全 文 ：第 １３卷第 ４期
２０１５年 ７月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ４
Ｊｕｌ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０４􀆰 ０１３
收稿日期：２０１４－１０－２２
作者简介：扶文君（１９９０—），女，江苏宜兴人，硕士，研究方向：植物细胞工程；袁丽红（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｙｕａｎｌｉｈｏｎｇ＠ ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ
磷对悬浮培养的西红花细胞生长和色素合成的影响
扶文君，袁丽红，施金晶
（南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 ２１１８１６）
摘　 要：研究了磷对悬浮培养的西红花细胞生长、色素合成和主要营养物质吸收利用的影响。 结果表明：不同初始
磷浓度 （低磷 ０􀆰 ２７２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ、中磷 ０􀆰 ５４４ ｍｍｏｌ ／ Ｌ、高磷 ０􀆰 ８１６ ｍｍｏｌ ／ Ｌ） 下西红花细胞均经历延滞期（０～ ３ ｄ）、快速
生长期（低、中磷 ３～１５ ｄ，高磷 ３～１２ ｄ）、稳定期（低、中磷 １５～２１ ｄ，高磷 １２～１８ ｄ）和衰亡期（低、中磷 ２１～ ３９ ｄ，高
磷 １８～３９ ｄ）这 ４个阶段，生长曲线呈 Ｓ形。 培养过程中比生长率呈下降趋势，磷对比生长率有一定影响。 培养前
９ ｄ高磷下比生长率最高，中磷次之，９ ｄ 后高磷下的比生长率快速下降，中磷最高。 进入快速生长期色素开始合
成，到衰亡期色素仍继续合成，并且色素含量达到最高，随后色素开始降解，含量下降，色素合成期比细胞生长期
长。 因此，西红花细胞培养过程中色素合成与细胞生长不完全同步，属于部分耦联型。 培养过程中色素比合成率
呈上升趋势，磷对色素比合成率有一定影响。 中磷浓度下色素比合成率最高。 在快速生长期前期（６ ｄ）质量分数
９５％蔗糖被降解为葡萄糖和果糖而被细胞吸收利用，培养 １８ ｄ时质量分数 ８５％葡萄糖被吸收利用，２１ ｄ 时质量分
数 ８５％果糖被细胞吸收利用。 培养 ３ ｄ 时胞外质量分数 ９５％ ＮＨ＋４被细胞迅速吸收利用，而 ＮＯ
－
３吸收利用较为缓
慢，２１ ｄ时质量分数 ８０％ ＮＯ－３吸收利用。 提高初始磷浓度，果糖和 ＮＯ
－
３的吸收利用速率亦随之提高，同时发现提高
ＮＯ－３的吸收利用速率是提高色素合成能力的关键，高磷条件下细胞对 ＮＯ
－
３的吸收利用速率显著提高。 稳定期后期
８０％以上的营养物质被吸收利用，Ｃ、Ｎ源的不足影响了细胞生长，但对色素合成影响不大。
关键词：西红花；悬浮培养；磷；细胞生长；色素合成；营养物质吸收
中图分类号：Ｑ９４３􀆰 １　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０４－００６８－０７
Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｐｉｇｍｅｎｔ ｂｉｏｓｙｎｔｈｓｉｓ ｉｎ ｃｅｌｌ
ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｃｒｏｃｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．
ＦＵ Ｗｅｎｊｕｎ，ＹＵＡＮ Ｌｉｈｏｎｇ∗，ＳＨＩ Ｊｉｎｊｉｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８１６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ， ｐｉｇｍｅｎｔ ｂｉｏｓｙｎｔｈｓｉｓ ａｎｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ
ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｃｒｏｃｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ． ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｉｔｉａｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ （ ｌｏｗ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ０􀆰 ２７２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ， ｍｉｄｄｌｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ０􀆰 ５４４
ｍｍｏｌ ／ Ｌ，ｈｉｇｈ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ０􀆰 ８１６ ｍｍｏｌ ／ Ｌ） ｔｈｅ ｓａｆｆｒｏｎ ｃｅｌｌｓ ａｌｌ ｗｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｆｏｕｒ ｐｈａｓｅｓ： ｌａｇ ｐｈａｓｅ
（０－３ ｄ），ｒａｐｉｄ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ（ ｌｏｗ ａｎｄ ｍｉｄｄｌｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３－１５ ｄ，ｈｉｇｈ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３－１２ ｄ），ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ
ｐｈａｓｅ（ｌｏｗ ａｎｄ ｍｉｄｄｌｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ １５－２１ ｄ，ｈｉｇｈ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ １２－１８ ｄ） ａｎｄ ｄｅｃｌｉｎｅ ｐｈａｓｅ（ ｌｏｗ ａｎｄ ｍｉｄｄｌｅ
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ２１－３９ ｄ，ｈｉｇｈ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ １８－３９ ｄ）． Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅｓ ｗｅｒｅ ａｌｌ Ｓ ｓｈａｐｅｓ． Ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ，
ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｔｕｒｎｅｄ ｔｏ ｄｅｃｒｅａｓｅ，ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｈａｄ ａ ｃｅｒｔａｉｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ． Ｉｎ ｔｈｅ
ｆｉｒｓｔ ９ ｄａｙｓ， ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｓｔ ａｔ ｈｉｇｈ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｍｉｄｄｌｅ
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ． Ｔｈｅｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｒａｐｉｄｌｙ ａｔ ｈｉｇｈ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｍｉｄｄｌｅ
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ． Ｐｉｇｍｅｎｔ ｂｉｏｓｙｎｔｈｓｉｓ ｓｔａｒｔｅｄ ａｔ ｒａｐｉｄ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ． Ａｔ ｄｅｃｌｉｎｅ ｐｈａｓｅ，ｐｉｇｍｅｎｔ
ｂｉｏｓｙｎｔｈｓｉｓ ｓｔｉｌｌ ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ，ａｎｄ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｐｉｇｍｅｎｔ ｃｏｎｔｅｎｔ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ． Ｔｈｅｎ ｐｉｇｍｅｎｔ ｓｔａｒｔｅｄ ｔｏ
ｄｅｇｒａｄｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ． Ｐｉｇｍｅｎｔ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐｈａｓｅ ｗａｓ ｌｏｎｇｅｒ ｔｈａｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ．
Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ，ｐｉｇｍｅｎｔ ｂｉｏｓｙｎｔｈｓｉｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｆｕｌｌｙ ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｄ． Ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ
ｍｉｘｅｄ⁃ｇｒｏｗｔｈ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ． Ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ， ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｏｓｙｎｔｈｓｉｓ ｒａｔｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ， ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｈａｄ ａ
ｃｅｒｔａｉｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｏｓｙｎｔｈｓｉｓ ｒａｔｅ． Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｏｓｙｎｔｈｓｉｓ ｒａｔｅ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｓｔ ａｔ ｍｉｄｄｌｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ． Ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ，ａｔ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｏｆ ｒａｐｉｄ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ（６ ｄ） ９５％ ｓｕｃｒｏｓｅ ｗａｓ ｄｅｇｒａｄｅｄ ｔｏ
ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｆｒｕｃｔｏｓｅ． Ｔｈｅｎ ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ａｂｓｏｒｂｅｄ． Ａｔ １８ｔｈ ｄａｙ ８５％ ｇｌｕｃｏｓｅ ｗａｓ ａｂｓｏｒｂｅｄ ａｎｄ ａｔ ２１ｔｈ ｄａｙ
ｆｒｕｃｔｏｓｅ ｗａｓ ａｂｓｏｒｂｅｄ． ９５％ ＮＨ＋４ ｗａｓ ａｂｓｏｒｂｅｄ ｒａｐｉｄｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ３ ｄａｙｓ． ＮＯ
－
３ ｗａｓ ａｂｓｏｒｂｅｄ ｓｌｏｗｌｙ ａｎｄ
８０％ ＮＯ－３ ｗａｓ ａｂｓｏｒｂｅｄ ａｔ ２１ｔｈ ｄａｙ． Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｆｒｕｃｔｏｓｅ ａｎｄ ＮＯ
－
３
ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ ａｌｓｏ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ． Ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ，ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ＮＯ－３ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｂｅ ｔｈｅ
ｋｅｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｐｉｇｍｅｎｔ ｂｉｏｓｙｎｔｈｓｉｓ ａｂｉｌｉｔｙ． ＮＯ－３ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ａｔ ｈｉｇｈ
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ． Ａｔ ｔｈｅ ｅｎｄ ｏｆ ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ，ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ８０％ ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ａｂｓｏｒｂｅｄ． Ｔｈｅ ｌａｃｋ
ｏｆ ｃａｒｂｏｎ ａｎｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ，ｂｕｔ ｈａｄ ｌｉｔｔｌｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｐｉｇｍｅｎｔ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： Ｃｒｏｃｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．； ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ； ｐｈｏｓｐｈａｔｅ； ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ； ｐｉｇｍｅｎｔ ｂｉｏｓｙｎｔｈｓｉｓ；
ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ
　 　 西红花（Ｃｒｏｃｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．）为鸢尾科植物，作为
药用植物、珍贵调味剂、香料和染料具悠久历史［１］。
现代药理学研究表明西红花柱头提取物及其提纯
组分西红花素、西红花苦素、西红花酸等在抗肿
瘤［２］、免疫调节［３］、治疗心脑血管系统疾病［４］以及
抗抑郁［５］等方面具有良好功效。 因此，西红花已成
为新药开发的热点。
传统栽培条件下西红花主要以球茎繁殖，但球
茎繁殖系数低，退化现象严重，导致西红花种源严
重缺乏，并且西红花的有效成分主要集中于柱头，
柱头产量极低。 利用植物细胞培养技术大规模生
产西红花素等药理活性物质，是解决西红花资源短
缺的有效方法之一。
国内外有学者先后开展了西红花细胞培养生
产西红花色素的研究工作并取得一定进展。 Ｃｈｅｎ
等［６－８］以西红花芽、叶和花为外植体进行愈伤组织
诱导，并从 ２２９株细胞系中筛选出生长快，不易褐化
的细胞系 Ｃｏｒｍ１，发现西红花素 １（Ｃｒｏｃｉｎ）含量为
１􀆰 ６７７ ｍｇ ／ ｇ，并采用了气升式反应器和鼓泡塔式反
应器对西红花细胞液体悬浮培养生产西红花素进
行了初步研究。 Ｖｉｓｖａｎａｔｈ 等［９］以花芽为外植体，在
含 ０􀆰 ５ ｍｇ ／ Ｌ激动素 ＫＴ和 ２ ｍｇ ／ Ｌ ２，４ 二氯苯氧乙
酸的 ＭＳ培养基上诱导获得红色球状愈伤组织和柱
头状物，发现愈伤组织中西红花苦素的含量高于天
然柱头，西红花醛的含量与天然柱头中含量相当，
而西红花素的含量却低于天然柱头。
对植物细胞悬浮培养过程中细胞生长、产物形
成和营养物质消耗动态规律的认识对于优化和控
制培养过程具有重要意义。 陈书安等［１２］对西红花
悬浮培养动力学的研究发现，悬浮培养时细胞的生
长周期约为 ２０ ｄ，在 ２０ ｄ 时生物量达到最大，为
１２􀆰 ３ ｇ ／ Ｌ，但是西红花素的合成周期大约为 ２８ ｄ，在
２８ ｄ 时西红花素的含量和产量达到最大，分别为
９５􀆰 ８ ｍｇ ／ ｇ 和 ０􀆰 ９２ ｇ ／ Ｌ，西红花素的积累与细胞的
生长之间的关系为部分耦联型。
在植物细胞培养过程中培养基组分是影响细
胞生长和代谢产物合成的主要因素。 磷是构成核
酸和磷脂的主要成分，也可用于合成高能磷酸化物
ＡＴＰ。 因此，磷对能量代谢、细胞生长及代谢产物合
成具有主要的调节作用［１３］。 较高浓度的磷能促进
细胞生长，但会抑制次级代谢产物的合成，可能是
由于多数次级代谢产物是通过磷酸化的中间产物
合成的，而磷抑制了磷酸酶的活性［１４］。 Ｃｕｒｔｉｓ 等［１５］
研究发现罂粟细胞生长速率与胞内磷水平有关。
本文研究了不同初始磷浓度对悬浮培养西红花细
胞生长、色素合成以及营养物质消耗规律的影响，
以期为西红花细胞培养生产西红花色素奠定基础。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
以无菌芽为外植体诱导和筛选得到的性状优
良细胞系 Ｓ２［１６］。
９６　 第 ４期 扶文君等：磷对悬浮培养的西红花细胞生长和色素合成的影响
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
１􀆰 ２　 培养方法
将 ＭＳ 培养基（附加 ２ ｍｇ ／ Ｌ 萘乙酸、０􀆰 ５ ｍｇ ／ Ｌ
６ ＢＡ、３０ ｇ ／ Ｌ 蔗糖，６􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ 琼脂，灭菌前调 ｐＨ
６􀆰 ０～６􀆰 １）上培养 ３０ ｄ的西红花细胞接种于 ３种不同
初始磷浓度（低磷 ０􀆰 ２７２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ、中磷 ０􀆰 ５４４ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
和高磷 ０􀆰 ８１６ ｍｍｏｌ ／ Ｌ）的 １／ ２Ｂ５培养基（ＫＮＯ３、ＦｅＳＯ４·
７Ｈ２Ｏ、（ＮＨ４）２ＳＯ４和 ＮａＨ２ＰＯ４·Ｈ２Ｏ减半，附加 ２ ｍｇ ／ Ｌ
吲哚 ３ 乙酸、０􀆰 ５ ｍｇ ／ Ｌ ６ 苄氨基嘌呤和 ２０ ｇ ／ Ｌ 蔗
糖，灭菌前调 ｐＨ ６􀆰 ０～６􀆰 １）中，１００ ｍＬ培养基接种 １５ ｇ
鲜细胞，（２０±０􀆰 ５） ℃振荡培养，转速１５０ ｒ ／ ｍｉｎ。 每隔２
天取样分析。
１􀆰 ３　 分析方法
１􀆰 ３􀆰 １　 细胞生长的测定
收获西红花细胞培养物，离心，称沉淀的细胞
质量。 准确称取 １􀆰 ００ ｇ鲜细胞置于烘箱（６０ ℃）烘
干至恒质量并称质量，计算收获干细胞的质量。
１􀆰 ３􀆰 ２　 色素的测定
称取 １􀆰 ５０ ｇ鲜细胞，加 １０ ｍＬ体积分数为 ６０％
甲醇，研磨至匀浆，８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １５ ｍｉｎ，量取色
素溶液体积，测 ４４０ ｎｍ 处的吸光值 ＯＤ４４０ ［１７］，测定
时进行适当稀释。 每克干细胞中西红花色素含量
（ｍｇ ／ ｇ）以相同色强下西红花干燥柱头质量（Ｅ１％１ ｃｍ
（４４０ ｎｍ）＝ １５０）表示。
图 １　 不同初始磷浓度下细胞生长和色素含量曲线
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｐｉｇｍｅｎｔ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｉｔｉａｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
１􀆰 ３􀆰 ３　 营养物质的测定
蔗糖和果糖的测定采用蒽酮试剂法［１８］测定，葡
萄糖使用生物传感仪测定，ＮＯ－３采用水杨酸 浓硫酸
法［１９］测定，ＮＨ＋４采用苯酚 次氯酸盐法［２０］测定，磷
采用磷钼蓝比色法［２１］测定。
１􀆰 ４　 数据分析
１）所有实验结果均为 ３次重复的平均值。
２）细胞比生长率（ μ）的计算。 细胞比生长率
μ＝（ｄＸ ／ ｄｔ） ／ Ｘ，式中 Ｘ 为细胞生物量（ｇ ／ Ｌ），ｔ 为时
间（ｄ），ｄＸ ／ ｄｔ 为瞬时生长率。 因此，μ 可由瞬时生
长率求出。 瞬时生长率由细胞生长模型求出。 根
据本实验测定的西红花细胞培养过程中“ ｔ 细胞生
物量”结果确定描述细胞生长特征的生长模型并对
其进行拟合，利用 ＳＰＳＳ 软件进行非线性回归分析
求出模型参数，再由生长模型求得瞬时生长率表达
式，根据该表达式计算出各时间下瞬时生长率，最
后求出细胞比生长率 μ。
３）色素比合成率（ρ）的计算。 色素比合成率ρ＝
（ｄＰ ／ ｄｔ） ／ Ｘ，式中 Ｐ 为色素产量（ｍｇ ／ Ｌ），由生物量
与色素含量计算求得，ｄＰ ／ ｄｔ 为色素瞬时合成率。
瞬时合成率由产物合成模型求出。 根据本实验测
定的西红花细胞培养过程中“ ｔ 色素产量”结果确
定描述细胞色素合成特征的产物合成模型并对其
进行拟合，利用 ＳＰＳＳ 软件进行非线性回归分析求
出模型参数，再由产物模型求得瞬时合成率表达
式，根据该表达式计算出各时间下瞬时合成率，最
后求出色素比合成率 ρ。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 不同初始磷浓度下西红花细胞生长和色素合成
西红花细胞的生长过程曲线如图 １（ ａ）。 由图
１（ａ）可知：不同初始磷浓度下细胞生长曲线均呈 Ｓ
形，０～３ ｄ表现短暂延滞期，生物量变化不大，３ ｄ 后
进入快速生长期，低磷和中磷浓度下细胞在 １５ ～ ２１
ｄ处于稳定期，最大生物量分别为 ９􀆰 ８７ 和 １１􀆰 ００
ｇ ／ Ｌ，而高磷浓度下细胞在 １２ ～ １８ ｄ 处于稳定期，最
大生物量为 １１􀆰 ２６ ｇ ／ Ｌ，随后细胞进入衰亡期，生物
量呈下降趋势。 不同初始磷浓度对西红花细胞的
生长有一定影响，随着磷浓度的增加，细胞的生物
量增加，并且高磷浓度下稳定期提前。
西红花的色素合成特征如图 １（ｂ）。 由图 １（ｂ）
０７ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
可知：不同初始磷浓度下西红花细胞色素含量的变
化趋势基本相同，在延滞期色素含量变化不大，随
着细胞的快速生长，色素含量快速上升，细胞到达
衰亡期时，色素含量仍持续上升，当细胞处于衰亡
期后期时，色素含量快速下降，色素可能被后期细
胞自溶所释放的酶降解。 高磷浓度下，色素含量在
２７ ｄ达到最高，为 ４９􀆰 ２５ ｍｇ ／ ｇ，低磷和中磷浓度下，
色素含量均在 ３０ ｄ 达到最高，分别为 ４１􀆰 ２３ 和
４４􀆰 ７２ ｍｇ ／ ｇ。 不同初始磷浓度对西红花细胞的色素
合成能力也具有一定影响，随着磷浓度的增加，色
素含量提高。
为了进一步比较磷对西红花细胞生长以及色
素合成的影响，计算了培养过程中的比生长率与比
合成率。
比生长率是描述细胞生长的一个重要参数。 由
图 １（ａ）可以看出：细胞生长近似于 Ｓ形曲线，通常采
用 Ｖｏｎ Ｂｅｒｔａｌａｎｆｆｙ 生长公式 （ Ｘ ＝ ｋ （ １ － ｅａ－ｒｔ ）３ ）、
Ｇｏｍｐｅｒｔｚ曲线（Ｘ ＝ ｋｅ－ｅ＾（ａ－ｒｔ） ）和 Ｌｏｇｉｓｔｉｃ 方程（Ｘ ＝ ｋ ／
（１＋ｅａ－ｒｔ））描述 Ｓ形生长过程；ａ，ｒ，ｔ 表示常数。 根据
本实验测定的西红花细胞培养过程中“ ｔ 细胞生物
量”结果对 ３种曲线进行拟合，低磷、中磷和高磷情况
下拟合优度（Ｒ２）分别为 ０􀆰 ８９９、０􀆰 ９５４、０􀆰 ９１４（Ｌｏｇｉｓｔｉｃ
方程），０􀆰 ８９２、０􀆰 ９４９、０􀆰 ９０４ （Ｖｏｎ Ｂｅｒｔａｌａｎｆｆｙ 生长公
式）， ０􀆰 ８９４、 ０􀆰 ９５０、 ０􀆰 ９０７ （ Ｇｏｍｐｅｒｔｚ 曲线）。 可见
Ｌｏｇｉｓｔｉｃ方程的拟合结果优于其他 ２种 Ｓ 形曲线。 因
此，选用 Ｌｏｇｉｓｔｉｃ 方程对生长曲线进行拟合。 利用
ＳＰＳＳ软件进行非线性回归分析，采用的计算方法为
麦夸法。 所得生长模型见式（１） ～（３）。
低磷：
Ｘ ＝ １０􀆰 ９４４
１ ＋ ｅ －０􀆰 ０７８－０􀆰 １０５ｔ
（１）
中磷：
Ｘ ＝ １２􀆰 ５３４
１ ＋ ｅ０􀆰 ２１７－０􀆰 １１０ｔ
（２）
高磷：
Ｘ ＝ １２􀆰 ４０６
１ ＋ ｅ０􀆰 １３６－０􀆰 １５４ｔ
（３）
根据式（１） ～ （３）求得瞬时生长率（ＩＧＲ）的表达式见
式（４） ～ （６）。
低磷：
ＩＧＲ ＝ １􀆰 １４９ｅ
－０􀆰 ０７８－０􀆰 １０５ｔ
（１ ＋ ｅ －０􀆰 ０７８－０􀆰 １０５ｔ） ２
（４）
中磷：
ＩＧＲ ＝ １􀆰 ３７９ｅ
０􀆰 ２１７－０􀆰 １１０ｔ
（１ ＋ ｅ０􀆰 ２１７－０􀆰 １１０ｔ） ２
（５）
高磷：
ＩＧＲ ＝ １􀆰 ９１１ｅ
０􀆰 １３６－０􀆰 １５４ｔ
（１ ＋ ｅ０􀆰 １３６－０􀆰 １５４ｔ） ２
（６）
根据式（４） ～ （６）计算瞬时生长率（ＩＧＲ）与比生长率
（μ）见图 ２。
图 ２　 不同初始磷浓度下瞬时生长率和比生长率曲线
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｃｕｒｖｅｓ ｏｆｉｎｓｔａｎｔａｎｅｏｕｓ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｉｔｉａｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
　 　 由图 ２可以看出：培养过程中不同初始磷浓度
下比生长率随着时间变化而呈下降趋势，但不同磷
浓度下比生长率及其变化表现不同。 ９ ｄ 前高磷浓
度下细胞比生长率较高，９ ｄ 后瞬时比生长率低于
中磷水平，说明在 ９ ｄ前高磷浓度有利于细胞生长，
９ ｄ后中磷浓度适宜。
比合成率是描述色素合成的一个重要参数。 由
图 １可以看出，西红花细胞生长与色素合成不完全同
步，属于部分耦联型，因此采用 Ｌｕｅｄｅｋｉｎｇ Ｐｉｒｅｔ方程
（式（７））对衰亡期前色素合成动力学进行描述。
Ｐ ＝ α ｋ
１ ＋ ｅａ－ｒｔ
＋ β ｋ
ｒ
ｌｎ １
＋ ｅａ－ｒｔ
ｅａ－ｒｔ
（７）
１７　 第 ４期 扶文君等：磷对悬浮培养的西红花细胞生长和色素合成的影响
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
式中：α 表示与细胞生长有关的产物合成常数；β 表
示与生物量相关的产物合成常数。
根据本实验测定的西红花细胞培养过程中“ ｔ
色素产量”结果对方程进行拟合，利用 ＳＰＳＳ 软件进
行非线性回归计算，计算方法为麦夸法。 所得色素
合成模型见式（８） ～ （１０）。
低磷：
Ｐ ＝ － ２１０􀆰 ６８３
１ ＋ ｅ －０􀆰 ０７８－０􀆰 １０５ｔ
＋ １９３􀆰 ６５７ｌｎ １
＋ ｅ －０􀆰 ０７８－０􀆰 １０５ｔ
ｅ －０􀆰 ０７８－０􀆰 １０５ｔ
（８）
中磷：
Ｐ ＝－ ３９４􀆰 ２３２
１ ＋ ｅ０􀆰 ２１７－０􀆰 １１０ｔ
＋ ３２６􀆰 ６８２ｌｎ １
＋ ｅ０􀆰 ２１７－０􀆰 １１０ｔ
ｅ０􀆰 ２１７－０􀆰 １１０ｔ
（９）
高磷：
Ｐ ＝ － １７４􀆰 ６３９
１ ＋ ｅ０􀆰 １３６－０􀆰 １５４ｔ
＋ １８０􀆰 ４１２ｌｎ １
＋ ｅ０􀆰 １３６－０􀆰 １５４ｔ
ｅ０􀆰 １３６－０􀆰 １５４ｔ
（１０）
　 　 低磷、中磷和高磷情况下拟合优度（Ｒ２）分别为
０􀆰 ９８８、０􀆰 ９８８、０􀆰 ９８３。 根据式（８） ～ （１０）求得色素
瞬时合成率（ＩＳＲ）的表达式见式（１１） ～ （１３）。
低磷：
ＩＳＲ ＝ － ２２􀆰 １２２ｅ
－０􀆰 ０７８－０􀆰 １０５ｔ
（１ ＋ ｅ －０􀆰 ０７８－０􀆰 １０５ｔ） ２
＋ ２０􀆰 ３３４
ｅ －０􀆰 ０７８－０􀆰 １０５ｔ
　 　
（１１）
中磷：
ＩＳＲ ＝ － ４３􀆰 ３６６ｅ
０􀆰 ２１７－０􀆰 １１０ｔ
（１ ＋ ｅ０􀆰 ２１７－０􀆰 １１０ｔ） ２
＋ ３５􀆰 ９３５
ｅ０􀆰 ２１７－０􀆰 １１０ｔ
　 　
（１２）
高磷：
ＩＳＲ ＝ － ２６􀆰 ８９４ｅ
０􀆰 １３６－０􀆰 １５４ｔ
（１ ＋ ｅ０􀆰 １３６－０􀆰 １５４ｔ） ２
＋ １５􀆰 ３８３ ４４０
ｅ０􀆰 １３６－０􀆰 １５４ｔ
　 　
（１３）
根据式（１１） ～ （１３）计算色素瞬时合成率（ＩＳＲ）和比
合成率见图 ３。
图 ３　 不同初始磷浓度下色素瞬时合成率和比合成率曲线
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ｐｉｇｍｅｎｔ ｉｎｓｔａｎｔａｎｅｏｕｓ ｂｉｏｓｙｎｔｈｓｉｓ ｒａｔｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｏｓｙｎｔｈｓｉｓ ｒａｔｅ ａｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｉｔｉａｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
　 　 由图 ３可以看出：不同初始磷浓度下比合成率
随着时间变化而呈上升趋势，说明该培养基有利于
色素的合成。 但过高、过低磷浓度下的色素比合成
率都低于中磷浓度，说明中磷浓度最有利于色素的
合成。 不同培养阶段，色素比合成率的变化趋势也
不同，在 ９ ｄ 前色素比合成率上升较为平缓，９ ｄ 后
色素比合成率快速上升，并且高磷浓度下比合成率
上升较快，１５ ｄ时高于低磷浓度。
２􀆰 ２　 不同初始磷浓度下营养物质的吸收利用及其
与细胞生长和色素合成的关系
２􀆰 ２􀆰 １　 不同初始磷浓度下碳源的吸收利用
蔗糖是西红花细胞培养的主要碳源。 培养过
程中培养液中蔗糖变化见图 ４。 由图 ４ 可知：在快
速生长期前期（６ ｄ）质量分数为 ９５％蔗糖被降解，
磷对其降解速率没有影响。 ０～３ ｄ时由于蔗糖快速
降解，培养液中的葡萄糖和果糖含量快速提高。 随
后由于葡萄糖和果糖被吸收利用，培养液中葡萄糖
和果糖浓度下降。 葡萄糖在 ６ ～ ９ ｄ 时被迅速吸收
利用，９ ｄ时 ５０％葡萄糖被吸收利用，随后吸收利用
速率降低，１８ ｄ 时质量分数 ８５％葡萄糖被吸收利
用。 果糖在 ３ ～ ２１ ｄ 几乎以一定的速率被细胞吸收
利用，２１ ｄ时质量分数 ８５％果糖被细胞吸收利用，
可见西红花细胞优先吸收利用葡萄糖。 不同初始
磷浓度对蔗糖降解和葡萄糖的吸收利用没有明显
影响，但随着磷浓度的提高，果糖的吸收利用速率
提高。 在西红花细胞培养过程中蔗糖消耗是蔗糖
先被降解成葡萄糖与果糖，再以葡萄糖与果糖的形
式被细胞吸收利用。
２７ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
图 ４　 不同初始磷浓度下 Ｃ源的变化曲线
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｉｔｉａｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
２􀆰 ２􀆰 ２　 不同初始磷浓度下氮源的吸收利用
培养基中主要 Ｎ 源为硝态氮，铵态氮较少。 由
图 ５可以看出，ＮＨ＋４的吸收利用与蔗糖相似，在培养
早期被细胞迅速吸收利用，高磷浓度下在培养 ３ ｄ
时摩尔分数（下同）９５％ ＮＨ＋４被吸收利用，低磷和中
磷浓度下 ６ ｄ 时分别有 ９０％和 ９５％ ＮＨ＋４被吸收利
用，这可能与 ＮＨ＋４直接参与蛋白质合成等过程有
关。 ＮＯ－３在培养过程中逐渐被吸收利用，２１ ｄ 时
８０％ ＮＯ－３被吸收利用。 磷对 ＮＯ
－
３的吸收利用有一定
差异。 高磷浓度下 ＮＯ－３在 ９ ｄ 前被快速吸收利用，
随后吸收利用速率降低，低磷和中磷基本以一定的
速率被吸收利用。 不同初始磷浓度对 ＮＨ＋４的吸收
利用没有明显影响，但随着磷浓度的提高，ＮＯ－３的吸
收利用速率提高。
图 ５　 不同初始磷浓度下氮源的变化曲线
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｉｔｉａｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
２􀆰 ２􀆰 ３　 营养物质的消耗与细胞生长、色素合成的
关系
综上所述，１８ ｄ时 ８５％葡萄糖被吸收利用，２１ ｄ时
８５％果糖被吸收利用，２１ ｄ时 ８０％ ＮＯ－３ 被吸收利用，稳
定期后期 Ｃ、Ｎ源基本被消耗完，此时生物量不再增加，
色素含量继续上升，说明 Ｃ、Ｎ源的不足影响了细胞生
长，但对色素合成影响不大。 从图 ５（ｂ）和图 ６可以看
出，在高磷条件下培养 ０～９ ｄ时细胞对 ＮＯ－３ 的吸收率
明显高于低磷和中磷，并且随着 ＮＯ－３ 的吸收率的提高，
色素比合成率增长率亦随之提高，因此，提高 ＮＯ－３ 的吸
收率是提高色素合成能力的关键。
３　 结论
不同初始磷浓度下细胞生长曲线均呈 Ｓ 形，均
经历衰亡期、快速生长期、稳定期和衰亡期。 随初
始磷浓度的提高细胞生物量提高，高磷浓度下细胞
最大生物量达 １１􀆰 ２６ ｇ ／ Ｌ。 不同初始磷浓度下比生
长率呈下降趋势，磷对比生长率有一定影响，在培
养前 ９ ｄ高磷浓度比生长率最高，９ ｄ后中磷浓度比
生长率最高。 进入快速生长期色素开始合成，到衰
亡期色素仍继续合成，并且色素含量达到最高，随
后色素开始降解，含量下降，色素合成期比细胞生
长期长。 因此，西红花细胞培养过程中色素合成与
细胞生长的关系为部分偶联型。 随初始磷浓度的
提高色素含量提高，高磷浓度下色素含量最高达
４９􀆰 ２５ ｍｇ ／ ｇ。 在培养过程中色素比合成率呈上升趋
势，磷对色素比合成率有一定影响，中磷浓度下比
合成率最高。
３７　 第 ４期 扶文君等：磷对悬浮培养的西红花细胞生长和色素合成的影响
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
图 ６　 不同初始磷浓度下比合成率与 ＮＯ－３ 吸收的关系
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｏｓｙｎｔｈｓｉｓ ｒａｔｅ
ａｎｄ ＮＯ－３ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｉｔｉａｌ
ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
在培养过程中，快速生长期前期（６ ｄ）蔗糖被降
解为葡萄糖和果糖而被迅速吸收利用。 培养 １８ ｄ
时 ８５％葡萄糖被吸收利用，２１ ｄ 时 ８５％果糖被细胞
吸收利用。 培养 ３ ｄ时胞外 ９５％ ＮＨ＋４被细胞迅速吸
收利用，而 ＮＯ－３吸收利用较为缓慢，２１ ｄ 时 ８０％
ＮＯ－３被吸收利用。 提高初始磷浓度，对蔗糖的降解、
葡萄糖与 ＮＨ＋４的吸收利用没有明显影响，但果糖和
ＮＯ－３的吸收利用速率提高。
在高磷浓度下培养 ０～９ ｄ时细胞对 ＮＯ－３的吸收
率明显高于低磷和中磷。 提高 ＮＯ－３的吸收率是提高
色素合成能力的关键。 稳定期后期 Ｃ、Ｎ 源的不足
影响了细胞生长，但对色素合成影响不大。
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（责任编辑　 周晓薇）
４７ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８