全 文 ：第 ! 卷第 # 期
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生"物"加"工"过"程
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收稿日期%$%&& <%1 <%#
基金项目%国家高技术研究发展计划"3# 计划#资助项目"$%%!LL%$7%(#
作者简介%王"辉"&!34#$男$江苏连云港人$硕士研究生$研究方向%工业微生物&郑之明"联系人#$研究员$0*HGD>%7H78AEFgDUU;GX;XE
菌丝空泡形态比例与青霉素合成的关系
王"辉&$桂"芳&$王"鹏&$刘"会&$蔡晓春$$胡以华$$郑之明&
"&;中国科学院 合肥物质科学研究院 离子束生物工程重点实验室$合肥 $%%&&
$;解放军电子工程学院$合肥 $%%4#
摘"要%采用图像处理技术量化菌丝空泡区域比例$并研究菌丝空泡与青霉素合成的关系( 结果表明%当空泡区域
比例达到 $%h时$青霉素开始大量合成&当空泡比例达到 %h k(h时$青霉素合成最为旺盛&当空泡区域比例超
过 1%h时$青霉素效价下降( 菌丝空泡的过度膨胀是发酵进入衰退期的重要标志(
关键词%空泡形态&图像处理&产黄青霉&青霉素
中图分类号%b51#(;&""""文献标志码%L""""文章编号%$ <#43"$%&&#%# <%%$# <%1
X42G3:F.2/2790/.:.6./742I7-2"%@,$*&4)::2440192/G./; M.F-
942924F.2/127-L9-56A5:326.S5F.2/
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?8AU@BI=X?DBE BCUAEDXD>DE J?G@?AI \8AE U@BUB@?DBE BCaGX=B>G?AI 8VU8GA@AGX8AI $%h GEI IAX@AGJAI
BEXA?8AU@BUB@?DBE A`XAAIAI 1%h;b8A8DF8AJ?VDA>I \GJB6?GDEAI \8AE aGX=B>D7G?DBE BXX=UDAI %h ?B
(h BC8VU8GA;0`?AEJDaAC=EFG>aGX=B>AJJ8B\AI IAXGVDEFU8GJABCCA@HAE?G?DBE;
K0L M24G1%8VU8G>aGX=B>D7G?DBE& DHGFAU@BXAJJ& 430"%:,$*&5)8& UAEDXD>DE
""青霉素是一种重要的抗生素( 目前$工业上主要
利用产黄青霉发酵生产青霉素( 作为次级代谢产物$
青霉素合成的调控机制相对复杂*&+ ( 经过几十年的
演变$传统的发酵调控手段显然已经无法进一步提高
青霉素的产量( 已有采用工程菌构建氧化还原酶系
实现产物过表达的报道*$+ $表明实现青霉素这种次级
代谢物合成过程中的生物改造需要系统生物学的全
局理念( 大量工业实践也证明$发酵过程中产黄青霉
的形态与青霉素合成具有很大的相关性( 因此$基于
形态发生的青霉素合成动力学研究显得尤为重要(
产黄青霉菌丝形态的改变包括菌丝生长)延伸以及断
裂* <1+ ( >^DBEJWV等*(+研究了此过程中空泡的作用$
空泡参与糖蛋白的翻转和水解))G$j的储存以及离子
的动态平衡等( eDX8G@IJ等*#+研究发现空泡还参与
菌丝中营养成分的长距离运输$并且通过自噬的方式
参与菌丝的衰老过程(
""笔者采用图像处理方法定量分析菌丝形态变
化$研究产黄青霉菌丝中空泡形态与青霉素合成之
间的对应关系$将为进一步从分子层面理解形态与
代谢的关系$构建优化菌株$以期为青霉素发酵的
精确调控提供理论依据(
D?材料与方法
DND?菌种
""产黄青霉"430"%:,$*&5)8#9*&$%*&3*
$华北制
药公司提供(
DNB?培养基
""种子培养基%蔗糖"$% F2.#$玉米浆"#4 F2.$ (%h
干质量#
""发酵培养基%乳糖"&% F2.#$玉米浆"1#c( F2.$
(%h干质量#$ N^
$
9[
1
"1 F2.#$",N
1
#
$
Y[
1
"1c( F2.#$
苯乙酸铵 $滴2瓶$初始 UN为 (c3(
DNQ?发酵流程
""$(% H.摇瓶$$( l)转速 $$% @2HDE 下种子培
养 13 8$装量为 (% H.&种子接入 $(% H.发酵摇瓶$
$( l)转速 $$% @2HDE下培养$装量为 % H.(
""每 $1 8取样$染色并采集显微图像( 根据国家
药典规定$按碘量法测定效价(
""上罐发酵%-DB .^]$%%% 小试发酵罐$c4 ."瑞
士比欧公司生产#(
DNV?染色步骤
""&#取 &%%
$
.发酵液$经 13
$
H的网筛过滤冲
洗$去除发酵液中有色杂质的干扰&$#滤后菌丝置
于小离心管中$加生理盐水稀释至 & H.$吸取
&%%
$
.均匀涂在载玻片&#滴加 $%%
$
.亚甲基蓝
染色液$染色 &% HDE&1#滴加 &%%
$
.苯酚品红染色
液$染色 ( HDE&(#蒸馏水冲洗玻片$盖片观察(
DNW?图像处理
""利用上述染色方法$可以使得处于不同生理活性
状态的菌丝呈现不同的颜色( 通过图像处理$就可以
对菌体的生长状况有更清晰的认识( 在对菌丝形态
图像进行处理时$运用了伪彩色增强的处理方法*4+ (
为了表征图像中.红绿蓝/三原色所占的比例$笔者
引入了.灰度/的概念( 经处理$特定的颜色就可以
表示为一定范围的灰度值$此步骤称为二值化$至此
得到黑白图像*3+ ( 计算机根据图像中不同的灰度值
进行计算和判定$将 1种不同的颜色自动加到黑白图
像上$从而得到所需的伪彩色增强的图像( 图像采集
用[>VHU=JbN1*$%%显微成像系统&图像处理利用与
解放军电子工程学院联合开发软件处理(
B?结果与讨论
BND?染色样图及图像处理所得形态参数的计算
""亚甲基蓝经活性线粒体氧化成为无色$因此可
以作为反映细胞活性的指示剂( 为了区分同样呈
无色的高活性和空泡区域$采用苯酚品红复染的方
法( 苯酚品红可将细胞质部分染成橙红色*!+ ( 复
染的结果是%高活性区域主要呈现橘红色$随着活
性的降低$颜色从紫色向蓝灰色渐变$且染色效果
可保持 & 8( 经此染色方法处理的菌丝形态图像在
相差显微镜下色差对比明显$因此低活性即空泡区
域容易被识别$结果如图 & 所示(
"白色箭头所指为空泡区域#
图 D?染色后菌丝图像" V`CC#
O.;=D?"L9-5 277N2"%@,$*&4):57F041F5././;" V`CC#
""利用图像软件对菌丝显微照片进行二值化和
伪彩色增强处理$得到新的菌丝图像一共包含 1 种
颜色"图 $#$对应关系如下%黄色为顶端生长区域&
绿色为亚顶端活性区域&蓝色为空泡区域&红色为
低活性"死亡#区域(
""从图 $ 可以看出%菌丝的原始图像是放大 1%%
倍后所得$通过对二值化图像的分析$计算得到菌
丝投影面积为 4$3c($
$
H
$
$菌丝总长为 #!c4%
$
H$
平均直径为 c1
$
H( 经软件统计$得到黄绿蓝红
1 个区域所占比例分别为 &#c(3h) 14c1#h)
$!c%4h和 #c3!h( 在这 1 个区域中$主要研究空
泡区域"蓝色部分#所占比例的变化( 相关数据是
对同一批菌丝采集的 (% 张图片进行统计所得(
BNB?青霉素效价与空泡区域的关系研究
""将测定的青霉素效价曲线与空泡区域所占比
例随时间变化关系进行比较$结果如图 所示(
""从图 可以看出%青霉素从发酵第 天开始大
量合成$第 # 天达到效价最高值$随后合成量有所下
降( 而对于空泡区域所占比例而言$则一直呈上升
趋势$第 天达到 $%h左右$至第 # 天大约占菌丝
的 4h左右( 对此现象可能的解释是%菌丝空泡在
丝状菌生长分化及细胞生理活动中起着重要作用(
发酵起始时$培养基中营养充足$菌体主要进行初
4$"第 # 期 王"辉等%菌丝空泡形态比例与青霉素合成的关系
注%从左至右为原始图像)二值化图像和伪彩色增强后的图像&第三幅图中白色箭头所指蓝色部分为空泡区域
图 B?处理后的菌丝图像" V`CC#
O.;=B?R5./1F5;0127.I5;05/56L1.1" V`CC#
图 Q?青霉素效价及空泡比例随发酵时间变化的曲线
O.;=Q?,34A012790/.:.6./L.06G15/GA5:326.S5F.2/
942924F.2/1":2/F426;4239#
级代谢$菌丝顶端生长旺盛$分支大量产生$空泡比
例有限&进入发酵第 )1 天$菌体初级代谢基本完
成$伴随着营养物质的大量消耗$菌丝空泡膨胀逐
渐替代细胞质的生物合成(
""为了验证青霉素合成与菌丝空泡比例之间是
否存在一定的对应关系$又进行如下实验%发酵第
天调节发酵培养基的 UN"前 天为菌体初级代谢旺
盛期$之后开始次级代谢#$此时对照组 UN大约为
#c($通过滴加稀 N)>和稀 ,G[N溶液分别调节 UN
为 和 3( 对这 $ 组实验中青霉素效价和空泡比例
对应关系进行比较$分别如图 1"G#)1"6#所示(
""将图 1中结果与图 对照进行对比分析发现%改
变发酵液的 UN$菌丝形态和产物代谢状况都存在一
定差异( 发酵第 天将培养基 UN调节为 后$青霉
素最高效价低于对照组$空泡比例持续上升$但至发
酵结束$最大比例不超过 %h&调节 UN为 3$青霉素
效价最高值在第 ( 天就出现$仍低于对照组$此时空
泡比例约 4h$第 # 天起空泡比例继续上升至超过
1%h$青霉素效价降低明显( 这表明 UN的改变影响
图 V?不同9"条件下青霉素效价及空泡比例
随发酵时间变化的曲线
O.;=V?,34A012790/.:.6./L.06G15/GA5:326.S5F.2/
942924F.2/1M.F-9"5FG5L Q
青霉素合成以及菌丝空泡比例的变化$同时表明青霉
素效价与菌丝空泡比例之间存在对应关系( 对于青
霉素合成而言$一定比例的菌体异化$即空泡形态是
十分必需和重要的( 青霉素大量合成时$菌丝空泡比
例为 $%hk1%h( 已有研究证实$一定比例空泡的存
在一方面可以增大菌体接触基质的面积$另一方面可
以减少顶端生长对于生物合成的需求$从而更好地满
足次级代谢的需要*&%+ (
""在实验中$UN调低至 $菌体生长相比对照组
呈现迟滞状态$生长相对缓慢$具体表现为空泡形
3$ 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
态出现和膨胀迟缓$所占比例增长缓慢$并且由于
培养基中有效营养成分有限$最终可用于次级代谢
的底物在初级代谢中消耗过多$青霉素最高效价低
于对照组&与之相反$UN调高至 3 加速了菌丝衰老
和断裂的过程$菌丝缩短加剧$空泡比例迅速增大$
虽然青霉素效价可以较快地达到相对较高值$但是
菌丝衰老引发的断裂和自溶现象又会使得产物合
成迅速降低( 这是因为到了发酵后期$培养基中有
效成分消耗殆尽$空泡比例进一步增大至菌体细胞
壁无法承受时$就会发生菌体自溶现象$意味着菌
体进入衰老期(
""采用相同培养基配方$在 c4 .发酵罐中进行
实验 "转速 $$% @2HDE$通气量 1c3 .2HDE$装量
$c( .#$结果如图 ( 所示(
图 W?QN\ [发酵罐中青霉素效价及空泡比例
随时间变化的曲线
O.;=W?,34A012790/.:.6./L.06G15/GA5:326.S5F.2/
942924F.2/1704I0/F0G./QN\ [J.2405:F24
""由图 ( 可知%当发酵环境由摇瓶改为 c4 .发
酵罐后$相比对照组而言$菌丝空泡区域比例增加
缓慢$到发酵结束也仅有 $(h左右$与之相对应的
是青霉素合成也很少( 这表明发酵环境改变也对
产物合成和菌丝空泡产生影响$并且在菌丝空泡比
例较低的情况下$青霉素合成有限$从侧面说明当
菌丝空泡达到一定比例时$青霉素才会大量合成(
Q?结论
青霉素合成与菌丝空泡比例关系密切( 当空泡
区域所占比例达到 $%h时$青霉素开始大量合成(
""""
而当此比例上升至 %h k(h时$产物代谢到达顶
峰( 一旦空泡区域所占比例超过 1%h$也就意味着
菌体衰退的到来$伴随着菌丝自溶现象的出现$产
物合成明显下降( 通过小罐发酵与摇瓶对照的结
果发现$罐中菌丝空泡比例增长缓慢$最大值不超
过 $(h$与之相对应的是青霉素效价水平也很低$
同样验证了一定的空泡比例对于青霉素合成的重
要性(
参考文献%
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