全 文 ：第７卷第５期
２００９年９月
生　物　加　工　过　程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．５
Ｓｅｐ．２００９
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１７６２－３６７８．２００９．０５．０１１
收稿日期：２００８－１１－１９
基金项目：国家科技支撑计划资助项目（２００７ＢＡＩ２６Ｂ０１）
作者简介：刘慧娟（１９８２—），女，河北沧州人，硕士研究生，研究方向：发酵工程；王丽丽（联系人），教授，Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｌｉｌｉ＠ｈｅｂｕｓｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
青霉素酶在青霉素菌渣无害化处理中的应用
刘慧娟１，王丽丽２，邓凯顺３，仪　宏１
（１．河北科技大学　生物科学与工程学院，石家庄 ０５００１８；
２．河北省发酵工程技术研究中心，石家庄 ０５００１８；
３．石药集团有限公司，石家庄 ０５００４１）
摘　要：建立一种快速、有效的方法降解青霉素菌渣中青霉素残留。采用高效液相色谱（ＨＰＬＣ）方法检测湿菌渣，
得到其平均青霉素效价残留为２１７９Ｕ／ｇ，即相对质量分数为１３ｍｇ／ｇ；将青霉素酶以相对于残留青霉素效价比为
３∶１的比例量混入菌渣中，３７℃，１ｈ后可以将残留青霉素完全降解，实现了菌渣的无害化处理，为青霉素菌渣的资
源化利用奠定了基础。
关键词：青霉素酶；青霉素菌渣；无害化处理
中图分类号：ＴＱ４６５．１　　　　文献标志码：Ａ　　　　文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０５－００５４－０４
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｅｎｉｃｉｌｉｎａｓｅｉｎｈａｒｍｌｅｓｓ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｐｅｎｉｃｉｌｉｎｓｌａｇ
ＬＩＵＨｕｉｊｕａｎ１，ＷＡＮＧＬｉｌｉ２，ＤＥＮＧＫａｉｓｈｕｎ３，ＹＩＨｏｎｇ１
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＨｅｂｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ０５００１８，Ｃｈｉｎａ；
２．ＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｆｏｒＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＨｅｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ０５００１８，Ｃｈｉｎａ；
３．ＳｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＧｒｏｕｐ，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ０５００４１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｇｒａｄｉｎｇｔｈｅｐｅｎｉｃｉｌｉｎｒｅｓｉｄｕｅｉｎｔｈｅｐｅｎｉｃｉｌｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓｌａｇｗａｓｕｓｅｄ．
ＨＰＬＣ（ＨｉｇｈＰｒｅｓｓｕｒｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）ｍｅｔｈｏｄｆｏｒｐｅｎｉｃｉｌｉｎｃｏｎｔｅｎｔｉｎｔｈｅｗａｓｔｅｓｌａｇｗａｓｅｓ
ｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｅｎｉｃｉｌｉｎｃｏｎｔｅｎｔｉｎｔｈｅｗｅｔｓｌａｇｗａｓ２１７９Ｕ／ｇ，ｏｒ１３ｍｇ／ｇ，
ｂｙａｖｅｒａｇｅ．Ｔｈｅｒｅｓｉｄｕｅｐｅｎｉｃｉｌｉｎｉｎｔｈｅｓｌａｇｗａｓｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｄｅｇｒａｄｅｄａｔ３７℃ ｆｏｒ１ｈｗｉｔｈ３ｔｉｍｅｓｏｆ
ｐｅｎｉｃｉｌｉｎａｓｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｅｎｉｃｉｌｉｎａｓｅ；ｐｅｎｉｃｉｌｉｎｓｌａｇ；ｈａｒｍｌｅｓｓｔｒｅａｔｍｅｎｔ
　　我国是青霉素生产大国，每年有超过１万 ｔ的
青霉素干菌渣产生。其中无毒无害的有效资源占
青霉素干菌渣总质量的９９９％，可被进一步回收利
用。因占质量分数仅为 ０１％的抗生素无法被分
解，青霉素干菌渣被禁止循环使用。目前，对菌丝
废渣的处理，还在寻求妥善的处置途径，部分厂家
将废菌丝送焚烧厂进行焚烧，以达到无害化处
理［１］。这样不仅容易造成环境污染，也会直接导致
资源的浪费和潜在经济损失。采用其他方法处理
青霉素干菌渣中的残留青霉素也未被报道。
笔者所在实验室筛选的１株高产青霉素酶的蜡
状芽孢杆菌 ｋｄ ０２。因其能专一水解青霉素的
β内酰胺环，使青霉素变成无抗菌活性的青霉噻唑
酸［２］，继而可实现菌渣的无害化处理，为回收青霉
素菌渣奠定了基础。
１　材料与方法
１１　材料
１１１　菌株
蜡状芽孢杆菌ｋｄ ０２，本实验室筛选。
１１２　斜面培养基
蛋白胨１５０ｇ，甘油５００ｇ，ＮａＣｌ４０ｇ，０１％
ＦｅＳＯ４（ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ）溶液０５ｍＬ，柠檬酸钠５８８ｇ，
２０％ ＭｇＳＯ４（ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ）１ｍＬ，Ｋ２ＨＰＯ４４０ｇ，牛
肉膏３０ｇ，将上述各组分混合加水配成１０００ｍＬ溶
液，调ｐＨ至７０～７２，分装于５００ｍＬ锥形瓶内，每
瓶８０ｍＬ，在１１５℃灭菌３０ｍｉｎ。
１１３　青霉素菌渣
石药集团河北中润制药有限公司提供。
１２　方法
青霉素菌渣总Ｎ的测定，方法参考文献［３］。
青霉素菌渣总Ｐ的测定，方法参考文献［４］。
青霉素菌渣总Ｋ的测定，方法参考文献［５］。
１３　青霉素酶的制备
取蜡状芽孢杆菌的斜面培养物，接入种子培养
基，２８℃摇床培养１８ｈ，接入发酵培养基，接种量
１０％，同时每瓶加入无菌青霉素 ０５万单位，在
２８℃摇床培养２４ｈ，再加无菌青霉素１万单位，培
养 ４８ｈ，再加无菌青霉素 １５万单位，７２ｈ发酵结
束，离心收集上清液，再经０４５、０２２μｍ膜过滤，
滤液为无菌青霉素酶液，４℃贮存备用。
１４　青霉素酶的检测
青霉素酶活定义为：在３７℃的水浴下，１ｍＬ酶
液１ｈ内降解的青霉素差值效价单位数。
１４１　青霉素钠标准曲线
取１０ｇ青霉素钠溶于柠檬酸钠 盐酸缓冲
液，用１００ｍＬ容量瓶定容。从母液中分别取 ５０、
１００、１５０、２００、２５０、３００μＬ加缓冲液至１ｍＬ。分
别加入０１２５ｍｏｌ／Ｌ中性羟胺１ｍＬ和 ９５％乙醇
１０ｍＬ反应３ｍｉｎ后，加入０２５ｍｏｌ／Ｌ硫酸铁铵
２０１ｍＬ，待反应液中气泡消失后测 ＯＤ值［５］。
用 ＯＤ值作纵坐标，青霉素钠作横坐标绘制标准
曲线。
１４２　青霉素酶活力的检测
将酶稀释液（５０００～６０００Ｕ／ｍＬ）１ｍＬ与青霉
素钠溶液（５０００Ｕ／ｍＬ）２ｍＬ混合，在３７℃恒温水
浴中反应１ｈ。反应结束后，取１ｍＬ试样，其他步骤
与青霉素标准曲线的步骤一样，测 ＯＤ值 Ａ，根据标
准曲线得出青霉素钠的效价Ｃ。反应前青霉素效价
检测是将酶稀释液换成去离子水１ｍＬ，其他步骤与
上述方法一样，测ＯＤ值Ｂ，根据标准曲线得出青霉
素钠的效价Ｄ。
１５　高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）检测青霉素菌渣中
青霉素的降解
１５１　ＨＰＬＣ检测青霉素菌渣中残留青霉素的色
谱条件
Ｎ２０１０色谱工作站；ＡｐｏｌｏＣ１８色谱柱５μｍ，
４６ｍｍ×２５ｃｍ；流动相 Ｖ（乙腈）∶Ｖ（磷酸二氢
钾）＝２６∶７４；流速１５ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长２２５ｎｍ；灵
敏度００１ＡＵＦＳ；柱温 （２６±１）℃；进样量２０μＬ。
１５２　青霉素钠标准曲线的制作
准确称取青霉素钠对照品１０ｇ，置于５０ｍＬ
容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，配成含青霉
素钠 ２０ｍｇ／ｍＬ的溶液作为贮备液。分别精密吸
取该贮备液 １２５、２５、５、７５ｍＬ，各置于５０ｍＬ
容量瓶中，用水稀释至刻度，即得系列对照品溶
液。经０２２μｍ微孔滤膜过滤，用 ＨＰＬＣ测其吸
收峰面积，以测定的吸收峰（Ａ）为纵坐标，相对
应的青霉素钠质量浓度（ｍｇ／ｍＬ）为横坐标，绘制
出标准曲线。
１５３　青霉素酶降解青霉素菌渣后残留青霉素的
检测
取青霉素菌渣５００ｇ，加纯净水７５０ｍＬ搅拌均
匀，室温放置１５ｍｉｎ，加入已知浓度的酶量适量，反
应１ｈ后，９０００ｒ／ｍｉｎ离心，上清液经０２２μｍ微孔
滤膜过滤后，ＨＰＬＣ检测滤液中的残留青霉素
效价。
２　结果与讨论
２１　青霉素菌渣中残留青霉素及 Ｎ、Ｐ、Ｋ的检测
结果
　　对２００８年７月 ～２００８年９月石药集团河北中
润制药有限公司的提供的５批青霉素菌渣进行了测
定，结果如表１。
由表１可知：青霉素湿菌渣中平均青霉素效价
残留为２１７９Ｕ／ｇ，约为１３ｍｇ／ｇ；菌渣中含有丰富
的Ｎ、Ｐ、Ｋ，如果青霉素菌渣经无害化处理，青霉素
被降解后，将是一种良好的资源。
５５　第５期 刘慧娟等：青霉素酶在青霉素菌渣无害化处理中的应用
表１　青霉素菌渣中残留青霉素及Ｎ、Ｐ、Ｋ测定结果
Ｔａｂｌｅ１　ＳｕｍｍａｒｙｏｆｔｈｅＮ、Ｐ、Ｋｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅ
ｐｅｎｉｃｉｌｉｎｕｎｉｔｉｎｔｈｅｐｅｎｉｃｉｌｉｎｓｌａｇ
批
次
ｗ（菌渣）／
％
青霉素
（湿）酶活／
（Ｕ·ｇ－１）
ｗ（Ｎ）／
％
ｗ（Ｐ）／
％
ｗ（Ｋ）／
％
１ ２５０６ ２３８８ ８６８ ５７７ ３３８
２ ２２９８ １８６９ ９４５ ９８９ ２８３
３ ２１５３ ２００８ １０７４ ８６２ ４２０
４ １９０８ １９３７ ６５３ ７３２ １３４
５ ２２６３ ２６９５ ９３４ ６１８ ２４１
平均 ２２２６ ２１７９ ８９５ ７５６ ２８３
２１１　青霉素钠标准曲线的制备
根据方法１５中青霉素钠标准曲线的测定，得
青霉素钠的标准曲线见图１（１ｍｇ青霉素钠的效价
为１６７０Ｕ）。
图１　青霉素钠标准曲线
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｏｆｐｅｎｉｃｉｌｉｎｓｏｄｉｕｍ
以质量浓度（ｙ）对峰面积（ｘ）进行回归，得回归
方程为ｙ＝００３４７ｘ（Ｒ２＝０９９９８０）。结果表明，青
霉素检测质量浓度在０５～３ｍｇ／ｍＬ时，峰面积与质
量浓度呈良好的线性关系。
通过ＨＰＬＣ测得青霉素的峰面积 ｘ，青霉素效
价单位为
Ｗ＝ｙ×１６７０×２５＝００３４７ｘ×１６７０×２５
式中：Ｗ为青霉素效价 Ｕ／ｇ；ｙ为青霉素质量浓度
μｇ／ｍＬ；ｘ为青霉素对应的峰面积；１６７０为１μｇ青
霉素效价单位；２５为青霉素菌渣的稀释倍数。
２１２　青霉素酶的用量选择
１）青霉素酶的检测
根据方法１４中的测定方法，得到以青霉素效
价单位为横坐标，ＯＤ值为纵坐标的标准曲线：
ｙ＝００００２ｘ＋０００９５（Ｒ２＝０９９９７）
根据方法 １４中青霉素酶定义，其酶活可表
示为
Ｕ＝（Ｄ－Ｃ）×３×Ｎ＝（Ｂ－Ａ－０００９５）×３×
５０００×Ｎ
式中：Ｕ为青霉素酶比酶活；３为１ｍＬ酶稀释液加入
到２ｍＬ青霉素钠溶液中，故青霉素酶又稀释了 ３
倍；５０００为青霉素标准曲线的斜率的倒数；Ｎ为酶
的稀释倍数。
利用此方法，检测青霉素酶的比酶活，４℃保藏
备用。
２）青霉素酶降解青霉素钠标准品
将青霉素酶稀释液与配好的青霉素钠标准溶
液（５０００Ｕ／ｍＬ）以效价比１∶１、３∶１、５∶１、１０∶１混合，
参考方法中的高效液相法检测青霉素的方法，测定
青霉素效价，结果如表２所示。
表２　青霉素酶降解青霉素钠标准品
Ｔａｂｌｅ２　Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｐｅｎｉｃｉｌｉｎｓｏｄｉｕｍｗｉｔｈｔｈｅ
ｐｅｎｉｃｉｌｉｎａｓｅ
青霉素酶与青
霉素标准品效
价比
１ｈ后
青霉素比酶活／
（Ｕ·ｍＬ－１）
２ｈ后
青霉素比酶活／
（Ｕ·ｍＬ－１）
１∶１ ０ ０
３∶１ ０ ０
５∶１ ０ ０
１０∶１ ０ ０
３）青霉素酶降解青霉素菌渣
采用石药集团河北中润制药有限公司提供的８
月１５号的青霉素菌渣进行检测，其初始青霉素效价
为１９３７Ｕ／ｇ，将酶稀释液与青霉素菌渣以效价比
１∶１、３∶１、５∶１、１０∶１混合，参考高效液相法检测青霉
素的方法，测定青霉素效价，结果见表３。
表３　青霉素酶降解菌渣中的青霉素
Ｔａｂｌｅ３　Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｐｅｎｉｃｉｌｉｎｉｎｔｈｅｐｅｎｉｃｉｌｉｎ
ｓｌａｇｗｉｔｈｔｈｅｐｅｎｉｃｉｌｉｎａｓｅ
青霉素酶与菌
渣中青霉素效
价比
１ｈ后
青霉素比酶活／
（Ｕ·ｍＬ－１）
２ｈ后
青霉素比酶活／
（Ｕ·ｍＬ－１）
１∶１ ６０５ ２１７
３∶１ ０ ０
５∶１ ０ ０
１０∶１ ０ ０
６５ 生　物　加　工　过　程　　 第７卷　
　　由表３可见：青霉素酶与青霉素效价比为１∶１时
不能完全降解，可能是青霉素在提取产生菌渣的过程
中添加的有机溶剂等抑制因子抑制了青霉素酶活力
或者是由于菌渣反应在室温（２５℃）下进行，温度影
响了酶的活力，考虑到生产的安全性，采用青霉素酶
稀释液与青霉素菌渣以效价比３∶１混合，可以安全的
保障青霉素菌渣中的青霉素完全降解。
　　由图２、图３可以看出，采用青霉素酶稀释液与
青霉素以３∶１的效价比混合后反应１ｈ，菌渣中的青
霉素残留被完全降解。
图２　青霉素菌渣中青霉素的检测图谱
Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅｏｒｉｇｉｎａｌｍａｐｏｆｐｅｎｉｃｉｌｉｎｉｎｐｅｎｉｃｉｌｉｎｓｌａｇ
图３　青霉素酶降解１ｈ后的青霉素菌渣中青霉素的图谱
Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅｍａｐｏｆｐｅｎｉｃｉｌｉｎｉｎｐｅｎｉｃｉｌｉｎｓｌａｇ
ｗｉｔｈｔｈｅＰｅｎｉｃｉｌｉｎａｓｅｆｏｒ１ｈ
２２　成本计算
以青霉素酶效价５００万Ｕ／ｍＬ计算，每处理１ｔ
的青霉素湿菌渣，需要酶液１２Ｌ，加上其他操作，处
理１ｔ不超过５元，而且不残留任何有毒有害物质，
不产生二次污染，经济且环保。
２３　青霉素酶的存放稳定性
检测了青霉素酶分别在４、２５、３７℃保存３０ｄ
的酶活力变化，结果见表４。
由表４得知：青霉素酶在２５℃以下保存 １个
月，酶活可保持在９２％以上，说明青霉素酶的稳定
性很好。
表４　青霉素酶的存放稳定性
Ｔａｂｌｅ４　Ｔｈｅｓｔｏｒａｇｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｐｅｎｉｃｉｌｉｎａｓｅ
时间／ｄ
稳定性／％
４℃ ２５℃ ３７℃
０ １０００ １０００ １０００
１ ９９７ ９８６ ９７４
７ ９８５ ９７８ ９４５
１５ ９７５ ９６５ ８７１
３０ ９６５ ９２４ ７５８
３　结　论
采用以青霉素酶与残留青霉素效价比３∶１的比
例，３７℃降解１ｈ，可完全降解残留青霉素。而且发
酵生产青霉素酶液成本低，青霉素酶稳定、无毒、效
果好，本身也含有丰富的营养物质。因此采用青霉
素酶降解菌渣中青霉素残留，把“危险物”变成了营
养物，从而可以作为蛋白饲料的原料来源再加工生
产，为青霉素菌渣的资源化利用奠定了基础。
参考文献：
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ｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙ，２００８（５）：２２２４．
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定方法［Ｓ］．北京：中国标准出版社，２００３．
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中钾含量的测定原子吸收光谱法［Ｓ］．北京：中国标准出版
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ＷｕＺｈｉｑｉｎｇ，ＳｏｎｇＬｕｈｕａ，ＷａｎｇＹｉｎｇ，ｅｔａｌ．Ａｎｉｍｐｒｏｖｅｄｈｙｄｒｏｘ
ｙｌａｍｉｎｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｐｅｎｉｃｉｌｉｎｓａｓｓａｙ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｔｉ
ｂｉｏｔｉｃｓ，１９９０，１５（５）：３６３３６８．
７５　第５期 刘慧娟等：青霉素酶在青霉素菌渣无害化处理中的应用