全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月
生"物"加"工"过"程
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收稿日期&$%%. 8&& 8&&
基金项目&国家自然科学基金资助项目$#%.%%%$%)国家重点基础研究发展计划$.-# 计划%资助项目$$%%.*Y-$,-%#%
作者简介&王"舒$&.!,#%"男"山东淄博人"博士研究生"研究方向&生物化工)毛相朝$联系人%"讲师"XN<=;G& I34<=>e>HC7B@H7C?
应用细胞透性化技术快速提取氧化葡萄糖
杆菌胞内右旋糖酐糊精酶
王"舒&"毛相朝&"$"张鲁嘉#"邢艳陇&"王华磊&"魏东芝&"#
$&7中国科学院 青岛生物能源与过程研究所 中国科学院生物燃料重点实验室"青岛 $))&%&)
$7中国海洋大学 食品科学与工程学院"青岛 $))%%#)
#f华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室"鲁华生物技术研究所"上海 $%%$#-%
摘"要&将细胞透性化技术应用到右旋糖酐酶的提取检测过程中"根据单因素实验和正交试验设计确定了从氧化
葡萄糖杆菌$.(/0"-"*%012"$34%-+%细胞中提取胞内右旋糖酐糊精酶$UU=DB%的最佳方法&甘氨酸$PGO%质量分数
&k"_F;:>? N^&%% 体积分数 &k"菌悬液QH
)%%
为 %f g)f%"9L为 )f!&"冰浴处理时间& 4"透性化试剂的提取效率
可达到酶活最大值的 .%k以上 与超声波细胞破碎法相比"该方法条件温和"酶的释放率较高并易于大量试样的
平行实验操作
关键词&细胞透性化)氧化葡萄糖杆菌)右旋糖酐糊精酶)甘氨酸
中图分类号&1f,""""文献标志码&(""""文章编号&&)-$ 8#)-!$$%&%%%# 8%%# 8%
A0G-2J724J0G04H./5G./; J0LG45/J0LG4./510742H1(/2"."+%234
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""氧化葡萄糖杆菌 $.(/0"-"*%012"$34%-+% 是
由我国科学家发明的二步混菌发酵法生产 dC
$d;:=<;? *% 前体化合物 $ 酮基 7 古龙酸
$$NAB:>N7NJHG>?;C=C;@"$NcP(%的重要产酸菌种 右
旋糖 酐 糊 精 酶 $ @BI:F=? @BI:F;?=DB" UU=DB% 是
.(/0"-"*%012"$34%-+利用麦芽糊精和淀粉部分水解
物合成多糖右旋糖酐代谢途径中的关键酶 该酶
可催化供体非还原性末端上的
(
&", 或
(
G")
吡喃葡萄糖基转移到受体的非还原性末端上"形成
(
&", 或
(
G") 糖苷键 近年来"这种特殊的转
糖基酶吸引了越来越多的关注"日本和比利时等几
个研究小组分别对该酶的特性进行了深入的
研究,&-
UU=DB是氧化葡萄糖杆菌的一种胞内酶"提取
胞内酶的传统方法是将菌体细胞破碎后"利用无细
胞提取液进行提取 这种方法所需仪器设备复杂(
操作烦琐(效率较低(重现性差"不利于 UU=DB的跟
踪检测"限制了.(/0"-"*%012"$34%-+右旋糖酐合成
机理及其调控机制等基础理论研究工作的开展
因此"建立简单(快速(高效的提取检测方法对于
UU=DB的研究具有重要意义
近十年来"化学透性化在胞内蛋白提取方面大
量应用 细胞透性化技术$CBG9BF?%是
指在不造成细胞裂解以及不破坏细胞内部有机结
构的情况下改变细胞壁和细胞膜的通透性"使得小
分子物质和一些较大分子物质能够自由地进出细
胞的技术 细胞经过透性化处理后在提高通透性
的同时"整体结构保持完整"对胞内酶仍具有一定
保护作用"可保证胞内酶催化作用的充分发挥"并
延长酶的使用寿命,$- 细胞透性化技术主要包括
有机溶剂法(去垢剂法以及螯合剂法等,# 8&&- 有机
溶剂法常用的试剂主要有甲苯(乙醇(氯仿(丙酮(
丁醇等)去垢剂法主要用 _`BB?N$%(_F;:>? N^&%%(溴
化十六烷基三甲基铵$*_(Y%等)螯合剂法主要用
乙二铵四乙酸$XU_(%等 本文拟通过研究透性化
试剂的种类(浓度(9L等因素"利用透性化技术建立
一种快速提取UU=DB的方法
E?材料与方法
EPE?菌?种
氧化葡萄糖杆菌$.(/0"-"*%012"$34%-+%"保存
于中科院青岛生物能源与过程研究所生物反应工
程团队
EPC?培养基
斜面培养基 $J0T%&山梨醇 !%"酵母粉 $%"
cL
$
5+
,
%f)"aJS+
,
!-L
$
+%f"琼脂 $%
种子培养基 $J0T%&山梨醇 !%"酵母粉 $%"
cL
$
5+
,
%f)"aJS+
,
!-L
$
+%f
产酶培养基$J0T%&糊精 ,%"酵母粉 $%"cL
$
5+
,
%f)"aJS+
,
!-L
$
+%f
EP@?实验方法
&f#f&"细胞培养
将保藏菌种接种于% 温摇床培养$, 4后"按接种量体积分数 &%k接入产
酶培养基"#% l恒温摇床培养)$ 4 所得发酵液
, l下 %%% F0<;? 离 心 &% <;?" 收 集 菌 体" 用
% <<>G0T(9L)f,- 的 L
#
5+
,
缓冲液洗涤后再离
心"收集菌体备用
&f#f$"胞内酶提取
&%"透性化处理"菌体配成一定浓度的菌悬
液后加入一定量透性化试剂"进行透性化处理"所
得菌体即为透性化细胞
$%"超声波破碎"将菌体悬浮在预冷过的
$% #
5+
,
缓冲液中 % l下"超声
波破碎 .% 次$每破碎 D间隔 D"功率#%% M% 再
在, l下离心$&% %%% F0<;?"&% <;?%"得上清液即
为无细胞酶液
&f#f#"透性化条件
&%"单因素实验
=(透性化试剂种类"将一定浓度的各种透性化
试剂加入到菌悬液中"冰浴提取# 4"测定 UU=DB
酶活
2(9L"将一定质量的菌泥加入不同 9L的
L
#
5+
,
缓冲液$% <<>G0T"内含质量分数 &k的甘
氨酸和体积分数 &k的_F;:>? N^&%%%"冰浴处理# 4"
测定UU=DB酶活
C(透性化处理时间"向一定量的菌泥中加入透
性化试剂 $质量分数 &k甘氨酸"体积分数 &k
_F;:>? N^&%%%"混均匀后放置冰浴处理"每隔一定时
间取样测定菌悬液的UU=DB活性
$%"正交实验
根据单因素实验并取相同质量的湿菌体按正
交表安排正交实验
&f#f,"分析方法
UU=DB酶活分析&将一定量的透性化细胞悬液
加入到含底物对硝基苯

H 吡喃葡糖苷$/5P%
)# 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
的L
#
5+
,
缓冲液$% <<>G0T"9L)f,-%中"混匀后
于 #% l 保温 #% <;?" 然后加入碳酸盐缓冲液
$& <>G0T" 9L &%f- % 终 止 反 应 并 强 化 显 色
&% %%% F0<;?离心&% <;?"取上清液"用分光光度计
测定QH
,&%
"计算对硝基酚生成量,&$-
酶活单位定义&在上述反应条件下"每分钟生
成&
!
<>G对硝基酚所需要的酶量定义为一个酶活单
位$R%
C?结果与讨论
CPE?透性化处理单因素实验
$f&f&"透性化试剂的选择
将一定浓度的透性化试剂加入到 .f"$34%-+菌
悬液中"冰浴提取# 4"测定全细胞悬液和无细胞清
液中UU=DB的相对酶活"结果见表 &
表 E?不同透性化试剂作用下胞内YY510的提取效率
F5M60E?#LG45:G.2/07.:.0/:B 27./G45:063654YY510MB J.7S
7040/G904H05M.6.I5G.2/5;0/G1
透性化
试剂 质量分数0k
相对酶活0k
全细胞悬液 无细胞清液
正丁醇 # ,,f-- r&f-# &)f$% r%f.
甲苯 &% $)f) r%f-# .f). r%f&!
*_(Y %f, )f#& r%f$& &f)) r%f&!
_`BB?N$% %f$ $f- r%f$$ &f#! r%f&#
_`BB?N)% %f$ &%f-% r%f-) &f!# r%f&#
苯 #$f$, r&f#% ,f-, r%f$
乙醇 $% f%, r%f#$ #f)- r%f&&
异丙醇 $% &$f)! r%f) $f,, r%f&,
XU_( %f, #$f.# r%f)) )f.& r%f$)
盐酸胍 & #$f!% r%f$ ,f) r%f$&
_F;:>? N^&%% & #%f)! r%f)$ $f#. r%f&!
盐酸胍mXU_( & m%f, &,f&, r%f), f,% r%f%
甘氨酸m
_F;:>? N^&%%
$ m& .$f) r$f$ $-f r&f$!
盐酸胍m
_F;:>? N^&%%
& m& &,f%! r%f#- #f). r%f&)
尿素mXU_( &$ m%f, %f%% r&f&% &-f%# r%f)%
甘氨酸mXU_( , m%f, -!f.$ r&f-. &f)) r%f,
超声波破碎 &%% r&f--
注&&% 超声波破碎与透性化细胞处理均采用相同的湿菌体
量)$% 所有结果均为 # 次测定的平均值
""以超声波破碎的酶活作为 &%%k$以下同%"由
表 & 可知"在透性化试剂作用下"胞内UU=DB仅有少
量释放至胞外"大部分的 UU=DB仍受细胞壁的阻挡
处在胞内环境中 就全细胞悬液的酶活而言"单独
应用某一种化学试剂的提取效率均不理想"相对酶
活小于 %k 而 $ 种透性化试剂配合作用则有利
于细胞壁的破坏及细胞的破碎"其中甘氨酸与
_F;:>? N^&%%的组合对 .(/0"-"*%012"$34%-+的透性
化处理效果最好"相对酶活达到$.$f) r$f$%k
甘氨酸破碎细胞的机理可能是因为小分子的
甘氨酸更易渗透到细胞壁外侧的肽聚糖孔隙间"通
过氢键(范德华引力(静电引力等化学亲和力改变
肽聚糖网状结构"从而改变细胞壁和细胞膜的通透
性"使得胞内蛋白得以释放 _F;:>? N^&%% 是一种非
离子表面活性剂"它具有亲水性部分和疏水性部
分"溶于水后"能溶解细胞壁上的蛋白质"因而具有
破坏细胞壁的作用 .(/0"-"*%012"$34%-+在甘氨
酸和_F;:>? N^&%% 的协同作用下"呈现出了较高的
胞内UU=DB活性
$f&f$"透性化处理条件
根据实验方法 &f#f# 进行各种单因素实验"确
定了透性化处理过程的 9L以及处理时间分别为
9L)f!& 和& 4$图 & 和图 $%
图 E?9"对细胞透性化的影响
Q.;=E?#70:G1279"2/:06904H05M.6.I5G.2/
图 C?处理时间对细胞透性化的影响
Q.;=C?#70:G1270LG45:G./; G.H02/:06904H05M.6.I5G.2/
CPC?透性化处理正交实验
根据单因素实验"选取甘氨酸质量分数$(%(
_F;:>? N^&%% 体积分数$Y%以及 9L $*%为实验因
-#"第 # 期 王"舒等&应用细胞透性化技术快速提取氧化葡萄糖杆菌胞内右旋糖酐糊精酶
素"每个因素 , 个水平"因素#水平安排见表 $ 取
相同质量的湿菌体按正交表T
&)
$#
,
%安排正交实验"
实验结果及分析见表 # 和表 ,"方差分析见表
表 C?透性化处理正交实验设计因素水平
F5M60C?*11.;/0J:2/:0/G45G.2/127R54.5M6015GJ.7040/G
60R061./24G-2;2/56J01.;/
水平 N$甘氨酸%0k
(
(
$_F;:>? N^&%%%0k
Y
9L
*
& . % f!
$ &$ & )f#
# & $ )f!
, &! # -f#
表 @?正交实验设计直观分析
F5M60@?F-024G-2;2/560L904.H0/GJ01.;/5/J45/;05/56B1.1
序号 ( Y * 相对酶活0k
& & & & )%f!-
$ & $ $ -,f,)
# & # # )!f$.
, & , , )$f%,
$ & $ .%f&)
) $ $ & -,f$#
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表 T?正交实验结果分析
F5M60T?*/56B1.127G-024G-2;2/560L904.H0/G
方差源 ( Y *
均值 & ))f,$ --f-, -f%$
均值 $ )!f# !%f&& -#f&%
均值 # ).f-! )$f%, -)f.,
均值 , )!f#$ #f& )f..
极差 #f#) $)f.) &.f.#
""注&实验结果均为 # 次测定的平均值
表 U?方差分析
F5M60U?F-0*<+$*5/56B1.1
因素 离差平方和 自由度 均方差 J值 ?值
甘氨酸 $#f%! # -f-% %f% %f.!
_F;:>? N^&%% &..,f)# # )),f!! ,f&# %f%))
9L .$f!, # #%!f)& &f.$ %f$$!
根据正交实验极差分析和方差分析$表 #(表 ,
和表 %可见"主次因素依次为 Y(*(("且因素 Y
$_F;:>? N^&%%%对实验结果有较显著的影响 因此
确定最佳透性化处理条件为(
#
Y
$
*
#
"即甘氨酸质量
分数 &k"_F;:>? N^&%% 体积分数 &k"9L)f!
CP@?菌体量对细胞透性化效果的影响
在UU=DB提取过程中"菌悬液的菌体浓度对于酶
的提取效率有一定的影响 将菌悬液进行适当稀释"
制成一系列不同QH
)%%
$%f) g&&f&.%的菌悬液"采用
质量分数 &k甘氨酸m体积分数 &k_F;:>? N^&%% 冰
浴处理& 4"测定悬液的UU=DB酶活"结果如图 # 所示
$酶活最大值定为 &%%k% QH
)%%
在 %f) g$f$, 范围
内"酶活与QH
)%%
成正比)但QH
)%%
q$f$, 时"两者成反
比 同时若 %f pQH
)%%
p)f%"透性化试剂的提取效
率均可达到酶活最大值的 .%k以上
图 @?菌体量对细胞透性化效果的影响
Q.;=@?#70:G12770
WDD
2/:06904H05M.6.I5G.2/
@?结?论
本文将细胞透性化技术应用到右旋糖酐糊精
酶的提取过程中"根据单因素实验和正交实验设计
确定了从氧化葡萄糖杆菌$.(/0"-"*%012"$34%-+%细
胞中提取胞内右旋糖酐糊精酶$UU=DB%的最佳方
法&甘氨酸$PGO%质量分数 &k"_F;:>? N^&%% 体积
分数 &k"菌悬液 QH
)%%
为 %f g)f%"9L为 )f!&"冰
浴处理时间& 4"透性化试剂的提取效率可达到酶活
!# 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
最大值的 .%k以上 与传统的物理破碎法相比"该
方法具有所需仪器设备简单(条件温和(易于操作(
简单易行的特点"而且便于大量试样的平行实验操
作 同时细胞透性化技术使胞内酶在稳定的细胞
内环境中发挥作用"从而提高其稳定性和催化效
率 甘氨酸和_F;:>? N^&%% 在破碎细胞的同时又保
持了UU=DB的高活性"可以用于氧化葡萄糖杆菌发
酵表达UU=DB过程目标酶的快速提取(检测"对于
后续开展UU=DB的研究具有重要意义
参考文献&
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本发明公开了一种以木质纤维素类生物质为原料水解重整制备生物汽油的方法 该方法将木质纤维
素类生物质的水解原料液直接进入水相催化重整系统"依次在填充有催化剂/;0S;+
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的低温重整反应
器和填充有/;0LKSaN 的高温重整催化器中进行水相催化重整反应"反应物冷凝后气液分离"未冷凝的生
物汽油减压后由吸收液*) 烷烃吸收)液体经相分离器进行相分离"在相分离器的上层得到生物汽油 本发
明开辟了一条以生物质为原料制备高品位液体燃料油的新方法"该方法能自动分层分离"避免了产品精馏
提纯等工艺"原料来源广泛而低廉"产品可直接用于现有的车载发动机系统"具有良好的市场前景
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.#"第 # 期 王"舒等&应用细胞透性化技术快速提取氧化葡萄糖杆菌胞内右旋糖酐糊精酶