全 文 ：第5卷第2期
2007年5月
生物加工过程
ChineseJournalofBioproeessEngineering
Mav2007
11·
固定化细胞生物催化制备(S)一苯基乙二醇的研究
穆晓清1，徐岩1，聂尧1，刘鑫勤2，李韶辉2
(1．江南大学 生物工程学院教育部工业生物技术重点实验室，无锡214122
2石家庄华清永生液晶材料有限公司，石家庄050061)
摘要：采用海藻酸钙固定化细胞方法能有效提高近平滑假丝酵母催化(RS)一苯基乙二醇(S-PED)去消旋化反应
的稳定性，在优化反应备件下，固定化细胞催化批次由游离细胞的2次提高至6次，严物可保持高光学纯度
(>95％)、高产率(>85俘)。与化学合成液晶掺杂剂S-101j的理化特性对比结果表明，生析催化法制备获得的
(5)一PED能够替代化学法制备的相同产品。
关键词：近平滑假丝酵母；去消旋化；固定化细胞；(s)一苯基乙二醇
中国分类号：QSl；0643 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2007)02—001l一06
Highlyefficientpreparationofenantiopure1-phenyl-1．2-ethanediolas
liquidcrystalchiraldopantbyimmobilizedcellscatalyzingderaeemization
MUXiao—qin91，XUYonl，NIEYa01，LIUXin-qin2，LIShao—hui2
({K。y1,aboratoryo}IndustrialBialechnology，MinistryofEduca ion，SouthemYangtzeUniversity，Wuxi214122．China；
2．ShijiazhuangYongshenglluatsingL quidCrystalCoLtd，Shijiazhuang050061，China)
Abstract：ThestabilityofCandidaparapsllosisCCTCCM203011catalyzingderaeemizafionof(RS)一1-
phenyl一1，2-ethanediol(PED)to(S)-enantiomerwasefficientlyimprovedby ntrappingthecellsinto
calciumalginate．Underoptimizedcon itions，tberunsofbatchreactionwereincreasedfromtwicewith
freecellstosixtimesu ingimmobilizedcells．Afterpurification，theenan iopurityoftheproductwasup
tohigh(>95％)withhighy eld(>85％)．Basedonresultsofcomparisonofthephysicochemieal
characteristicsofliquidrystaldopantS-lOil madebychemicalsynthesisandtheproductmadebybio．
catalyticderacemizatiou，theb productcouldbethexcellentalternativeoftheproductof(S)．PEDby
chemicalmetIlod．
Keywords：Candldaparapsilosis；deracemization；immobilizedcell；(s)一1-phenyl一1，2-ethanediol
(S)-苯基乙二醇((S)-PED)是液晶掺杂剂S一
101的重要手性中间体¨⋯，具有特殊的生物活性
及光电磁性能，广泛应用于手性药物、农用化学品、
精细化学品的制备。利用氧化还原酶催化去消旋
反应生产手性化合物具有可直接作用于外消旋底
物、理论产率高(可达100％)、产物分离简单、条件
温和及环境友好等优点，已成为当今生物催化技术
的研究热点。“，近年来Degussa、DSM、BASF、Met一
收稿日期：2加7—04一】0
基金项目：国家重点基础N-g．发展计划资助项目(2003CB716008)；国家自然科学基垒资助项目(20376031)；教育部长江学者与创新团
队发展计划资助项目(NCE30441498)；新世纪优秀人才支持计划赍助项目(1RT0532)
作者简介：穆晓清(1974一)，男，江苏东台人，讲师，博士研究生，研究方向：生物催化。
联系人：徐岩，教授，E-raai[．vxu@sytueducn
万方数据
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2007年5月 王小艳等：真菌产3和母一。一Glucurmidase酶学性质
土样中分离筛选到65株代谢甘草酸的荫株，对初筛
的65株菌进行摇瓶发酵．发酵液采用薄层层析
(TLc)进行初步定忡，进，步筛选得到了3株蔺，并
通过显微镜鉴定，祈时命名为，)en硎“umsP．Ⅱ一3、
丑甲e犁i彭淄甲．u一20和A掣#曙!z纽5华．Li一62。3株蒲通
过TLc和Lc—Ms榆测分析发酵液，确定甘草酸代谢
后的产物分删为GAMG和甘草次酸，由于甘草酸、
GAMG和甘草次酸的极一阵是依次减弱，因此TLc图
谱·I-甘草酸、GAMG和甘草次酸是依次出观斑点
(图2)、
1
1
图2
¨g2
甘学酸标准品；2一“m“胁M。斗【．10；
却。曙舶。5甲Ⅱ。20。4一却。g。M“印“再2
3株菌摇瓶终点时发酵液w，c检测结果
。11l。．resl】1t仟omferlmentatlonofchmestralns
从图2可知：Jp咖抽!盯mm甲Tjo菌株产伊D—
ch川ron讨ase消耗利用甘草酸后的产物以GAMG
为主；A掣e79澎琳叩．“一20届一D-Glucumnidase代磁甘
草酸后的产物始终以CAMc和H‘草次酸两种物质
存在；而A掣8喈i肛w掣．Li一62卢一D—Glucuronidase催化
甘草酸后的产物只有甘草次酸。3株菌表达的口一D—
Glucumnidase在催化甘草酸后表现出生成产物的多
样性。
2 2 pH对卢一D-Glucuronidase活性及稳定性的影响
用pII为3．8，4．2，4．6，5O，5．4，5．8，6．2，66，
7．o和7．4的磷酸氧二钠一柠檬酸缓冲液分别酣制
2m∥mL的甘荦：酸为底物，研究卢一D—Glucuronjdase
的最适反应pH，结果见图3。＆Ⅲ删Hm甲r。一-3产
的is—D—elueumnidase在pH4．2～46范围内均保持
较高催化活力，最适pH值为4．2；山Pe厂gⅢw印．“一
20口．．[，一clucuronldase在pH4．6～6．6范围内酶活较
高，其最适pH为58；A印P曙渤时印I。1石2卢一D—Glu—
curonidase催化甘草酸反应的最适pH为6．2。
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—恤PcnlcilllumspLl一3．一Aspc‘glllusspLl一20．
—△一^s11Prgllll，ss11I 1—62
国3口DGlucuronldase最适反应pH
F193 TheoPtlmumpHof卢一D—glllcumnidaseactlvl‘y
用上述不同pH缓冲溶液配制的酶液在4℃条
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14． 生物加工过程 塑!鲞塑2j塑
中pH值发生改变会影响细胞酶活，甚至使之失活，
所以采用缓冲液为反应体系，1『|j采1[}j吲定化细胞进
行转化，pH值的影响大人减弱。
2 3反应体系温度对固定化细胞转化反应的影响
研究发现固定化细胞转化反应温度低于30℃
时，反应进程较慢，当温度达到30。c时．产品光学纯
度可以达到97％左右，而当温度继续升高，光学纯
度提高到99．9％，温度提高加快了反应进程，I舸细
胞内的酶系在固定化材料的保护F对湍度的敏感
度降低，不易失活，冈此可以提高转化效率．当湍
度超过45℃时，酶活受到温度影响阿逐渐丧失，转
化能力也随之下降(图2)。
温度，℃
一-一P”o一产率
图2温度对固定化细胞转化效果的影响
Fjg2 E“ectoftemperatllreonenantioselectlvl计
ofimmobilizedce儿
2．4反应转速对固定化细胞转化反应的影响
固定化细胞催化转化反应时，转速／fi仅会影响
到固定化细胞的传质，还会影响到划定化细胞小球
的稳定性。搅拌转速较低时，体系r巾的传质受到限
制，使得反应速度较低，反应较慢，随着搅拌转速的
加快，传质限制逐渐解除，反应得以充分进行，转化
效率提高。而当搅拌转速过高叫，同定化细胞的破
碎程度也随之提高，使其转化稳定性降低。
综合以r两个因素，选择200r／盯lin为最佳转
速(刚3)。该条件下，当底物浓度为70mm01／L时，
摹本完全转化，且此时崮定化细胞完整率保持在
90％左右，基本能满足稳定转化的要求。
25 固定化细胞转化稳定·眭的研究
在同定化全细胞去消旋转化制备(s)一PED的
优化条件r．以不同批次生物转化的产品光学纯度
及产率为指标，考察固定化细胞转化活力的稳定。降。
由图4结果可以看出，固定化细胞的反应稳定
性要高于游离细胞，当反应进行6次左右，反应产品
t善一彝
反府批次
一B一·一产率
图4 固定化细胞转化稳定性的研究
¨g4 stlJdy⋯0n、PrⅫonstahllioy一1mmo¨11zedce
光学纯度都保证在95％以卜，当反应进行7次以上
时，由于固定化细胞小珠开始破碎，加快了细胞的
流失及酶活的损失，使得转化效率降低。同时随着
实验批次的增加，转化反应所需要的辅酶冉生无法
满足去消旋化反应的要求，因此当转化进行到第八
次左右时产物的光学纯度和产率明显r降。
2．6与相同化学合成产品的理化特r|生对比研究
以cnn战如P“叫棚osi全细胞玄消旋化生产的
(5)一PED经过有机萃取以及硅胶柱层析分离纯化
后，利tL|j气质联用(图5)、高效液梢色谱、紫外图谱
以及红外图潜对所得产物(s)一PFD进行分析。牛
物法制备样占占的谱图与(s)一PEI)标准品(sigIua—
A】drich)的完全一致。
(s)一PED是高档液晶合成用手。降掺杂剂s—
101l的手性中问体。通过与化学法合成s一1叭1的
产lfi!l品质进行比较丌J以发现，生物法制备获得的
(5)一PED能够替代化。学法制备的产品(表2)。
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16· 生物加工过程
81 MuxQ，xuY，NlcY ctal-如ndId“pmq”L如s¨∽⋯：
M20301】a11d【l⋯I，“⋯±z．ill¨¨1)ffermer1【“Il⋯ed⋯fornereoln
veⅢonof(s)一1phc”yI—l，2。nhancdioI[J]P⋯ssBlnch衄1，
2005402345之350
9] Ⅵdl_oc。P。d⋯JM，FemandczL0rcnfcG， ta1．Imp眦ment
。fcmgme如dⅥfy，赫llII⋯试sPlf“}vi【、vi^mⅢl仆bll峨“lonlPc}l一
⋯‘⋯‘『J] ‰州如MM曲lolB otechnol，2007，40【6)：
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蔓!查鳌!墨目|
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中国种植生物燃料森林．面积与英国相当
作为争球第三人乙醇生产幽，中国将种植相当下英国的圉上1，33×lo+m：森林|：自：『积，圳来生产用作生
物燃料原材料的树木。
中国国家林业局发言人曹清尧称，中国汁划种植果实岔打}f量高的树木，生产替代一降燃料。该项目将有
助于解决寻找替代能源所面临的问题，确保环境安全。这对卜农户和生物燃料生产商来说是个绝好的
机遇。
国家林业局与小国石油天然气股份有限公司签订了一份协定，将在云南和四川省发展耕地，种植生物
燃料树木。
中国财政部称，中国可能在未束15a投入L5万亿元资金，提高可冉生能源的使用．减少对原汕的依
赖。政府将补贴生物质项目，尤其是牛物柴油和乙醇。
我国科研人员攻克棕榈油转化生物柴油核心技术
继攻克菜籽油、废弃汕转化牛物柴油技术之后，I}r国农科院武汉油料所科研人员最近义攻克棕榈汕转
化生物柴油核心技术——冷凝改良技术。用此技术，将有效提高棕榈油冷凝点，防止棕榈油转化牛物柴铀
时遇低温结晶。
据《湖北口报》报道，和汕菜籽、大豆等相比较，生产棕榈油的油棕树含油量更高，素有“汕王”之称=．其
生产出的棕榈油原料更广阔，价格更低廉。但棕榈油在常态27℃以下时便凝固成结f}i|1体，因此相关技术被
东南亚、非洲等盛产棕榈油国家称作棕榈讪转化生物柴油的“极端技术”。
由中国农科院武汉油料所研究员黄凤洪等开发出的冷凝改良技术，有效克服棕榈油只有在高温r才几J
能转化生物柴油的局限件，将“绿色生物油田”的原料从出野拓展到森林。
(张春鹏)
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