全 文 ： 万方数据
2007年8月 冯文亮等：青霉素酶发酵液的预处理和酶学特性的研究 ·49·
案，并取得了较好的效果，为大规模制备青霉素酶
提供了技术支持，同时对蜡状芽孢杆菌产生青霉素
酶的酶学性质进行了研究。
1材料与方法
1．1 材料
(1)菌株蜡状芽孢杆菌CMCC(B)63301(购
于中国药品生物制品检定所)。
(2)培养基蛋白胨15g／L，甘油50∥L，氯化
钠4∥L，质量分数0．1％FeSO。·7H：0溶液O．5
mL，柠檬酸钠5．88∥L，质量分数20％MgSO。·
7H：O溶液1mL，磷酸氢二钾4g／L，牛肉浸膏3
g／L，定溶1000mL，pH7．0～7．2，分装于500mL锥
形瓶内，每瓶80mL，在115℃灭菌30min。
(3)无菌检验培养基肉汤培养基。
(4)无菌检验方法取青霉素酶溶液0．1mL，
涂肉汤培养基上，37℃培养24h，检验是否无菌。
(5)磷酸盐缓冲溶液(pH4．5～9．5)。
(6)絮凝剂I、Ⅱ、Ⅲ(本实验室自制)。
(7)青霉素钠(华北制药股份有限公司)。
(8)膜材料水膜(孔径0．45斗m与0．22¨m，
直径50mm)。
1．2方法
1．2．1青霉素酶发酵液的制备
取蜡样芽孢杆菌(CMCC(B)63301)的斜面培
养物，接种培养基内，在25℃摇床培养18h后，取
此培养物接种于发酵瓶培养基内，接种量体积分数
10％，同时每瓶加入无菌青霉素4500单位，在25℃
摇床培养24h，再加无菌青霉素2万单位，继续培养
24h，再加无菌青霉素2万单位，继续培养24h，添
加絮凝剂后，离心4500r／min，然后上清液在0．45
斗m的水膜过滤，最后在无菌条件下0．22斗m水膜
过滤。分装于适宜容器内，在10℃以下贮存，备用。
1．2．2青霉素酶酶活性的测定
将酶稀释液(8000～12000IU／mL)与配好的青
霉素溶液(1000单位／mL)以体积比1：2混合，在37
℃恒温水浴中反应1h，然后取出3mL反应液加入到
25mL的碘水(0．01mol／L)，置100mL容量瓶中，用
醋酸钠缓冲液(pH4．5)稀释定容，暗处放置215min。
再用硫代硫酸钠溶液(0．01mol／L)滴定为反应完的
碘，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消
失。所得值记为A。此外还有空白试验，即将酶稀释
液与青霉素都预热1h，然后取2mL青霉素与1mL
酶液加入到25mL的碘水中暗处放置15min。再用
硫代硫酸钠溶液(0．01mol／L)滴定为反应完的碘。
所得值记为曰。根据公式求的酶活。
E=(曰一4)×M×FXD×100
式中：E为青霉素酶活力；D为青霉素酶溶液的稀释
倍数，本文中为1，只测其相对酶活；M为硫代硫酸
钠滴定液的浓度，mot／L；F为在相同条件下，每1
mL的上述碘滴定液相当于青霉素的效价，为742。
其中青霉素与青霉素酶的稀释液用磷酸盐缓
冲溶液(pH7．0)。
酶活单位定义为上述反应条件下，每小时转化
1单位青霉素钠所需的酶量。
1．2．3过量底物下酶促反应曲线的测定
用紫外分光光度计测量溶液中青霉素钠的浓
度，先制作不同青霉素钠浓度与吸光度值的标准曲
线。青霉素钠溶液与青霉素酶溶液以体积比2：1比
例混合，37℃恒温反应。间隔1min读吸光度值一
次，在标准曲线下读取青霉素钠盐的含量。
2结果与分析
2．1 常规无菌青霉素酶酶液的制备
斜面种子_活化_种子培养一发酵培养一发
酵液_÷离心_上清液—加．45斗m膜过滤—加．22斗m
膜过滤一+过滤液无菌检验
2．2 改进无菌青霉素酶酶液的制备
斜面种子斗活化_÷种子培养一发酵培养_发
酵液。离心_上清液_絮凝剂预处理_常规抽滤
斗滤液—灯．45斗m膜过滤—岫．22斗m膜过滤_过滤
液无菌检验
由于菌体芽孢形成，许多胞内大分子内含物释
放到培养基中，使得常规的膜过滤除菌过程相当困
难，1 L酶液需要10h或更长的时间才能处理完，为
了解决这一难题，我们采用添加絮凝剂的方法。本
实验室研制了3种不同特性复合絮凝剂，其编号为
絮凝剂I、Ⅱ、Ⅲ，分别进行实验，发酵液处理为1
L，结果如图1、2、3所示。发现絮凝剂Ⅲ性能优良，1
L的发酵液，添加20g絮凝剂Ⅲ，调pH值7．0，而且
酶活损失仅5％。该絮凝剂加入发酵液中，通过调
节pH值，使絮凝剂与菌体及菌体内含释放物结合，
形成絮状物，提高了过滤速率。同时该絮凝剂具有
环境友好型的特性，不会给环境带来污染。而未加
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