰 ８６ ２２􀆰 ６２
１９０ ２２􀆰 ６２ ２７􀆰 ３８ ３３􀆰 ３３ ３６􀆰 ９０
１８０ ３５􀆰 ７１ ４１􀆰 ６７ ４８􀆰 ８１ ５３􀆰 ５７
１７０ ７１􀆰 ４３ ７３􀆰 ８１ ７７􀆰 ３８ ８３􀆰 ３３
１６０ ７３􀆰 ８１ ８３􀆰 ５７ ８６􀆰 ０７ ８６􀆰 ６７
由表 １中可以看出，进风温度不变，降低出风温
度，芽孢收率逐步提升；降低进风温度，可显著提高
芽孢收率。 说明了高温对于凝结芽孢杆菌的存活
具有一定的影响。
　 　 确定的中试喷雾干燥工艺：进风温度 １６０ ℃，出
风温度 ８０ ℃，此时芽孢收率在 ８６􀆰 ０７％。
在此工艺条件下经过多批次试验，每吨发酵液
可以得到菌粉 ２５ ｋｇ，即菌粉收率在 ２􀆰 ５０％。
３　 结论
本文研究了凝结芽孢杆菌 １５０ Ｌ、３ ｍ３发酵罐规
模的发酵工艺并考察了喷雾干燥法制备菌粉的工
艺参数，确定的中试喷雾干燥工艺：进风温度 １６０
℃，出风温度 ８０ ℃，此时芽孢收率在 ８６􀆰 ０７％。 在此
工艺条件下经过多批次试验，每吨发酵液可以得到
菌粉 ２５ ｋｇ，即菌粉收率在 ２􀆰 ５０％，为后期产业化制
备凝结芽孢杆菌积累了数据。
参考文献：
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（责任编辑　 管　 珺）
０６ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷