全 文 ：葡枝根霉 !"!"!#酶催化甾体 #$$!$羟基化的研究
茅燕勇，沈珈琦，范伟平!
（南京工业大学 制药与生命科学学院，南京 %&’’’(）
摘 要：应用本实验室保藏的葡枝根霉 !"#$%&’( ()%*%+#,-. !"’)’*对甾体化合物烯睾丙内酯（)$+,+$-，.$/0121$341526$
&7$689:6$:;/4+,;$%&$<64=+,;80< 6<0/ 56>6$86源供应对菌体所产羟化酶的活力有重要影响。采用葡萄糖和淀粉组合碳源，并加入适量的黑曲霉糖化酶的方式，
解决了葡萄糖抑制的问题，并缩短了菌体培养反应时间，得到高羟化转化率。酶转化反应 @@ :后，提取吸附在菌丝
球内的产物，应用液相色谱测定，结果表明 #&&!$羟基化转化率达到了 *)A’B。
关键词：葡枝根霉；甾体；酶催化 #&&!$羟基化
中图分类号：C@&-A( 文献标识码：D 文章编号：&.7%$).7@（%’’-）’%$’’-.$’.
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=+,;80< 6<0/ 56>6$86:6T =112 <+2/V1?:+/ +O <64=+2 T+V4<1 T140+VT8;
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甾体的 #&&!$羟基化对于甾类药物的合成及结
构改造具有重要意义，通过 #&&!$羟基化后可以引入
高生理活性基团，从而大大增加疗效，减少副作用，
并能改变作用的专属性［&］。&(*%年 31?14T+2和 EV4$
4;［%］首先发现了黑根霉（!"#$%&’( +#0.#12+(）对甾体具
有 #&&!$羟基化能力，并且发现甾体羟化酶是一种细
胞色素 3-*’依赖的金属酶，其通过 !DZ3I递氢，氧
化底物，完成羟化反应。
国内外文献［) [ 7］报道了多种可以催化甾体 #&&
!$羟基化的霉菌，但关于葡枝根霉对甾体 #&&!$羟基
化却很少有报道。本文所筛选的葡枝根霉 !"#$%&’(
()%*%+#,-. !"’)’*与文献［@］报道的高酶活的赭曲霉
! 收稿日期：%’’-$’)$%@
作者简介：茅燕勇（&((7$），男，江苏南通人，硕士，研究方向：生物有机合成。
联系人：范伟平，教授，南京工业大学制药与生命科学学院生物工程系，南京，%&’’’(。
E6; %’’-
·-.·
生 物 加 工 过 程
#:021T1 K+V4268 +O \0+94+<1TT J2502114025
第 %卷第 %期
%’’-年 *月
万方数据
菌相比，具有培养过程不产生红色素，且羟基化产物
易分离等优点。其对甾体烯睾丙内酯 !""#!羟基化
过程如下：
初步研究结果表明碳源供应方式对甾体烯睾丙
内酯 !""!#羟基化反应有很大的影响。本文深入研究
碳源配制和供应方式，实验结果表明菌体培养周期缩
短，!""!#羟基化转化率高，国内还未见相似报道。
! 材料与方法
"$" 菌株
葡枝根霉（!"#$%&’( ()%*%+#,-.）%&’(’)（由南京工
业大学制药与生命科学学院重点实验室筛选保藏）
"$* 培养基
"$*$" 平板及斜面培养基
+,-培养基
"$*$* 发酵培养基
葡萄糖 *’ .，玉米浆 *) .，酵母膏 * .，自来水 "
/，01 2$’。
"$( 培养及转化方法
将斜面种子用无菌水制成孢子悬浮液（"’3 个 4
5/），按 )6接种量接入发酵培养基（)’ 5/培养基 4
*)’ 5/摇瓶），*3 7下 ")’ 8 4 59:振荡培养 *; <后加
入经超声波处理的底物（底物质量浓度为 "’ . 4 /），
继续培养 ;3 <后测 !""!#羟基化的转化率。
"$; 底物添加方法
以水为分散介质与烯睾丙内酯一起研磨，制得
底物 4水混悬液（*) . 4 /）后使用较强的超声声强
（"*$; = 4 >5*），较短的超声时间（) 59:）［?］对其进行
处理。取适量经过超声波处理的底物 4水混悬液加
入发酵培养基，添加时不需严格的无菌操作条件。
"$) 菌体量测定方法
采用称干重法：将发酵液抽滤取得菌丝体，以去
离子水冲洗 (次，"’) 7烘干至恒重后称重。
"$2 产物提取方法
酶转化结束后的发酵液真空抽滤，滤饼用乙酸
乙酯（用量为 ’$) . 底物 4 )’ 5/ 乙酸乙酯）在 @@$"
7冷凝回流 " <［"’］后趁热抽滤，得到菌丝体的乙酸
乙酯抽提液。将抽提液在旋转薄膜蒸发器中真空浓
缩至干燥后取出原料和产物的混合结晶，用去离子
水清洗两遍后在 "’3 7左右烘干至恒重。
"$@ !""!#羟基化转化率的测定方法
高效液相色谱 4质谱联用（1+/! 4 AB）法。1+/!
条件：采用 =CDE8F BG55ED8G B<9EHI J+ "3柱（")’ 55
K ($? 55，)"5），甲醇 L和水 -为流动相，’$3 5/ 4
59:的流速，L从 "’6到 )’6梯度洗脱 ;’ 59:，进样
量 )"/。AB条件：MN源；电离电压 @’ EO；离子源温
度 *’’ 7；扫描范围 ";’ P " *’’ C5Q。
"$3 羟化酶活测定方法
见参考文献［""］。
" 结果与讨论
*$" 培养基中碳源对 !""!#羟基化转化率的影响
*$"$" 不同碳源对 !""!#羟基酶活性的影响
碳源是微生物培养的重要营养因素。适当的碳
源既能缩短发酵周期；又能提高酶催化转化率。不
同碳源对 !""!#羟基化的影响结果见表 "。
表 " 碳源种类对 !""!#羟基化转化率的影响
RCSHE " MTTE>D UT DC8SU: FUQ8>E U: >U:VE8F9U: 8CDE UT !""!#I8UWGHCD9U:
!C8SU: FUQ8>E
4（*’ . 4 /）
,8G 5G>EH9Q5
XE9.4（. 4 /）
+E89UI UT
TE85E:DCD9U:
4（<）
JCDE UT !""
!#4 6
.HQ>UFE 3$;@; @@ ;;$?
FQ>8UFE )$;@? @( *($2
5CHDUFE ;$"?@ @( **$)
FDC8>< @$*3? ?2 ;3$(
从表 "可知，葡萄糖最利于 %&’(’)生长，淀粉
（加入 ’$’)6的黑曲霉!#淀粉酶）最利于酶催化 !""
!#羟基化。为缩短发酵周期、提高羟化转化率，选择
*’’;年 )月 茅燕勇等：葡枝根霉 %&’(’)酶催化甾体 !""!#羟基化的研究 ·;@·
万方数据
以淀粉和葡萄糖为复合碳源继续考察。
!"#"! 淀粉和葡萄糖浓度配比对 $##!%羟基化转化
率的影响
其它条件不变，总量为 !& ’ ( )的复合碳源中，
淀粉（加入 &"&*+的黑曲霉!%淀粉酶）和葡萄糖的
质量比例分别为 # ,-，# ,#，- ,#，考察淀粉和葡萄糖质
量比对 $##!%羟基化转化率的影响，结果见图 #。
—!—!（’./0123）（"（245607）："（’./0123）8 #,-）；
—"—!（’./0123）（"（245607）："（’./0123）8 #,#）；
—#—!（’./0123）（"（245607）："（’./0123）8 -,#）；
—$—019:362;19 6543（"（245607）："（’./0123）8 #,-））；
—%—019:362;19 6543（"（245607）："（’./0123）8 #,#））；
—&—019:362;19 6543（"（245607）："（’./0123）8 -,#））
图 # 淀粉和葡萄糖配比对 $##!%羟基化转化率的影响
<;’=# >??304 1? 473 @564;4;19 1? 245607 59A ’./0123 19 019:362;19
6543 1? $##!%7BA61CB.54;19
由图 #可知，淀粉和葡萄糖质量比为 # , #时，最
终的 $##!%羟基化转化率较高，达到了 DE"F+。结果
表明过高的葡萄糖质量浓度会对菌体产羟化酶产生
抑制作用。通过生长曲线的测定，淀粉和葡萄糖质
量比为 # ,#时，菌体可以较早地进入对数生长期，为
酶转化积累较多的菌体量；酶转化阶段时，随着淀粉
水解为葡萄糖，培养液中残留葡萄糖浓度基本稳定
在 ! G - ’ ( )之间，不会对酶转化产生抑制作用，羟
基化转化率可以达到较高的水平。
!"! 培养基中玉米浆和酵母膏对 $##!%羟基化转化
率的影响
氮源是细胞蛋白质合成的必须营养成分，也是
产酶的必要条件；玉米浆是广泛应用的有机氮源，酵
母膏富含微生物生长必需的维生素和生长因子。其
它条件不变的情况下玉米浆及酵母膏浓度变化对
$##!%羟基化转化率的影响结果分别见图 !和图 -。
图 ! 玉米浆的浓度对 $##!%羟基化转化率的影响
<;’=! >??304 1? 0190394654;19 1? $= H= ) 19 019:362;19 6543 1? $##!%
7BA61CB.54;19
图 - 酵母膏的浓度对 $##!%羟基化转化率的影响
<;’=- >??304 1? 0190394654;19 1? I3524 3C46504 19 019:362;19 6543 1?
$##!%7BA61CB.54;19
图 !和图 -可以看出，玉米浆和酵母膏质量浓
度变化对 $##!%羟基化转化率的影响不大。玉米浆
和酵母膏浓度分别在 -& ’ ( )和 #"* ’ ( )时 $##!%羟基
化转化率达到最大，都为 D*"#+。
!"- 培养基中钙、镁离子对 $##!%羟基化转化率的
影响
微量元素钙、镁离子往往对微生物生长和产羟
化酶有非常敏锐的影响。在其它条件不变的情况
下，着重考查了 $5$.!、J’HKD·FL!K对 $##!%羟基化转
化率的影响，结果如图 D所示。
—’—J’HKD·FL!K；—$—$5$.!
图 D 微量元素对 $##!%羟基化转化率的影响
<;’=D >??304 1? A;??36394 019:362;19 1? M;0619/46;39 19 019:362;19
·DN· 生物加工过程 第 !卷第 !期
万方数据
!"#$ %& ’((!)*+,!%-+."#/%0
由图 1可见，’"’.2对 ’((!)羟基化转化率几乎不
存在影响；34561·7826质量浓度大于 9:;9 4 < =后 ’((
!)羟基化转化率便不再随其质量浓度增加而提高。
2:1 接种量对 ’((!)羟基化转化率的影响
适合的接种量可以提高菌体生长量以及 ’((!)
羟基化转化率。其它条件不变时接种量对 ’((!)羟
基化转化率的影响情况如表 2所示。由表 2可知，
接种量在 >? @ 7?比较合适。
表 2 接种量对 ’((!)羟基化转化率的影响
A"B.$ 2 C&&$D# %& E$$, FG"0#/#+ %0 D%0H$!E/%0 !"#$ %& ’((!)*+)
,!%-+."#/%0
接种量 < ? ( ; > 7 I
转化率 < ? ;J:7 12:9 11:I 1>:( 12:;
2:> 环境条件对 ’((!)羟基化转化率的影响
以前面优化的营养条件配成优化培养基，考察
环境条件（K8、装液量、培养及酶转化温度）对 ’((!)
羟基化转化率的影响情况。
2:>:( 初始 K8值对 ’((!)羟基化转化率的影响
微生物生长发育以及酶催化反应都有一定的
K8值适合范围。在微生物生长发育过程中，随着营
养物质的消耗和代谢产物的产生，生长体系的 K8
值也会发生一定的变化，从而对其生长发育以及酶
催化能力产生影响。各初始 K8下整个发酵过程中
K8与转化率的变化关系如图 >所示。
—!—K8（/0/#/". K8 >LJ）；—"—K8（/0/#/". K8 JL9）；
—#—K8（/0/#/". K8 JL1）；—$—D%0H$!E/%0 !"#$（/0/#/". K8 >LJ）；
—%—D%0H$!E/%0 !"#$（/0/#/". K8 JL9）；
—&—D%0H$!E/%0 !"#$（/0/#/". K8 JL1）
图 > 初始 K8对 ’((!)羟基化转化率的影响
M/4L> C&&$D# %& /0/#/". K8 H".G$ %0 D%0H$!E/%0 !"#$ %& ’((!)*+,!%-)
+."#/%0
由图 >可知，K8的控制是酶催化 ’((!)羟基化
的关键，K8值对 ’((!)羟基化转化率影响较大，随着
K8值从 J:9 增加到 J:1 或降到 >:J，’((!)羟基化转
化率分别从较高的 >(:I?降到 11:;?和 17:;?。
2:>:2 温度对培养及酶催化 ’((!)羟基化转化率的
影响
温度既能影响微生物的生长发育，又能影响酶
的活力。酶对环境温度特别敏感，过高或过低的温
度都易使酶失活。通过试验，发现最佳的培养温度
为 ;9 N。以 ;9 N为培养温度，考察了酶转化阶段
温度对 ’((!)羟基化转化率的影响，发现葡枝根霉
OP9;9>的最适培养温度和最佳酶催化 ’((!)羟基化
温度不同（见图 J）。因此，培养和酶催化 ’((!)羟基
化应需使用不同的温度。
图 J 温度对 ’((!)羟基化转化率的影响
M/4LJ C&&$D# %& #$QK$!"#G!$ %0 D%0H$!E/%0 !"#$ %& ’((!)*+,!%-+.")
#/%0
2:>:; 装液量对 ’((!)羟基化转化率的影响
甾体羟化酶需充分的氧以完成羟基化过程，以
装液量来考虑通风量对 ’((!)羟基化转化率的影响，
见图 7。
—%—>9 Q= < 2>9 Q=；—"—19 Q= < 2>9 Q=；
—#—;9 Q= < 2>9 Q=；—!—29 Q= < 2>9 Q=
图 7 摇瓶装液量对 ’((!)羟基化转化率的影响
M/4L7 C&&$D# %& Q$,/GQ H%.GQ$ %0 D%0H$!E/%0 !"#$ %& ’((!)*+,!%-)
+."#/%0
由图 7可知，反应结束前 (J *，较少装液量的反
应液中 ’((!)羟基化转化率较高，但当底物质量浓度
为 (9 4 < =，酶转化 72 *时，装液量大小对最终的转
化率大小影响不大。
2991年 >月 茅燕勇等：葡枝根霉 OP9;9>酶催化甾体 ’((!)羟基化的研究 ·1I·
万方数据
!"# 底物对 $%%!&羟基化的诱导及抑制作用
葡枝根霉 ’()*)+ 分泌的羟化酶是一种诱导
酶，培养过程加入适量的底物可以诱导羟化酶显性
表达；同时，底物也可能会对菌的生长产生抑制作
用。实验中，以前面的优化条件对 ’()*)+ 进行培
养，分别在培养 %+、%,、!% - 后添加 )"!+、)"+、)".+
/ 0 1的底物悬浮液作为诱导剂，得到诱导作用对 $%%
!&羟基化转化率的影响图（图 2）。
图 2 诱导剂对 $%%!&羟基化转化率的影响
34/52 67789: ;7 4<=>98? ;< 9;<@8?A4;< ?B:8 ;7 $%%!&-C=?;DCEB:4;<
由图 2可知，培养 %, -后添加较低质量浓度为
)"!+ / 0 1的诱导剂诱导效果较好，可以较高地提高
转化率。而较早地添加诱导剂则会对菌的生长产生
抑制作用，降低羟基化转化率。培养后期（!% -）添
加诱导剂的诱导效果不明显。
! 小结
本论文采用复合碳源方式培养葡枝根霉 !"#$%&
’() )*%+%,#-./ ’()*)+菌体，不同于文献报道的碳源配
制方式。经优化的发酵培养基为：葡萄糖 %) /、淀粉
%) /、玉米浆 *+ /、酵母膏 %"+ /、适量黑曲霉糖化酶、
自来水 % 1、FG #")。优化的培养及酶催化转化条件
为：接种量 .H，*) I培养 %, -后添加 )"!+ / 0 1的
诱导剂，培养 !J -后改变温度，在 !2 I进行酶催化
烯睾丙内酯 $%%!&羟化反应 22 -。提取菌丝体内的
产物，经 GK1$ 0 LM测定，表明酶催化 $%%!&羟基化转
化率达到了 +*")H（见图 ,）。该条件下的羟化酶活
达到了 %"*#2 图 , 产物的 GK1$ 0 LM图
34/5, K?;=>9: B本文中对酶催化烯睾丙内酯 $%%!&羟化反应的 研究，得到了较高的 $%%!&羟基化转化率，但如何改
·+)· 生物加工过程 第 !卷第 !期
万方数据
善细胞膜通透性，解决底物及产物扩散传质问题，提
高羟基化产物的回收率还需要继续研究，!""!#羟基
化转化率也还需进一步提高。这方面的研究仍在继
续进行。
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&’’D年 B月 茅燕勇等：葡枝根霉 VZ’F’B酶催化甾体 !""!#羟基化的研究 ·B"·
万方数据