全 文 ：第 １３卷第 ２期
２０１５年 ３月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ２
Ｍａｒ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０２􀆰 ０１１
收稿日期：２０１４－０３－１１
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２０１２ＣＢ７２１１０３）
作者简介：王　 磊（１９８２—），男，山东济宁人，博士研究生，研究方向：生物化工；赵宗保（联系人），研究员，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｈａｏｚｂ＠ ｄｉｃｐ．ａｃ．ｃｎ
基于海泡石的细胞透性化
王　 磊，刘玉雪，谭海东，刘武军，赵宗保
（中国科学院 大连化学物理研究所 生物技术部，辽宁 大连 １１６０２３）
摘　 要：利用矿石纳米材料海泡石处理大肠杆菌细胞，建立高效、可逆透性化处理方法。 结果表明：海泡石和大肠
杆菌 ＢＷ２５１１３细胞悬液涡旋振荡，细胞通透性增强，９０％以上的细胞因渗入博莱霉素致死；而在 ４ ℃修复处理过的
样品，仅 ２３％的细胞被杀死。 发现烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（ＮＡＤ）进出透性化细胞的能力与胞内外 ＮＡＤ 浓度梯度
正相关。 该可逆透性化方法对生物催化和药物递送等研究具有重要价值。
关键词：细胞透性化；海泡石；博莱霉素；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；矿石纳米材料
中图分类号：Ｑ８１９　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０２－００５７－０３
Ｓｅｐｉｏｌｉｔｅ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
ＷＡＮＧ Ｌｅｉ，ＬＩＵ Ｙｕｘｕｅ，ＴＡＮ Ｈａｉｄｏｎｇ，ＬＩＵ Ｗｕｊｕｎ，ＺＨＡＯ Ｚｏｎｇｂａｏ
（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｉａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄａｌｉａｎ １１６０２３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｃｅｌｌ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ
ｓｅｐｉｏｌｉｔｅ ｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ． Ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｓｅｐｉｏｌｉｔｅ ｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ ａｎｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ
ｖｏｔｅｘｅｄ，９０％ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ， ｗｈｅｒｅａｓ ｏｎｌｙ ２３％ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ
ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｕｐｏｎ ｐｒｏｐｅｒ ｒｅｓｅａｌｉｎｇ ａｔ ４ ℃ ． Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ （ ＮＡＤ） ｗａｓ ｅｉｔｈｅｒ
ｒｅｌｅａｓｅｄ ｏｒ ｔａｋｅｎ ｕｐ ｂｙ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒａｔｅ ｏｆ ＮＡＤ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ
ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ． Ｔｈｉｓ ｃｅｌｌ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ
ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： ｃｅｌｌ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ； ｓｅｐｉｏｌｉｔｅ； ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ； ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＮＡＤ）；
ｍｉｎｅｒａｌ ｎａｎｏｆｉｂｅｒ
　 　 由于存在细胞壁和细胞膜的天然屏障，生物转
化过程中许多物质的胞内外传递都受到跨膜转运
效率的限制。 细胞透性化是指在不造成细胞裂解
的情况下，改变细胞壁和细胞膜通透性，使部分非
透性分子能够自由进出细胞。 细胞透性化技术已
广泛应用于生物技术及生命科学研究中［１－２］。 根据
细胞能否修复，透性化分为可逆透性化及不可逆透
性化。 由于可逆透性化需要严格控制处理条件，通
常采用不可逆透性化处理细胞，用于提高酶稳定性
及生物转化效率［３－４］。 然而，当需要保证细胞存活
率和保持生物催化剂稳定性时，必须采用可逆透性
化。 电穿孔法是最常用的可逆透性化方法，由于其
效率低，通常只在实验室用于 ＤＮＡ 转化及药物治
疗［５］。 经过优化的化学法也能实现可逆透性化，用
于将量子点、蛋白质等纳米颗粒或分子输入细
胞［６－７］。 例如，采用链球菌溶血素 Ｏ 可在肿瘤细胞
膜上造成直径约 ３５ ｎｍ 的可修复小孔，允许相对分
子质量达 １􀆰 ００×１０５的活性蛋白进入细胞，加入 Ｃａ２＋
后约 ５０％的细胞可修复［７］。
海泡石（分子式为 Ｈ４Ｍｇ２Ｓｉ３Ｏ１０）是长约 ５ mｍ、
直径在 １０ ～ ５０ ｎｍ 的针状纳米矿石，远小于
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ的细胞尺寸［８］。 在固体培养基表面
涂布海泡石与细胞悬液可使细胞可逆透性化，实现
质粒 ＤＮＡ转化［９］，但以涂布方式进行细胞透性化难
以达到体系放大的目的。 海泡石可在溶液中形成
均匀的胶体状悬浊液［１０］。
本文中，笔者尝试通过振荡海泡石与细胞的悬
浊液使细胞透性化，用博莱霉素敏感性考察透性化
的效率及透性化后的细胞存活率［１１］，用烟酰胺腺嘌
呤二核苷酸（ＮＡＤ）确定细胞膜的修复时间及分子
通过透性化细胞膜输送的特点，以建立了一种基于
海泡石的高效、易于放大的细胞可逆透性化方法，
对生物催化、药物递送研究奠定基础。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌株与试剂
大肠杆菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３，美国耶鲁大学大肠
杆菌遗传库存中心（Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）；海泡
石，德国 Ｋｒｅｍｅｒ Ｐｉｇｍｅｎｔｅ 有限公司；博莱霉素，
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＮＡＤ、溶菌酶、蛋白胨、酵母粉、琼脂
粉，北京鼎国生物技术有限公司；乙腈，Ｍｅｒｃｋ 公司；
其他培养基及生化试剂（醋酸铵、ＮａＣｌ 等），大连博
诺生物化学试剂厂。
海泡石用磷酸缓冲液（ＰＢＳ） （ｐＨ ７􀆰 ５）配成 ５０
ｍｇ ／ ｍＬ贮液，ＮＡＤ 用去离子水配成 ０􀆰 ２５ ｍｏｌ ／ Ｌ 贮
液，博莱霉素用去离子水配成 １００ ｍｇ ／ ｍＬ贮液。
ＬＢ培养基：１０ ｇ ／ Ｌ 蛋白胨、５ ｇ ／ Ｌ 酵母粉和 １０
ｇ ／ Ｌ ＮａＣｌ，用 ＮａＯＨ调 ｐＨ至 ７􀆰 ０，固体 ＬＢ 培养基加
入 １５ ｇ ／ Ｌ琼脂粉，在 １２０ ℃灭菌 ２０ ｍｉｎ备用。
１􀆰 ２　 透性化 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３的制备
从平板挑 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ 单菌落接种 １００ ｍＬ
ＬＢ 于 ３７ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ 摇床，培养至 ＯＤ６００为 ３􀆰 ４。
２ ０００ ｇ离心 ６ ｍｉｎ收集菌体，菌体用 ＰＢＳ 洗 ２ 遍并
悬浮于 ３０ ｍＬ ＰＢＳ 中使 ＯＤ６００为 １１。 将菌液与 ０􀆰 １
体积海泡石贮液在 １􀆰 ５ ｍＬ离心管中混合，使海泡石
终质 量 浓 度 达 到 ５ ｍｇ ／ ｍＬ， 用 美 国 Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ公司生产的 Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ ２ 涡旋振荡器
振荡处理 ０􀆰 ５ ｍｉｎ，振荡强度为 ２ ７００ ｒ ／ ｍｉｎ（最大功
率）。
１􀆰 ３　 确定透性化效率及修复效率
取 ０􀆰 ９ ｍＬ的 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３与 ５ ｍｇ ／ ｍＬ海泡
石混合后振荡 ０􀆰 ５ ｍｉｎ 进行透性化处理，立即取 ９０
μＬ加入 １０ μＬ 博莱霉素至终质量浓度 １０ ｍｇ ／ ｍＬ，
轻柔混合，剩余的透性化细胞于 ３０ ℃放置 ３０ ｍｉｎ
使细胞膜修复后，取 ９０ μＬ 加 １０ μＬ 博莱霉素至质
量终浓度 １０ ｍｇ ／ ｍＬ，轻柔混合。 以不进行透性化处
理为对照组，将 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３和 ５ ｍｇ ／ ｍＬ海泡石
轻柔混合，于 ３０ ℃放置 ３０ ｍｉｎ，再加入 １０ ｍｇ ／ ｍＬ
博莱霉素轻柔混合。 以上 ３种样品与博莱霉素混合
后于 ４ ℃放置 ３０ ｍｉｎ，使博莱霉素进入细胞，用 ＰＢＳ
稀释 １０５倍，取 ５０ μＬ涂布 ＬＢ 平板，３７ ℃培养 ２４ ｈ
后进行菌落计数，只有透性化后恢复或未被透性化
的细胞可以存活并形成菌落。 每种样品的实验设 ３
个平行样，实验数据为 ３个平行样的平均值。
１􀆰 ４　 确定透性化细胞膜的修复时间
通过检测 ＮＡＤ转运效率随修复时间的变化，确
定透性化处理后细胞膜修复时间。 取 ０􀆰 ８ ｍＬ 的
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３（ＯＤ６００为 １１）与 ５ ｍｇ ／ ｍＬ 海泡石振
荡 ０􀆰 ５ ｍｉｎ进行透性化处理，于 ３０ ℃静置使细胞膜
修复 ０、１０、２０ 和 ３０ ｍｉｎ。 随后分别加入 ２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
的 ＮＡＤ轻柔混匀，以避免后续操作中由细胞透性产
生的 ＮＡＤ渗漏，并于 ３０ ℃静置 ３０ ｍｉｎ 使细胞膜充
分修复。 静置后立即洗涤菌体并浸提胞内 ＮＡＤ。
参照文献 ［ １２］的方法浸提检测胞内 ＮＡＤ。
２ ０００ ｇ离心 ６ ｍｉｎ收集菌体，用 ０􀆰 ９ ｍＬ ＰＢＳ洗 ２遍
加 ０􀆰 ８ ｍＬ 的 １ ｍｇ ／ ｍＬ 溶菌酶，重悬，加入 ０􀆰 ４ ｍＬ
氯仿振荡 １ ｍｉｎ 使细胞充分裂解，１６ ０００ ｇ 离心 １０
ｍｉｎ，取 ０􀆰 ７ ｍＬ上层水相冻干，检测时用 ０􀆰 ２ ｍＬ 醋
酸铵溶解。
使用美国 Ｄｉｏｎｅｘ公司的高压液相色谱（ＨＰＬＣ）
检测 ＮＡＤ浓度。 色谱条件：ＳｉｎｏＣｈｒｏｍ ＯＤＳ ＢＰ 色
谱柱 （ ４􀆰 ６ ｍｍ × ２００ ｍｍ， ５ μｍ）；流动相为 ５０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ醋酸铵（Ａ） 乙腈（Ｂ）溶液（两者体积比为
９５ ∶ ５），等度洗脱；ＵＶＤ１７０Ｕ 紫外检测器，检测波长
２６０ ｎｍ。
１􀆰 ５　 ＮＡＤ输送速率与浓度梯度的关系
在 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ 悬液中加入 ＮＡＤ 至 １、２、
２􀆰 ５和 ３ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 混匀，取 ０􀆰 ８ ｍＬ 与 ５ ｍｇ ／ ｍＬ 海泡
石轻柔混合，混合后振荡 ０􀆰 ５ ｍｉｎ 进行透性化处理，
对照组与海泡石轻柔混合后不进行振荡处理。 透
性化处理样品及对照组于 ３０ ℃静置 ２０ ｍｉｎ 后立即
洗涤菌体并浸提检测胞内 ＮＡＤ，检测方法同上。 透
８５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
性化处理样品及对照组的差值为通过透性化的细
胞膜进入或渗出细胞的 ＮＡＤ量。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３可逆透性化效率
由于透性化处理后，博莱霉素进入细胞而杀死细
胞，可根据透性化细胞在博莱霉素存在下的存活率确
定透性化效率及其中可逆透性化比率。 实验发现，未
经透性化处理的 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３样品在博莱霉素存
在下孵育 ３０ ｍｉｎ 后，细胞存活为每毫升（９􀆰 ０±２􀆰 ３）×
１０６ 个，而经透性化处理后仅为每毫升（７􀆰 ０±０􀆰 ６） ×
１０５ 个，即透性化处理使 ９２％的细胞受到损伤，博莱
霉素进入细胞达到了致死剂量。 然而，当透性化细胞
在 ４ ℃静置 ３０ ｍｉｎ，再用相同剂量博莱霉素混合处
理，细胞存活回复到每毫升（７􀆰 ６±１􀆰 ８）×１０６ 个，这表
明 ７７％的透性化细胞可自动修复。 这是因为海泡石
主要通过物理作用损伤细胞膜，并且相互作用是瞬时
的，不会持续破坏细胞膜的同一位置，有利于细胞自
我修复。 其他细胞透性化处理方法，包括表面活性剂
及有机溶剂处理［４］和链球菌溶血素 Ｏ 处理［７］，透性
化效率或可逆性低于本方法。
２􀆰 ２　 透性化细胞膜的修复时间
由于 ＮＡＤ不能自由透过完整的细胞膜，但细胞
膜受损后 ＮＡＤ就可能跨细胞膜流动，所以可通过检
测 ＮＡＤ转运效率随修复时间的变化规律确定透性
化处理后细胞膜修复时间。 将 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ 细
　 　 　 　
胞与海泡石悬浊液透性化处理，于 ３０ ℃静置，考察
ＮＡＤ渗出细胞的情况，结果见图 １。 由图 １ 可知：
０～２０ ｍｉｎ，胞内 ＮＡＤ的量由 ８􀆰 ３ μｍｏｌ ／ ｇ（以细胞干
质量计）降到 ７􀆰 ９ μｍｏｌ ／ ｇ。 修复 ２０ ｍｉｎ 后，胞内
ＮＡＤ的量维持稳定。 结果表明，用海泡石透性化处
理的 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３细胞在 ３０ ℃下 ２０ ｍｉｎ内自动
修复。
图 １　 透性化细胞膜的修复时间
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｒｅｓｅａｌｉｎｇ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ
２􀆰 ３　 ＮＡＤ转运与浓度梯度的关系
将透性化 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ 细胞在不同胞外
ＮＡＤ含量存在下孵育，进一步考察胞内 ＮＡＤ 含量
变化规律，结果见图 ２。 由图 ２ 可知：当胞外 ＮＡＤ
含量为较低时，胞内 ＮＡＤ 倾向于扩散到胞外；而当
胞外 ＮＡＤ含量为较高时，胞外 ＮＡＤ 扩散进入到胞
内。 说明透性化处理后 ＮＡＤ 依赖于浓度梯度跨细
胞膜运动。
图 ２　 依赖于浓度梯度的 ＮＡＤ透膜现象
Ｆｉｇ􀆰 ２　 ＮＡＤ ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｇｒａｄｉｅｎｔ
３　 结论
基于海泡石的大肠杆菌透性化处理方法具有
高效、可逆、操作简单、易放大的特点。 由于海泡石
通过物理作用损伤细胞膜，没有种属选择性，预计
该方法也可适用于其他微生物细胞。 这种透性化
处理方法将可应用于生物催化、药物递送等研究中。
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（下转第 ９２页）
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ｇｒｏｕｐｓ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙ （ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） ｏｎ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｕｒｉｃａｓｅ ｆｒｏｍ
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ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ （ Ｕｒｉｃａｓｅ⁃ＰＥＧ ２０ ）：
ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｒａｔｉｏｎａｌｅ ａｎｄ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ［ Ｊ ］ ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，
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ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｎ ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｌ⁃ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ［Ｊ］ ．Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ，２００２，２３７（１）：
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ｉｎ ｕｒｉｃａｓｅ⁃ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ：ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙ
（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）⁃ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｕｒｉｃａｓｅ［Ｊ］ ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ，２００１，
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（责任编辑　 管　 珺）
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（责任编辑　 荀志金）
２９ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷