全 文 ：第 １４卷第 ２期
２０１６年 ３月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １４ Ｎｏ􀆰 ２
Ｍａｒ􀆰 ２０１６
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１６􀆰 ０２􀆰 ００２
收稿日期：２０１５－０７－２１
基金项目：烟台市科技发展计划（２０１４ＳＦ１５１）；中国食品发酵工业研究院 ２０１５年科技发展基金（博士专项）（２０１５ＫＪＦＺ ＢＳ ０３）
作者简介：徐友强（１９８６—），男，山东青州人，博士，工程师，研究方向：发酵工程；程　 池（联系人），教授级高级工程师，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｇ１０００２７＠１６３．ｃｏｍ
重组大肠杆菌转化富马酸生产 Ｌ 丙氨酸
徐友强１，马玉岳２，姚　 粟１，姜增妍２，张　 奇１，张　 露１，裴疆森１，程　 池１
（１． 中国食品发酵工业研究院，北京 １０００１５；
２． 山东省富马酸生物转化工程技术研究中心，山东 烟台 ２６５７０９）
摘　 要：通过克隆来源于睾丸酮丛毛单胞菌的 Ｌ 天冬氨酸 β 脱羧酶基因，在一株具有 Ｌ 天冬氨酸酶生产能力
的大肠埃希氏菌 ＣＩＣＣ １１０２２Ｓ中异源表达，构建转化富马酸生产 Ｌ 丙氨酸的重组工程菌。 结果发现：重组工程菌
９ ｈ转化富马酸产生 １１２􀆰 ７ ｇ ／ Ｌ的 Ｌ 丙氨酸，生产速率 １２􀆰 ５ ｇ ／ （Ｌ·ｈ），转化率 ９３􀆰 ８％。 富马酸价格较低，有效降低
Ｌ 丙氨酸生产的原料成本。 通过构建重组工程菌，以富马酸为底物，高效生产 Ｌ 丙氨酸，结果表明该方法具有较
好的工业应用潜力。
关键词：Ｌ 丙氨酸；Ｌ 天冬氨酸酶；Ｌ 天冬氨酸 β 脱羧酶；重组工程菌
中图分类号：Ｑ７８　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１６）０２－０００７－０５
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｌ⁃ａｌａｎｉｎｅ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＸＵ Ｙｏｕｑｉａｎｇ１，ＭＡ Ｙｕｙｕｅ２，ＹＡＯ Ｓｕ１，ＪＩＡＮＧ Ｚｅｎｇｙａｎ２，
ＺＨＡＮＧ Ｑｉ１，ＺＨＡＮＧ Ｌｕ１，ＰＥＩ Ｊｉａｎｇｓｅｎ１，ＣＨＥＮＧ Ｃｈｉ１
（１． Ｃｈｉｎａ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００１５，Ｃｈｉｎａ；
２． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｆｕｍａｒｉｃ Ａｃｉｄ Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｙａｎｔａｉ ２６５７０９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ Ｌ⁃ａｓｐａｒｔａｔｅ⁃β⁃ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｆｒｏｍ Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ａｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ ＣＩＣＣ １１０２２Ｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ Ｌ⁃ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．
Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｌ⁃ａｌａｎｉｎｅ． Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ １１２􀆰 ７
ｇ ／ Ｌ Ｌ⁃ａｌａｎｉｎｅ ｆｒｏｍ ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ ｗｉｔｈ ａ ｒａｔｅ ｏｆ １２􀆰 ５ ｇ ／ （Ｌ·ｈ）ａｎｄ ａ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｏｆ ９３􀆰 ８％． Ｆｕｍａｒｉｃ
ａｃｉｄ ｈａｓ ａ ｌｏｗ ｐｒｉｃｅ，ｗｈｉｃｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｒｅｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｏｓｔ ｆｏｒ Ｌ⁃ａｌａｎｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｌ⁃ａｌａｎｉｎｅ ｗａｓ
ｐｒｏｄｕｃｄ ｆｒｏｍ ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ，ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｈａｄ
ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ􀆰
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｌ⁃ａｌａｎｉｎｅ；Ｌ⁃ａｓｐａｒｔａｓｅ；Ｌ⁃ａｓｐａｒｔａｔｅ⁃β⁃ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ
　 　 Ｌ 丙氨酸是一种具有重要价值的氨基酸，在医
药和食品行业应用广泛。 Ｌ 丙氨酸甜味柔和，能与
谷氨酸钠制成混合调味品，可调制并明显改善食品
风味，而不破坏食物原有的风格［１］；是合成甜味剂
阿力甜的主要原料，阿力甜的甜度是蔗糖的 ２ ０００
倍，目前已在多个国家和地区获准使用［２－３］；是合成
维生素 Ｂ６和 Ｌ 氨基丙醇（盐酸左氧氟沙星合成前
体）的重要中间体，也是营养剂补糖氨基酸营养输
液的组成成分之一［４－６］。 最近，有研究利用 Ｌ 丙氨
酸合成 Ｎ （ ９ ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ） Ｌ
ａｌａｎｉｎｅ，用于检测牛奶中的抗生素氧氟沙星
（ｏｆｌｏｘａｃｉｎ），极大提高了检测的灵敏度［７］；还有研究
将 Ｌ 丙氨酸与电子自旋共振 （ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｓｐｉｎ
ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＥＳＲ）联合用于癌症放疗剂量的评估，效
果显著［８］。
Ｌ 丙氨酸生产技术包括化学合成法、蛋白水解
提取法和微生物转化法。 其中，微生物转化法是现
在应用最广泛的 Ｌ 丙氨酸生产方法。 徐虹等［９］选
育具有高 Ｌ 天冬氨酸 β 脱羧酶活力的假单胞菌，
以 Ｌ 天冬氨酸为底物，采用游离细胞法生产 Ｌ 丙
氨酸，每升培养液可转化 Ｌ 天冬氨酸 ２􀆰 ０ ｋｇ。 现有
Ｌ 丙氨酸生产工艺以 Ｌ 天冬氨酸作为原料，Ｌ 天
冬氨酸价格较高，而且转化过程脱去羧基，造成了
碳流失，从而显著增加了生产成本。 Ｌ 天冬氨酸微
生物转化生产是利用微生物产生的 Ｌ 天冬氨酸
酶，转化底物富马酸和氨水实现的，其转化生产过
程如图 １所示。
图 １　 Ｌ 天冬氨酸和 Ｌ 丙氨酸的微生物转化生产过程
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ Ｌ⁃ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ Ｌ⁃ａｌａｎｉｎｅ
ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ
富马酸价格仅为 Ｌ 天冬氨酸的 ４０％左右，可
以有效降低原料成本。 前期有研究对产 Ｌ 天冬氨
酸酶的菌株和 Ｌ 天冬氨酸 β 脱羧酶的菌株进行
固定，利用固定化细胞以富马酸和氨水为底物，２６ ｈ
可以催化生产 １􀆰 ０５ ｍｏｌ ／ Ｌ 的 Ｌ 丙氨酸［１０］；还有研
究利用纯化的 Ｌ 天冬氨酸酶和 Ｌ 天冬氨酸 β 脱
羧酶催化富马酸生产 Ｌ 丙氨酸，但是酶的用量较
大，同时生产的效率较低，难于工业化［１１］。 克隆来
源于睾丸酮丛毛单胞菌的 Ｌ 天冬氨酸 β 脱羧酶
基因，在携带 Ｌ 天冬氨酸酶基因的大肠杆菌中异
源表达，构建重组大肠杆菌工程菌，利用双酶耦合
催化，以期实现以重组工程菌高效转化富马酸生产
Ｌ 丙氨酸的工艺技术。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 菌株和质粒
菌株 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α 购自北京全式金生
物技术有限公司，Ｅ． ｃｏｌｉ ＣＩＣＣ １１０２２Ｓ 为中国工业
微生物菌种保藏管理中心保藏菌株。 组成型质粒
ｐＥＴＰ ｔａｃ和 ｐＥＴＰ Ｔ７在前期工作中构建［１２］，ｐＥＴＤｕｅｔ １
购自 Ｎｏｖａｇｅｎ公司。
１􀆰 １􀆰 ２　 酶和试剂
限制性内切酶，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 公司。 高保真
ＤＮＡ聚合酶 Ｆａｓｔ Ｐｆｕ，北京全式金生物技术有限公
司。 Ｔ４ ＤＮＡ连接酶，ＮＥＢ 公司。 质粒提取试剂盒、
ＤＮＡ纯化试剂盒和 ＤＮＡ 回收试剂盒，天根生化科
技（北京）有限公司。 氨苄青霉素和硫酸卡那霉素，
Ｓｉｇｍａ公司。 其他化学试剂均为国产分析纯。
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 Ｌ 天冬氨酸 β 脱羧酶基因 ａｓｄ的克隆
根据 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄａｃｕｎｈａｅ ＡＴＣＣ ２１１９２ 的 Ｌ
天冬氨酸 β 脱 羧 酶 基 因 序 列 （ ＧｅｎＢａｎｋ：
ＡＢ０９１３８５􀆰 １）设计引物对 ａｓｄ􀆰 ｆ（Ｎｄｅ Ｉ） ／ ａｓｄ􀆰 ｒ（Ｘｈｏ
Ｉ）（表 １），正反向引物分别含有核酸内切酶 ＮｄｅＩ 和
ＸｈｏＩ，扩增 ａｓｄ基因。
ＰＣＲ 反 应 体 系： 模 板 ＤＮＡ （ Ｃｏｍａｍｏｎａｓ
ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ基因组） （１００ ｎｇ ／ μＬ）０􀆰 ５ μＬ，上下游引
物（２０ μｍｏｌ ／ Ｌ）各 １ μＬ，ｄＮＴＰｓ（１０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ）４ μＬ，
５× Ｆａｓｔ Ｐｆｕ Ｂｕｆｆｅｒ １０ μＬ，Ｆａｓｔ Ｐｆｕ ＤＮＡ聚合酶（２􀆰 ５
Ｕ ／ μＬ）１ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ ３３􀆰 ５ μＬ。 总体积 ５０ μＬ。
ＰＣＲ反应条件：９４ ℃预变性 ５ ｍｉｎ；９４ ℃ ３０ ｓ，
６０ ℃ ３０ ｓ，７２ ℃ １ ｍｉｎ，３０个循环；７２ ℃ ５ ｍｉｎ。
１􀆰 ２􀆰 ２　 组成型重组质粒的构建
提取载体 ｐＥＴＰ ｔａｃ、ｐＥＴＰ Ｔ７和 ｐＥＴＤｕｅｔ １，核酸
内切酶 Ｎｄｅ Ｉ和 Ｘｈｏ Ｉ分别处理载体和 ＰＣＲ 扩增的
ａｓｄ基因，切胶回收，Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶连接载体和基
因片段，构建载体 ｐＥＴＰ ｔａｃ ａｓｄ、 ｐＥＴＰ Ｔ７ ａｓｄ 和
ｐＥＴＤｕｅｔ ａｓｄ。
以 ｐＥＴＰ ｔａｃ ａｓｄ 为模板，设计引物对 Ｐｔａｃ􀆰 ｆ
（ＭｌｕＩ） ／ ａｓｄ􀆰 ｒ（ＥｃｏＲ Ｉ） （表 １）扩增 ＤＮＡ 片段 Ｐ ｔａｃ
ａｓｄ（ＰＣＲ体系和条件同 ａｓｄ基因的克隆），核酸内切
酶 Ｍｌｕ Ｉ和 ＥｃｏＲ Ｉ 处理 ＰＣＲ 扩增的 Ｐ ｔａｃ ａｓｄ，插入
载体 ｐＥＴＤｕｅｔ ａｓｄ的 Ｍｌｕ Ｉ 和 ＥｃｏＲ Ｉ，替换载体的
ｌａｃ Ｉ调控基因和 Ｔ７启动子，构建载体 ｐＥＴＰ ｔａｃ ａｓｄ
Ｐ Ｔ７ ａｓｄ，可以不经诱导，起始下游基因的表达。
１􀆰 ２􀆰 ３　 培养基
ＬＢ液体培养基（ ｇ ／ Ｌ）：酵母粉 ５，蛋白胨 １０，
ＮａＣｌ １０。 １１５ ℃灭菌 ３０ ｍｉｎ。
ＬＢ固体培养基在液体培养基基础上添加 ２０
ｇ ／ Ｌ琼脂粉。
８ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
表 １　 引物序列
Ｔａｂｌｅ １　 Ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
引物名称 引物序列（５′ ３′）
ａｓｄ􀆰 ｆ（Ｎｄｅ Ｉ） ＣＣＧＧＣＡＴＡＴＧＡＴＧＡＧＣＡＡＧＧＡＴＴＡＴＣＡＧ
ａｓｄ􀆰 ｒ（Ｘｈｏ Ｉ） ＡＴＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＣＧＣＴＴＧＴＴＣＣＣＴＴＧ
Ｐｔａｃ􀆰 ｆ（Ｍｌｕ Ｉ） ＴＴＡＡＣＧＣＧＴＡＴＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＴＣＧＴＧ
ａｓｄ􀆰 ｒ（ＥｃｏＲ Ｉ） ＧＴＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＣＧＣＴＴＧＴＴＣＣＣＴＴＧ
　 注：ｆ表示正向引物， ｒ 表示反向引物；下划线处为核酸内切酶
位点。
发酵液体培养基（ｇ ／ Ｌ）：富马酸 １０，玉米浆干粉
１０，ＭｇＳＯ４ ０􀆰 ２，ＫＨ２ ＰＯ４ １􀆰 ０，ＮａＣｌ １􀆰 ５。 氨水调节
ｐＨ ６􀆰 ５～７􀆰 ５，１１５ ℃灭菌 ３０ ｍｉｎ。
发酵固体培养基在液态培养基基础上添加 ２０
ｇ ／ Ｌ琼脂粉。
１􀆰 ２􀆰 ４　 培养方法
将基因工程菌株划线到含有 １００ ｍｇ ／ Ｌ 氨苄青
霉素或者 ５０ ｍｇ ／ Ｌ硫酸卡那霉素的 ＬＢ 培养基平板
上，（３７±１） ℃培养（１２±２） ｈ。
无菌条件下，挑取平板上的单菌落，接种到含
有 １００ ｍｇ ／ Ｌ氨苄青霉素或者 ５０ ｍｇ ／ Ｌ 硫酸卡那霉
素的发酵培养基中，（３７±１） ℃摇床培养（１２±２） ｈ，
获得基因工程菌株的菌液。
将菌液以体积分数 １􀆰 ０％接种量接种到含有
１００ ｍｇ ／ Ｌ氨苄青霉素或者 ５０ ｍｇ ／ Ｌ 硫酸卡那霉素
的发酵培养基中，（３７±１） ℃摇床 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ 培养
（１２±２）ｈ，获得基因工程菌株的发酵液。
Ｅ． ｃｏｌｉ ＣＩＣＣ １１０２２Ｓ 作为对照，以不加抗生素
的培养基进行培养。
１􀆰 ２􀆰 ５　 转化方法
不同菌株转化富马酸生产 Ｌ 丙氨酸：紫外可
见分光光度计 ６００ ｎｍ测定发酵液的吸光度，以无菌
生理盐水统一调节 Ｅ． ｃｏｌｉ ＣＩＣＣ １１０２２Ｓ、Ｅ． ｃｏｌｉ ／
ｐＥＴＰ ｔａｃ ａｓｄ、Ｅ． ｃｏｌｉ ／ ｐＥＴＰ Ｔ７ ａｓｄ 和 Ｅ． ｃｏｌｉ ／ ｐＥＴＰ ｔａｃ
ａｓｄ Ｐ Ｔ７ ａｓｄ的 ＯＤ６００为 ７􀆰 ０。 将富马酸以氨水调节
ｐＨ为 ８􀆰 ０，配制富马酸铵饱和溶液。 然后将菌液与
富马酸铵溶液以体积比 １ ∶ １进行混合，调节温度
（４５±１） ℃，转速 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ，进行转化，０ 和 １２ ｈ 分
别取样，高效液相色谱 （ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）标准曲线法测定富马酸、Ｌ
天冬氨酸和 Ｌ 丙氨酸的浓度。 以 Ｌ 丙氨酸的浓
度高低确定最优的重组菌株。
不同温度培养菌体催化生产 Ｌ 丙氨酸：将活
化的菌株以 １％接种量接种发酵培养基，（３７±１）℃
摇床 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ培养（１２±２） ｈ，然后将菌液与富马
酸铵溶液以体积比 １ ∶ １进行混合，调节温度（４５±１）
℃，转速 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ 进行转化，０ 和 １２ ｈ 分别取样，
ＨＰＬＣ标准曲线法测定富马酸、Ｌ 天冬氨酸和Ｌ 丙
氨酸的浓度。 以 Ｌ 丙氨酸的浓度高低确定最优培
养温度。
全细胞高密度催化生产 Ｌ 丙氨酸：离心收集
菌体，无菌生理盐水悬浮，制备浓度 １００ ＯＤ 的菌悬
液，然后以菌悬液与富马酸铵溶液以体积比 １ ∶ ６混
合，调节温度（４５±１） ℃，转速 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ，０、３、６、９
和 １２ ｈ分别取样，ＨＰＬＣ 标准曲线法测定富马酸、Ｌ
天冬氨酸和 Ｌ 丙氨酸的浓度。
以上催化实验均通过 ５００ ｍＬ三角瓶进行，装液
量 ５０ ｍＬ。
１􀆰 ２􀆰 ６　 分析方法
１）富马酸 ＨＰＬＣ测定条件。
样品处理：样品稀释合适倍数，０􀆰 ２２ μｍ滤膜过
滤后 ＨＰＬＣ检测。
样品检测：色谱柱为 Ｐｒｅｖａｉｌ ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄ（５ μｍ，
２５０ ｍｍ × ４􀆰 ６ ｍｍ），紫外检测器检测波长 ２１０ ｎｍ，
柱温 ３０ ℃，流速 ０􀆰 ６ ｍＬ ／ ｍｉｎ，进样量 １０ μＬ，流动相
为 ０􀆰 ０１ ｍｏｌ ／ Ｌ ＫＨ２ＰＯ４溶液（Ｈ３ＰＯ４调节 ｐＨ为 ２􀆰 ３）
与甲醇（体积比为 ９５ ∶ ５）。
２）Ｌ 天冬氨酸和 Ｌ 丙氨酸样品通过异硫氰酸
苯酯（ＰＩＴＣ）衍生定量检测。
样品衍生：样品 ４００ μＬ ＋ ０􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ 正亮氨酸溶
液 ２０ μＬ ＋ ０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ ＰＩＴＣ 乙腈溶液 ２００ μＬ ＋ １
ｍｏｌ ／ Ｌ三乙胺 乙腈溶液 ２００ μＬ，涡旋振荡混匀后室
温放置 ６０ ｍｉｎ，然后加入 ８００ μＬ 正己烷，涡旋振荡
１ ｍｉｎ，静置 １０ ｍｉｎ。 用注射器吸取下层溶液，０􀆰 ２２
μｍ滤膜过滤后 ＨＰＬＣ检测。
样品检测：色谱柱为 ＺＯＲＢＡＸ ＳＢ Ｃ１８（５ μｍ，
４􀆰 ６ ｍｍ × １５０ ｍｍ），紫外检测器设定波长为 ２５４
ｎｍ，柱温 ３８ ℃，流速设定为 ０􀆰 ６ ｍＬ ／ ｍｉｎ，进样量 １０
μＬ，流动相 Ａ 为 ０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ ｐＨ ６􀆰 ５ 的乙酸铵 乙腈
（体积比 ９７ ∶ ３）溶液，流动相 Ｂ 为乙腈溶液。 洗脱
程序为 ０ ～ ８ ｍｉｎ 流动相 Ｂ 的比例 １８％，８ ～ １６ ｍｉｎ
流动相 Ｂ的比例由 １８％梯度升高到 ８０％。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 Ｌ 天冬氨酸 β 脱羧酶基因 ａｓｄ 的克隆和表
达载体构建
　 　 以 Ｃ． ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ 基因组 ＤＮＡ 为模板，经 ＰＣＲ
９　 第 ２期 徐友强等：重组大肠杆菌转化富马酸生产 Ｌ 丙氨酸
扩增后，电泳分析，得到 １ 条约 １􀆰 ６ ｋｂ 的条带，结果
如图 ２（ａ）所示，其大小与 Ｌ 天冬氨酸 β 脱羧酶
基因 （ ａｓｄ ） 的理论大小一致。 将其插入载体
ｐＥＴＰ ｔａｃ、 ｐＥＴＰ Ｔ７ 和 ｐＥＴＤｕｅｔ １， 构建表达载体
ｐＥＴＰ ｔａｃ ａｓｄ、ｐＥＴＰ Ｔ７ ａｓｄ 和 ｐＥＴＤｕｅｔ ａｓｄ，然后以
ｐＥＴＰ ｔａｃ ａｓｄ为模板，构建 ａｓｄ 基因双拷贝的组成型
表达载体 ｐＥＴＰ ｔａｃ ａｓｄ Ｐ Ｔ７ ａｓｄ。 将载体 ｐＥＴＰ ｔａｃ
ａｓｄ、ｐＥＴＰ Ｔ７ ａｓｄ和 ｐＥＴＰ ｔａｃ ａｓｄ Ｐ Ｔ７ ａｓｄ转化大肠
杆菌 Ｅ． ｃｏｌｉ ＣＩＣＣ １１０２２Ｓ，构建基因工程菌株 Ｅ．
ｃｏｌｉ ／ ｐＥＴＰ ｔａｃ ａｓｄ、 Ｅ． ｃｏｌｉ ／ ｐＥＴＰ Ｔ７ ａｓｄ 和 Ｅ． ｃｏｌｉ ／
ｐＥＴＰ ｔａｃ ａｓｄ Ｐ Ｔ７ ａｓｄ，其单酶切验证如图 ２（ｂ）、２
（ｃ）、２（ｄ）所示。
（ａ）：Ｍ１—ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ，１—ａｓｄ基因；（ｂ）：Ｍ２—ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ，１—Ｘｈｏ Ｉ酶切处理 ｐＥＴＰ ｔａｃ，２—ｐＥＴＰ ｔａｃ ａｓｄ；（ｃ）：Ｍ２—ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ，
１—Ｘｈｏ Ｉ酶切处理 ｐＥＴＰＴ７，２—ｐＥＴＰＴ７ ａｓｄ；（ｄ）：Ｍ２—ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ，１—Ｘｈｏ Ｉ酶切处理 ｐＥＴＤｕｅｔ １，２—ｐＥＴＰ ｔａｃ ａｓｄ ＰＴ７ ａｓｄ
图 ２　 ａｓｄ基因 ＰＣＲ扩增，质粒 ｐＥＴＰｔａｃ ａｓｄ、ｐＥＴＰＴ７ ａｓｄ和 ｐＥＴＰｔａｃ ａｓｄ ＰＴ７ ａｓｄ单酶切验证
Ｆｉｇ􀆰 ２　 ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｄ，ｒｅｓｔｒｉｃａｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐＥＴＰｔａｃ ⁃ａｓｄ，ｐＥＴＰＴ７ ⁃ａｓｄ ａｎｄ ｐＥＴＰｔａｃ ⁃ａｓｄ⁃ＰＴ７ ⁃ａｓｄ
２􀆰 ２　 菌株 Ｅ． ｃｏｌｉ ＣＩＣＣ １１０２２Ｓ，Ｅ． ｃｏｌｉ ／ ｐＥＴＰｔａｃ
ａｓｄ，Ｅ． ｃｏｌｉ ／ ｐＥＴＰＴ７ ａｓｄ 和 Ｅ． ｃｏｌｉ ／ ｐＥＴＰｔａｃ
ａｓｄ ＰＴ７ ａｓｄ生产 Ｌ 丙氨酸比较
　 　 为了使工程菌株在实际工业应用中操作更加
简单，构建的基因工程菌株均为不经诱导操作、起
始下游基因表达的组成型表达基因工程菌株。 不
同菌株转化富马酸生产 Ｌ 天冬氨酸和 Ｌ 丙氨酸
结果如表 ２所示。
表 ２　 不同菌株转化富马酸生产 Ｌ 天冬氨酸和 Ｌ 丙氨酸
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ⁃ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ Ｌ⁃ａｌａｎｉｎｅ ｆｒｏｍ ｆｕｒｍａｒｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ
菌株 ＯＤ６００ ａ
ρ（富马酸） ／
（ｇ·Ｌ－１） ｂ
ρ（Ｌ 天冬氨酸） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（Ｌ 丙氨酸） ／
（ｇ·Ｌ－１）
Ｌ 丙氨酸
摩尔转化率 ／ ％
Ｅ． ｃｏｌｉ ＣＩＣＣ １１０２２Ｓ ６􀆰 ９７±０􀆰 ４５ ９２􀆰 ５２±４􀆰 ７６ １００􀆰 ９５±３􀆰 ６７ — ０􀆰 ０４
Ｅ． ｃｏｌｉ ／ ｐＥＴＰ ｔａｃ ａｓｄ ６􀆰 ７８±０􀆰 ２２ ９３􀆰 ８４±５􀆰 ０１ ６０􀆰 １２±４􀆰 ５１ ２７􀆰 ３０±２􀆰 ４０ ３７􀆰 ９０
Ｅ． ｃｏｌｉ ／ ｐＥＴＰＴ７ ａｓｄ ６􀆰 ７９±０􀆰 １５ ９１􀆰 ３６±３􀆰 ９７ ４２􀆰 ７２±１􀆰 １０ ３６􀆰 ８２ ±２􀆰 ０７ ５２􀆰 ５１
Ｅ． ｃｏｌｉ ／ ｐＥＴＰ ｔａｃ ａｓｄ ＰＴ７ ａｓｄ ７􀆰 ３８±０􀆰 ４０ ９２􀆰 ２４±５􀆰 １１ １６􀆰 ０１±３􀆰 ２５ ５４􀆰 ７６ ±２􀆰 ７２ ７７􀆰 ３４
　 注：ａ—细胞密度 ＯＤ６００为产酶发酵后的 ＯＤ值；ｂ—富马酸质量浓度为反应体系初始浓度与反应完毕残留浓度的差值。
　 　 Ｔａｋａｍａｔｓｕ等［１０］研究结果和表 ２结果均表明，组
成型表达的重组菌株可以不经诱导操作，有效地进行
异源基因表达。 重组菌株 Ｅ． ｃｏｌｉ ／ ｐＥＴＰ ｔａｃ ａｓｄ，
Ｅ． ｃｏｌｉ ／ ｐＥＴＰＴ７ ａｓｄ和 Ｅ． ｃｏｌｉ ／ ｐＥＴＰ ｔａｃ ａｓｄ ＰＴ７ ａｓｄ
均可以转化富马酸生产 Ｌ 丙氨酸。 其中，以Ｅ． ｃｏｌｉ ／
ｐＥＴＰ ｔａｃ ａｓｄ ＰＴ７ ａｓｄ生产 Ｌ 丙氨酸的能力最佳，１２
ｈ共产生 ５４􀆰 ７６ ｇ ／ Ｌ 的 Ｌ 丙氨酸，生产速率 ４􀆰 ５６
ｇ ／ （Ｌ·ｈ），同时还生产了 １６􀆰 ０１ ｇ ／ Ｌ 的 Ｌ 天冬氨酸。
与之相比，出发菌株不能产生 Ｌ 丙氨酸，１２ ｈ共生产
了 Ｌ 天冬氨酸 １００􀆰 ９５ ｇ ／ Ｌ。 以上结果表明，成功构
建得到 Ｌ 天冬氨酸酶和 Ｌ 天冬氨酸 β 脱羧酶双
酶共表达的重组菌株，实现了以富马酸为底物、生产
Ｌ 丙氨酸的工艺技术。 该结果还表明，通过增加 Ｌ
天冬氨酸 β 脱羧酶基因的拷贝数，可以提高 Ｌ 丙
氨酸的生产速率。 后续可以开展 Ｌ 天冬氨酸酶和
Ｌ 天冬氨酸 β 脱羧酶基因表达的系统优化，在不
影响细胞生长代谢的条件下，进一步提高工程菌的生
产效率。
０１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
２􀆰 ３　 重组菌株 Ｅ． ｃｏｌｉ ／ ｐＥＴＰｔａｃ ａｓｄ ＰＴ７ ａｓｄ 不
同温度培养对 Ｌ 丙氨酸转化的比较
　 　 温度对重组菌株的基因异源表达影响较大［１３］，
故对重组菌株 Ｅ． ｃｏｌｉ ／ ｐＥＴＰ ｔａｃ ａｓｄ Ｐ Ｔ７ ａｓｄ在不同
温度下进行培养，然后同一条件进行转化，考察培
养温度对重组菌株转化生产 Ｌ 丙氨酸的影响，结
果如图 ３所示。
图 ３　 温度对 Ｅ． ｃｏｌｉ ／ ｐＥＴＰｔａｃ ａｓｄ ＰＴ７ ａｓｄ
生产 Ｌ 丙氨酸的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ Ｌ⁃ａｌａｎｉｎｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｅ． ｃｏｌｉ ／ ｐＥＴＰｔａｃ ⁃ａｓｄ⁃ＰＴ７ ⁃ａｓｄ
由图 ３ 可知：３７ ℃培养 Ｅ． ｃｏｌｉ ／ ｐＥＴＰ ｔａｃ ａｓｄ
Ｐ Ｔ７ ａｓｄ，与其他培养温度相比，所得等体积发酵液
具有最高效的 Ｌ 丙氨酸转化能力。 １２ ｈ共产生Ｌ
丙氨酸 ５６􀆰 ６６ ｇ ／ Ｌ，略优于 ３０ ℃ 发酵液 （ ５２􀆰 ７７
ｇ ／ Ｌ）。 由于大肠杆菌的最适培养温度为 ３７ ℃，温
度上升，其菌体生长能力下降明显，故没有进行 ４０
℃以上培养 Ｅ． ｃｏｌｉ ／ ｐＥＴＰ ｔａｃ ａｓｄ Ｐ Ｔ７ ａｓｄ的实验。
图 ４　 Ｅ． ｃｏｌｉ ／ ｐＥＴＰｔａｃ ａｓｄ ＰＴ７ ａｓｄ全细胞
高密度生产 Ｌ 丙氨酸
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ⁃ａｌａｎｉｎｅ ｂｙ ｈｉｇｈ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｆ
Ｅ． ｃｏｌｉ ／ ｐＥＴＰｔａｃ ⁃ａｓｄ⁃ＰＴ７ ⁃ａｓｄ
２􀆰 ４　 重组菌株 Ｅ． ｃｏｌｉ ／ ｐＥＴＰｔａｃ ａｓｄ ＰＴ７ ａｓｄ 全
细胞高密度转化富马酸生产 Ｌ 丙氨酸
　 　 为进一步提高 Ｌ 丙氨酸生产效率，尝试了高
密度转化方式，结果如图 ４ 所示。 由图 ４ 可知： Ｅ．
ｃｏｌｉ ／ ｐＥＴＰ ｔａｃ ａｓｄ Ｐ Ｔ７ ａｓｄ ９ ｈ 可以转化 １５４􀆰 ３ ｇ ／ Ｌ
富马酸产生 １１２􀆰 ７ ｇ ／ Ｌ Ｌ 丙氨酸，生产速率 １２􀆰 ５
ｇ ／ （Ｌ·ｈ），转化率 ９３􀆰 ８％。
３　 结论
首次尝试通过重组菌株双酶耦合表达，实现了
以富马酸为底物、转化生产 Ｌ 丙氨酸的工艺技术，
降低了生产的原料成本。 全细胞高密度催化结果
表明，重组菌株 ９ ｈ可以转化 １５４􀆰 ３ ｇ ／ Ｌ富马酸产生
１１２􀆰 ７ ｇ ／ Ｌ Ｌ 丙氨酸，生产速率 １２􀆰 ５ ｇ ／ （Ｌ·ｈ），转
化率 ９３􀆰 ８％，表明该重组菌株具有一定的工业应用
价值。
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（责任编辑　 管　 珺）
１１　 第 ２期 徐友强等：重组大肠杆菌转化富马酸生产 Ｌ 丙氨酸