全 文 ：第 １３卷第 ６期
２０１５年 １１月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ６
Ｎｏｖ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０６􀆰 ０１３
收稿日期：２０１４－１０－１５
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１３ＡＡ０５０７０３）；青岛市基础研究项目 （１２ １ ４ ９ （３） ｊｃｈ）
作者简介：谢　 萌（１９８９—）女，天津人，硕士研究生，研究方向：生物化工；贺诗华（联系人），副教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｈｅｓｈｉｈｕａ＠ ｘｕｓｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
重组大肠杆菌高密度发酵产甲羟戊酸动力学
谢　 萌１，徐　 鑫２，咸　 漠２，贺诗华１
（１． 西安科技大学 化学与化工学院，陕西 西安，７１００５４；
２． 中国科学院 生物基材料重点实验室 青岛生物能源与过程研究所，山东 青岛，２６６１０１）
摘　 要：为提高甲羟戊酸产量，探究其发酵生产规律，以重组大肠杆菌 ＹＪＭ１６ 为供试菌株，进行 ５ Ｌ 发酵罐匀速补
料的高密度发酵实验，最终细胞产量达到 ５４􀆰 ４８ ｇ ／ Ｌ，甲羟戊酸产量达到 ４０􀆰 ４３ ｇ ／ Ｌ，产率为 ２０􀆰 ２％。 然后根据
Ｌｏｇｉｓｔｉｃ方程、Ｌｕｅｄｅｋｉｎｇ Ｐｉｒｅｔ方程和类似 Ｌｕｅｄｅｋｉｎｇ Ｐｉｒｅｔ 方程，拟合出重组大肠杆菌高密度发酵过程中菌体生
长、甲羟戊酸合成、基质消耗的动力学模型及模型参数。 结果表明，甲羟戊酸的合成与重组大肠杆菌的生长速率及
菌体积累量均有关。 菌体生长、底物消耗模型和产物形成模型拟合度 Ｒ２分别达到了 ０􀆰 ９３１ ９、０􀆰 ９５７ ８ 和 ０􀆰 ９７５ １，
可用于描述利用重组大肠杆菌高密度发酵生产甲羟戊酸过程。
关键词：重组大肠杆菌；甲羟戊酸；高密度发酵；动力学模型
中图分类号：ＴＱ２２５􀆰 １　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０６－００７０－０５
Ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＸＩＥ Ｍｅｎｇ１，ＸＵ Ｘｉｎ２，ＸＩＡＮ Ｍｏ２，ＨＥ Ｓｈｉｈｕａ１
（１． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｘｉ′ａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉ′ａｎ ７１００５４，Ｃｈｉｎａ；
２． Ｑｉｎｇｄａｏ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡＳ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｂａｓｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６１０１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ ａｎｄ ｓｔｕｄｙ ｉｔｓ ｒｅｇｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎ ｄｕｒｉｎｇ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ，ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＹＪＭ１６ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ ｄｒｙ ｃｅｌｌ ｗｅｉｇｈｔ ｒｅａｃｈｅｄ ５４􀆰 ４８ ｇ ／ Ｌ，ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ ｗａｓ ４０􀆰 ４３ ｇ ／ Ｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｗａｓ ２０􀆰 ２％． Ｔｈｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ
Ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ， ｔｈｅ Ｌｕｅｄｅｋｉｎｇ Ｐｉｒｅｔ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ
Ｌｕｅｄｅｋｉｎｇ⁃Ｐｉｒｅｔ⁃ｌｉｋｅ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ． Ｔｈｅ ｍｅｖａｌｏｎａｔｅｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｗａｓ
ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｔｈｅ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃ ｏｆ ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｗｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ
ｔｈｅ ｍｏｄｅｌｓ． Ｔｈｅ ｇｏｏｄｎｅｓｓ⁃ｏｆ⁃ｆｉｔ ｓｃｏｒｅｓ Ｒ２ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌｓ ｗｅｒｅ ０􀆰 ９３１ ９，０􀆰 ９５７ ８ ａｎｄ ０􀆰 ９７５ １，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ；ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｍｏｄｅｌ
　 　 甲羟戊酸（３，５ 二羟基 ３ 甲基戊酸）是生物
体内生成异戊烯焦磷酸（ ＩＰＰ）的中间代谢产物，是
合成甾醇、萜类、类异戊二烯的重要中间体，在食品
及化工行业有重要用途［１］。 Ｙａｎｇ 等［２－３］通过对大
肠杆菌的甲羟戊酸代谢途径进行改造，提高了甲羟
戊酸产量，进而提高了其下游产物橡胶合成单体异
戊二烯的产量，在发酵 ４０ ｈ 时达到 ６ ｇ ／ Ｌ。 Ｘｉｏｎｇ
等［４］利用大肠杆菌发酵生成甲羟戊酸，酯化生成β
甲基 δ 戊内酯，并聚合成嵌段共聚物用于橡胶合
成。 采用重组大肠杆菌高效表达常用的高密度发
酵技术［５－６］合成甲羟戊酸，提高菌体的发酵密度，最
终提高产物的产量及产率，不仅可以减少培养体
积，强化下游分离提取，还可以缩短生产周期、减少
设备投资，从而降低生产成本，能极大地提高市场
竞争力［７］。
目前，使用生物法发酵生产有机酸的工业化品
种很多，例如丁二酸［８］、乳酸［９］等，产品产量均达到
４０ ｇ ／ Ｌ，而达到高密度要求，则需要菌体干质量浓度
达到 ３０ ｇ ／ Ｌ以上。 微生物发酵过程具有非线性、时
变性和不确定性的特点。 特别是高密度发酵周期
长，且采用补料分批发酵的方式，其动力学参数复
杂，因此，目前大多基于遗传算法等复杂模型［１０－１２］
来优化高密度发酵过程。
笔者拟在 ５ Ｌ 发酵罐的小试中，利用匀速补料
批式发酵来实现重组大肠杆菌高密度发酵产甲羟
戊酸。 同时通过对发酵过程的数据进行分析，研究
菌体生长、基质消耗及产物生成之间的动力学关
系，证实常用的 Ｌｏｇｉｓｔｉｃ 方程、Ｌｕｅｄｅｋｉｎｇ Ｐｉｒｅｔ 方程
及类似 Ｌｕｅｄｅｋｉｎｇ Ｐｉｒｅｔ 方程是否适用于高密度发
酵动力学研究。 该模型参数简单，可使用常用软件
Ｏｒｉｇｉｎ进行拟合，以避免繁多的参数设置和专业软
件的计算过程。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料与仪器
重组大肠杆菌： ＹＪＭ１６ （ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ ＤＥ３） ／
ｐＹＪＭ１６） ［３］，由中国科学院青岛生物能源与过程研
究所生物基化学品团队构建并保藏。
５ Ｌ发酵罐，德国 Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ 公司；ＺＨＷＹ １１１２Ｂ
型恒温摇床，上海智诚分析仪器制造有限公司；１ １４
型台式高速离心机，德国 Ｓｉｇｍａ公司；Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ
２型涡漩振荡器，美国 Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ公司；ＳＢＡ
４０Ｄ型生物传感分析仪，山东省科学院生物研究所；
４５０ ＧＣ ８４００型气相色谱仪、Ｃａｒｙ ５０ ＵＶ Ｖｉｓ型紫
外分光光度计，美国 Ｖａｒｉａｎ公司。
１􀆰 ２　 培养基
ＬＢ培养基（ ｇ ／ Ｌ）：胰蛋白胨 １０、酵母浸粉 ５、
ＮａＣｌ １０。 ｐＨ ７􀆰 ０。
Ｍ９ 基本培养基 （ ｇ ／ Ｌ ）： Ｎａ２ ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ
１５􀆰 １２、ＫＨ２ＰＯ４ ３、ＮａＣｌ ０􀆰 ５、ＮＨ４Ｃｌ １、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ
０􀆰 ２４、葡萄糖 ２０、氯霉素 ０􀆰 ０３４。
发酵培养基（ｇ ／ Ｌ）：ＫＨ２ＰＯ４ ２􀆰 ５、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ３、
Ｃ６Ｈ８ Ｏ７·Ｈ２ Ｏ １、Ｃ６ Ｈ５ Ｎａ３ Ｏ７·２Ｈ２ Ｏ １、ＫＣｌ １􀆰 ８６、
ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０８、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ２４、牛肉浸粉 １、甜
菜碱 １、微量元素 ０􀆰 ００１、葡萄糖 ２０、氯霉素 ０􀆰 ０３４。
微量元素配方（质量分数）：ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ２９％、
（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４·４Ｈ２Ｏ ０􀆰 ３７％、Ｈ３ＢＯ３ ２􀆰 ４７％、ＣｕＳＯ４·
５Ｈ２Ｏ ０􀆰 ２５％、ＭｎＣｌ２·４Ｈ２Ｏ １􀆰 ５８％。
１􀆰 ３　 实验方法
１􀆰 ３􀆰 １　 种子液培养
一级种子：从菌种 ＬＢ 平板上挑取一个饱满的
单菌落，接种到装有 １０ ｍＬ ＬＢ 培养基的 １００ ｍＬ 三
角瓶里，３７ ℃培养 １２ ｈ。
二级种子：一级种子以 １％的接种量接至装有 １００
ｍＬ发酵培养基的 ２５０ ｍＬ三角瓶中，３７ ℃培养 １２ ｈ。
１􀆰 ３􀆰 ２　 补料分批发酵过程
补料分批发酵采用 ５ Ｌ 发酵罐，加入 ３ Ｌ 发酵
培养基，１２１ ℃灭菌 ３０ ｍｉｎ。 冷却后接入 １００ ｍＬ种
子液，３７ ℃培养 １ ｈ，之后持续 ３２ ℃，溶氧控制在
２０％，通过自动流加氨水将 ｐＨ 控制在 ７􀆰 ０，补料设
置为发酵 １３ ｈ后 ６％自动流加。 自接种后间隔几小
时取样 ２０ ｍＬ，分别测定 ＯＤ、干质量浓度、残糖量、
甲羟戊酸产量及副产物产量，培养至 １３ ｈ，加入 ０􀆰 １
ｍｏｌ ／ Ｌ异丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）进行诱导。
１􀆰 ３􀆰 ３　 发酵过程中参数的确定
菌体生物量的测定采用干质量浓度法。 取发
酵液 ５ ｍＬ 于已知质量的离心管中，用高速离心机
６ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ，弃上清液，再加去离子水悬
浮离心 ２次，获沉淀，放入 ８０ ℃的烘箱内烘干至恒
质量。 称质量，计算得知菌体干质量浓度。
甲羟戊酸的测定：取 ５ ｍＬ发酵液于 ５０ ｍＬ离心
管中离心，５ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ；将上清液倒入
干净的 ５０ ｍＬ离心管中，加入 １ ｍｏｌ ／ Ｌ 盐酸调节至
ｐＨ２􀆰 ０；４５ ℃水浴 ４５ ｍｉｎ；加入 ２􀆰 ５ ｇ无水 Ｎａ２ＳＯ４和
１０ ｍＬ乙酸乙酯，充分振荡，分层；用 １ ｍＬ针管取上
清液，使用有机相滤膜过滤到气相小瓶中，用 ４５０
ＧＣ ８４００型气相色谱仪进行检测。
葡萄糖含量的测定：取发酵液 １ ｍＬ，用高速离
心机 ６ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 ５ ｍｉｎ，取上清液，使用 ＳＢＡ
４０Ｄ型生物传感分析仪测定。
１７　 第 ６期 谢　 萌等：重组大肠杆菌高密度发酵产甲羟戊酸动力学
１􀆰 ３􀆰 ４　 数据的获取及处理
从发酵开始计时，７ ｈ 开始取样，测定不同时期
菌体生物量、甲羟戊酸产量及葡萄糖浓度，并用
Ｏｒｉｇｉｎ ８􀆰 ５绘图软件对动力学方程进行非线性拟合，
绘制动力学曲线，以获得最佳动力学模型参数。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 重组大肠杆菌产甲羟戊酸高密度发酵过程
高密度培养是在保证生长速率的前提下，尽可能
提高细胞密度，使体积生产率大幅提高，其实现的主要
方式为分批补料培养。 图 １为重组大肠杆菌高密度发
酵产甲羟戊酸发酵过程曲线，显示了细胞生物量
（ＤＣＷ）、残糖浓度（ＲＧ）及甲羟戊酸浓度随时间的变化
趋势。 由图 １可知：重组菌高密度发酵过程可分为 ４
个阶段。 第一阶段为延滞期，即菌株接种至发酵罐后
的短暂适应期。 第二阶段为对数生长期，菌体迅速生
长，最大比生长速率出现在此阶段，同时，该阶段菌体
相关酶活达到最佳。 为达到较高的细胞密度，以提高
甲羟戊酸产量，选择在对数后期，即培养 ２０ ｈ后，细胞
生物量为 ２２ ｇ ／ Ｌ时，加入 ＩＰＴＧ诱导，发酵进入第三阶
段———产物生成期。 这一时期菌体以低于对数期的比
生长速率继续生长，产物积累迅速，甲羟戊酸的最大比
生成速率及最高产率均出现在这个阶段。 第四阶段是
衰亡期，这一时期菌体开始衰亡，导致生物量下降，同时
甲羟戊酸生产速率减慢。 发酵结束时，菌体产量达到
５４􀆰 ４８ ｇ ／ Ｌ，甲羟戊酸产量达到 ４０􀆰 ４３ ｇ ／ Ｌ，产率为 ２０􀆰 ２％。
图 １　 重组大肠杆菌产甲羟戊酸发酵进程曲线
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ
ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
２􀆰 ２　 甲羟戊酸高密度发酵的动力学模型分析
研究者通常采用基于菌体生长动力学的 Ｌｏｇｉｓｔｉｃ
方程、Ｌｕｅｄｅｋｉｎｇ Ｐｉｒｅｔ 方程及类似 Ｌｕｅｄｅｋｉｎｇ Ｐｉｒｅｔ
方程等动力学方程来研究分批发酵中菌体生长、基质
消耗及产物生成之间的动力学关系［１３］。 为达到较高
的细胞密度，笔者采用匀速补料分批发酵模式。 通过
对实验数据的分析，做出如下假定：①甲羟戊酸分批
发酵过程中菌体浓度的增加对自身生长存在抑制作
用；②葡萄糖的消耗仅用于菌体生长和维持菌体代
谢，葡萄糖消耗速率由细胞浓度、细胞生长和甲羟戊
酸合成决定；③产物生成期，甲羟戊酸大量合成，衰亡
期甲羟戊酸合成速率逐渐降低。
２􀆰 ２􀆰 １　 菌体生长动力学模型
描述细胞生长动力学普遍采用的是 Ｌｏｇｉｓｔｉｃ 方
程，它广泛应用于分批发酵的细胞，能较好地描述
分批发酵过程中因菌体浓度的增加对菌体自身存
在的抑制效应［１４－１５］。 该方程被看作是一个表现细
胞生长与营养物质之间非线性关系的经验方
程［１６－１７］。 本实验中，大肠杆菌的生长曲线为较标准
的 Ｓ型，故采用 Ｌｏｇｉｓｔｉｃ方程作为研究重组大肠杆菌
的菌体生长动力学模型，见式（１）。
ｄＸ
ｄｔ
＝ μｍＸ １ －
Ｘ
Ｘｍ
æ
è
ç
ö
ø
÷ （１）
式中：Ｘ 为菌体生物量（ｇ ／ Ｌ）；Ｘｍ为最大菌体生物量
（ｇ ／ Ｌ）；μｍ为菌体最大比生长速率（ｈ
－１）；ｔ为时间（ｈ）。
将式（１）积分为代数方程，见式（２）。
Ｘ ＝
Ｘ０Ｘｍｅμｍｔ
Ｘｍ － Ｘ０ ＋ Ｘ０ｅμｍｔ
（２）
式中：Ｘ０为初始菌体生物量（ｇ ／ Ｌ）。
将图 １数据代入式（２）进行非线性拟合，得到
生长动力学参数 Ｘ０、Ｘｍ和 μｍ值分别为 ５􀆰 ４２８ ６１、
５０􀆰 ５７０ ３６和 ０􀆰 ０７２ ６４，代入式（２）获得菌体生长动
力学方程，见式（３）。
Ｘ ＝ ２７４􀆰 ５３ｅ
０􀆰 ０７２ ６
４５􀆰 １４ ＋ ５􀆰 ４３ｅ０􀆰 ０７２ ６
（３）
由 Ｌｏｇｉｓｔｉｃ方程获得的式（３）预测的模型值与实验
数据进行对比验证，结果见图 ２。
图 ２　 菌体生长的实验值与模型计算值的比较
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄａｔａ ｗｉｔｈ
ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｄａｔａ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ
２７ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
由图 ２可知，实验数据与公式（３）的计算值基
本吻合，Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９３１ ９，结果表明实验值与动力学模
型基本符合，但是总体拟合度低于分批发酵［１８］，其
中对数前期实验值与拟合值并非完美贴合，其原因
在于，随着培养时间的延长，目标产物甲羟戊酸及
其他代谢副产物的积累对菌体的抑制作用越来越
明显，而 Ｌｏｇｉｓｔｉｃ方程获得的是更为贴合发酵后期的
局部最优解。 重组大肠杆菌细胞生长基本可参考
依据该动力学模型。
２􀆰 ２􀆰 ２　 甲羟戊酸合成动力学模型
由于微生物在发酵的动态过程中具有十分复
杂的合成途径，代谢调节机制也各具特点，所以根
据产物生成速率与细胞生长速率之间的动态关系，
可将其动力学模型分为三类：①生长偶联型；②部
分生长偶联型或称混合型；③非生长偶联型［１９－２０］，
常用 Ｌｕｅｄｅｋｉｎｇ Ｐｉｒｅｔ方程［２１－２２］描述产物形成与细
胞生长的关系，见式（４）。
ｄＰ
ｄｔ
＝ α ｄＸ
ｄｔ
＋ βＸ （４）
式中：Ｐ 为甲羟戊酸产量（ ｇ ／ Ｌ）；Ｘ 为菌体生物量
（ｇ ／ Ｌ）；α为生长偶联系数；β为非生偶联系数。
α≠０、β ＝ ０ 表示第Ⅰ发酵；α≠０、β≠０ 表示第
Ⅱ类发酵；α ＝ ０、β≠０ 表示第Ⅲ类发酵。 从大肠杆
菌产甲羟戊酸分批发酵实验结果可以推断该菌体
的发酵过程属于第Ⅱ类，即产物形成与细胞生长呈
部分偶联型。 联合公式（２）和（４），Ｌｕｅｄｅｋｉｎｇ Ｐｉｒｅｔ
方程可积分为代数方程，见式（５）。
Ｐ ＝ Ｐ０ － αＸ ＋ α
Ｘ０Ｘｍｅμｍｔ
Ｘｍ － Ｘ０ ＋ Ｘ０ｅμｍｔ
＋
β
Ｘｍ
μｍ
ｌｎ
Ｘｍ － Ｘ０ ＋ Ｘ０ｅμｍｔ
Ｘｍ
æ
è
ç
ö
ø
÷ （５）
式中 Ｐ０为甲羟戊酸初始产量（ｇ ／ Ｌ）。 由于 Ｐ０ ＝ ０，Ｘ０
对产量的影响可以忽略不计，式（５）可简化为
Ｐ ＝ α
Ｘ０Ｘｍｅμｍｔ
Ｘｍ － Ｘ０ ＋ Ｘ０ｅμｍｔ
＋ β
Ｘｍ
μｍ
ｌｎ
Ｘｍ － Ｘ０ ＋ Ｘ０ｅμｍｔ
Ｘｍ
æ
è
ç
ö
ø
÷
（６）
　 　 将菌体生长动力学参数 Ｘ０、Ｘｍ和 μｍ值分别代入
式（６），利用图 １的实验数据进行非线性拟合，得到产
物生成动力学参数 α 和 β，其值分别为 ０􀆰 ２８６ ３５ 和
０􀆰 ０１１ ５９，代入式（６），获得产物浓度与时间的关系，
见式（７）。
　 　 　 Ｓ ＝ ７８􀆰 ６１ｅ
０􀆰 ０７２ ６ｔ
４５􀆰 １４ ＋ ５􀆰 ４３ｅ０􀆰 ０７２ ６ｔ
＋
８􀆰 ０６９ｌｎ ４５􀆰 １４
＋ ５􀆰 ４３０ｅ０􀆰 ０７２ ６ｔ
５０􀆰 ５７０ ７
æ
è
ç
ö
ø
÷ （７）
由 Ｌｕｅｄｅｋｉｎｇ Ｐｉｒｅｔ 方程获得的式（７）预测模
型值与实验数据进行对比验证，结果见图 ３。
图 ３　 甲羟戊酸产量的实验值与模型计算值的比较
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄａｔａ ｗｉｔｈ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ
ｄａｔａ ｏｎ ＭＶＡ ｙｉｅｌｄ
由图 ３可知，实验数据与公式（７）的计算值基
本吻合，Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９５７ ９。
２􀆰 ２􀆰 ３　 基质消耗动力学模型
大肠杆菌产甲羟戊酸发酵过程中，葡萄糖的消
耗一方面用于菌体生长，同时又用于其菌体细胞的
维持和产物的合成及代谢，因此，基质消耗可以由
类似 Ｌｕｅｄｅｋｉｎｇ Ｐｉｒｅｔ的式（８）来表示。
－ ｄＳ
ｄｔ
＝ ｄＸ
ＹＸ／ Ｓｄｔ
＋ ｄＰ
ＹＰ ／ Ｓｄｔ
＋ γＸ （８）
式中：Ｓ为葡萄糖质量浓度（ｇ ／ Ｌ）； Ｘ 为菌体生物量
（ｇ ／ Ｌ）；ＹＸ／ Ｓ为碳源用于菌体生长的得率常数（ｇ ／ ｇ）；
ＹＰ ／ Ｓ为碳源用于产物积累得率常数（ｇ ／ ｇ）；γ 为菌体
维持系数（ｇ ／ ｇ）。
为避免生成乙酸、乙醇等副产物，提高甲羟戊
酸产量及产率，采用匀速补料方式进行补糖，将残
糖量控制在低于 １ ｇ ／ Ｌ。 因此，补糖阶段（即产物生
成阶段）未进行拟合，忽略用于产物生成的葡萄糖
消耗部分，动力学方程简化为式（９）。
－ ｄＳ
ｄｔ
＝ ｄＸ
ＹＸ／ Ｓｄｔ
＋ γＸ （９）
结合式（２）、式（９）积分可得
Ｓ ＝ Ｓ０ ＋ Ｘ０λ － λ
Ｘ０Ｘｍｅμｍｔ
Ｘｍ － Ｘ０ ＋ Ｘ０ｅμｍｔ
＋
γ
Ｘｍ
μｍ
ｌｎ
Ｘｍ － Ｘ０ ＋ Ｘ０ｅμｍｔ
Ｘｍ
æ
è
ç
ö
ø
÷ （１０）
式中：Ｓ０为初始葡萄糖质量浓度（ｇ ／ Ｌ）；λ＝ １ ／ ＹＸ／ Ｓ。
将菌体生长动力学参数 Ｘ０、Ｘｍ和 μｍ值分别代
３７　 第 ６期 谢　 萌等：重组大肠杆菌高密度发酵产甲羟戊酸动力学
入式（６），利用图 １的实验数据进行非线性拟合，得
到产物形成动力学参数 Ｓ０、λ 和 γ，其值分别为
２０􀆰 ０９１ ６、－２３􀆰 ２４７ ７和 １􀆰 ６５８ ５，代入式（１０），得产
物浓度与时间的关系式，如式（１１）所示。
Ｓ ＝ －１０６􀆰 １１ ＋ ６ ３８２􀆰 １８ｅ
０􀆰 ０７２ ６ｔ
４５􀆰 １４ ＋ ５􀆰 ４３ｅ０􀆰 ０７２ ６ｔ
＋
１ １５４􀆰 ６１ｌｎ ４５􀆰 １４
＋ ５􀆰 ４３０ｅ０􀆰 ０７２ ６ｔ
５０􀆰 ５７０ ７
æ
è
ç
ö
ø
÷ （１１）
　 　 对于由式（１１）获得方程与实验数据进行非线
性拟合，结果见图 ４，Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９７５ １。 图 ４ 为补料前的
基质消耗模型，其中小图是发酵全程的基质剩余曲
线，表明补料后基质基本为零。 由于采用分批补料
方式，底物消耗的实验值较少，但基本可拟合出残
糖浓度变化的趋势。 该模型能够较好地描述甲羟
戊酸合成前的基质消耗情况。
图 ４　 基质消耗的动力学模型与实验数据的比较
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｋｉｎｅｔｉｃ ｍｏｄｅｌ ｄａｔａ ｗｉｔｈ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
ｄａｔａ ｏｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ
３　 结论
以重组大肠杆菌 ＹＪＭ１６ 为供试菌株，进行 ５ Ｌ
发酵罐匀速补料的高密度发酵实验，最终细胞生物
量达到 ５４􀆰 ４８ ｇ ／ Ｌ，甲羟戊酸产量达到 ４０􀆰 ４３ ｇ ／ Ｌ，产
率为 ２０􀆰 ２％。 通过计算得出菌体生长动力学模型、
产物生成模型和基质消耗动力学模型，Ｒ２分别达到
了 ０􀆰 ９３１ ９、０􀆰 ９５７ ８和 ０􀆰 ９７５ １。 本研究建立的模型
基本符合大肠杆菌细胞生长规律，能够反映甲羟戊
酸高密度发酵的过程，同时该模型参数简单，避免
了繁多的参数设置和专业软件的计算过程，可为高
密度发酵工艺的优化放大提供理论依据。
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（责任编辑　 管　 珺）
４７ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷