全 文 ：第6卷第1期
2008年1月
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Jan．2008
· 69·
虫草多糖的分离、纯化和初步药效活性研究
范卫强，尹鸿萍，周长林
(中国药科大学 生命科学与技术学院，南京210009)
摘要：以虫草发酵茵丝体为原料提取虫草多糖并对多糖进行结构鉴定和初步药效活性研究。采用水提醇沉和离
子交换纤维素进行分离得到两种虫草多糖，HPLC测定相对分子质量，紫外光谱、红外光谱、部分酸水解、甲基化分
析和高效液相色谱等方法研究单糖组成及连接方式，四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(iTr)检测虫草多糖的活
性。经分离得到中性(CPSl)、酸性(cPs2)两种成分，相对分子质量分别为2．56×104，9．91×104；单糖组成：CPSl
n(葡萄糖)：，l(甘露糖)：厅(半乳糖)：n(阿拉伯糖)=46：36：18：1；CPS2，I(葡萄糖)：，l(甘露糖)：，l(半乳糖)：n(半乳
糖酸)：，l(木糖)：n(阿拉伯糖)：n(鼠李糖)=30：25：14：4：3：3：1。红外谱揭示均合-a罐。CPSl主链含(1—撕)糖
苷键的高度分支的葡甘露半乳聚糖，另有少量葡萄糖分支点在2，3，4位。CPS2主链含葡萄糖(Glc)、甘露糖
(Man)、半乳耱(cal)，分支点主要在3位，侧链合多种单糖。CPSl和CPS2都对顺铂(CDDP)损伤的veto细胞有一
定保护作用。
关键词：连接方式；虫草；多糖；分离中图分类号：删．1 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2008)01-0069—05
Separation，purificationandactivityofpharmacodynamic
actionofpolysaccharidefromCordyceps
FANWei-qiang，YINHong-ping，ZHOUChang—lin
(SchoolfLifeScienceandTechnology，ChinaPharmaceuticalUniversity，
Nanjing210009，China)
Abstract：Thestructureandbiologicala tivityofpolysaccharidesfromCordypeswainvestigated．ne
polysaceharidew separatedbyalcoholandDEAE—celloluseandcharacterizedwithHPLC．IR。UVand
GC．AnacidicpolysaccharideCPS2andanotherpolysaccharideCPSlwereobtained．Themolecular
weightofCPSlandCPs2Was2．56×104，9．91×104，respectively．rIIIeIRspectrarevealedthatthe
twopolysaccharidescontainedOt．1inkage．TheGC／MSindicatedthat11emainchainofCPSlwascom—
posedof1，6．Man，andthebranchchainsWasformedwith2，3，4．Glu；themainchainofCPs2WasWas
composedof1，6一Glu，1，6一Man，1，6一GalandthebranchchainWasformedwith1，3．Gluresidue．Bothof
themshowedprotectionactivityto hevetocell．TwokindsofpolysaccharidecontainedthGlc，Manand
Galinthemainchain．andtheobviousprotectionactivityof hekidneycellWasobserved．
Keywords：conjugation；Cordeps；polysaccharide；purification
收稿日期：2007彤-22
基金项目：云南省院校舍作项目
作者简介：范卫强(1982一)，男。青海西宁人，硕士研究生，研究方向：微生物与生化制药。
联系人：尹鸿萍，女，副教授。E．mail：yinhongping@hotmail．com
万方数据
·70· 生物加工过程 第6卷第1期
多糖是存在于自然界的醛糖和(或)酮糖通过
糖苷键连接在一起的聚合物，是一切有生命的有机
体必不可少的成分，与维持生命的种种生理机能有
着密切的联系。近年来对多糖的分离、纯化、结构
测定、活性测定及结构修饰已成为研究的热点。多
糖分离采用DEAE．纤维素、DEA、凝胶及其他凝胶柱
层析法(国外采用LKB柱层析系统)。多糖结构分
析主要有甲基化法、酸或碱的部分降解法和酶解法
等。冬虫夏草首载于《本草从新》，味甘，性温。归
肺、肾经。具补肺益肾，止血化痰之功效，虫草水提
物中有效部位为虫草多糖，笔者对其进行提取、分
离、纯化得到两种成分，对其结构及初步药效进行
实验，研究结果证明其两种多糖均对肾细胞确有保
护作用。
1材料与方法
1．1实验材料
虫草发酵菌丝体长兴制药有限公司
1．2主要试剂
DEAE-纤维素；vero细胞引自中国科学院上海
生物化学与细胞生物学研究所细胞库；注射用顺铂
锦州九泰药业有限责任公司；标准糖中国药品生物
制品检定；盐酸、乙醇、氢氧化钠、高碘酸钠均为国
产分析纯。
2实验方法
2．1虫草多糖的提取。分离，纯化
2．1．1提取
lO倍水浸提虫草菌丝体，离心取上清。Sevage
法去蛋白，浓缩并以乙醇沉淀，无水乙醇洗涤，烘干。
2．1．2离子交换纤维素分离
提取物离子交换层析，先水洗脱后NaCI溶液梯
度洗脱，并分别将两种洗脱成分冻干得中性的CPSl
及酸性的CPs2。
2．2 纯度鉴定及相对分子质量测定
2．2．1紫外吸收光谱
将CPSl、CPS2配成溶液，在200～400nln全波
段扫描。
2．2．2相对分子质量测定[1_2】
高效凝胶过滤色谱法。色谱柱：二根多糖专用
凝胶色谱柱串联，流动相0．3mol／LNaN03，流速
0．5mL／min，柱温35℃；示差折光检测器；样品溶
于流动相中，膜滤后进样。
2．2．3多糖含量测定
多糖含量测定采用硫酸一苯酚法睁】。
2．3多糖的结构研究
2．3．1单糖组成分析H。5J
多糖样水解为单糖，PMP衍生，反相高效液相
色澎紫外检测器分离检测。色谱条件：色谱柱
ZORBAXEclipseXDB—C18，250mm×4．6mmid，5
斗m；流动相：O．1mol／L磷酸盐(pH6．7)缓冲液一乙
腈(体积比为73：15)；柱温：30℃；检测波长：250
nm；流速：1mL／min；进样体积：20ttL。
2．3．2多糖的红外光谱
多糖与KBr压片帕j，于4000～400crn。1进行红
外扫描。
2．4单糖连接方式分析
2．4．1部分酸水解
取CPSl、CPS2各30mg，依次用0．05，0．20，
0．50mol／L三氟乙酸分次水解，每次水解后样品透
析并分别将透出液浓缩冻于，水解后得16份样品，
混合标准单糖进行衍生测定。
2．4．2甲基化分析[7。1]
(1)羧基还原
称取少量CPS2样品，NaBD。溶液进行羧基还
原；对水透析、冻干后。溶解后用乙醇／甲酸液除去
硼酸根，N’吹干，得羧基还原多糖样品。
(2)甲基化反应
CPSl和经羧基还原的CPS2多糖样品用无水
DMSO溶解，加入NaOH和碘甲烷进行甲基化反应；
反应液用二氯甲烷萃取，过无水Na：SO。柱，收集滤
液，N：挥发至干。
(3)甲基化反应产物的水解、还原和乙酰化
甲基化反应产物用TFA水解，N：吹干后，用
NaBH。还原；加甲醇除硼酸根，吹干；再加乙酸酐，
100℃进行衍生反应，再吹干后得糖醇乙酸酯衍生
物。样品用二氯甲烷萃取后，过Na：SO。柱，收集滤
液，待GC．MS分析。
(4)GC—MS分析条件
OVl701毛细管柱(FD．25mm×30mm，膜厚
0．25rain)，程序升温：起始温度150℃，3℃／rain升
温至250℃，停留10min，载气为氦气。EI+源。电
子能量70eV，接口温度250℃，离子源温度200oC，
检测器电压1000V。
万方数据
2008年1月 范卫强等：虫草多糖的分离、纯化和初步药效活性研究 ·71·
2．3多糖活性研究¨zJ
以含体积分数10％小牛血清的RPMI一1640培
养液培养vero细胞，加入不同浓度的虫草多糖和顺
铂(CDDP)，MrI-I法观察肾小管上皮细胞存活以及
生长的状况，进行统计学处理。并通过倒置显微镜
拍照以观察细胞形态的变化。
3实验结果与分析
3．1 纯度鉴定及相对分子质量测定
3．1．1多糖DEAE梯度分离结果
上样后，蒸馏水洗至无糖流出，流出液浓缩冻
干得白色中性多糖CPSl。用0～2mol／LNaCI溶液
梯度洗脱，部分收集器以每管2mL收集，硫酸苯酚
法测A。帅，得梯度洗脱曲线见图1。
0．7
，、0．6
—0．5
蔼o·4
爱0．3
堇o．2
胃0．1
0
管数
图l多糖梯度洗脱曲线
Fig．1Thecurvesofgradientlution
·4
．2
．0
·8 g
．6 q
．4
．2
盐浓度计算公式：
c=cA一(c^一c口)∥Ⅳ肥(A。=A2，所以公式变为
c=c。一(c。一c口)y，做曲线)。式中：c。、c。为两容器
中的盐浓度；A。、A：为两容器的截面积；V为已流出
洗脱量对溶液总量的比值。
由图1可知：酸性成分为纯一组分，由图计算得
其洗脱盐浓度为0．27mol／L。将盐洗脱样合并透析
冻干，得酸性多糖CPS2。
3．1．2测定多糖质量
多糖中两种组分的组成为：CPSl91．4％；
CPS280．6％。
3．1．3多糖的紫外吸收试验
两个样品在260nm和280nin处无吸收，可以
推定两种样品基本不含核酸和蛋白。
3．1．4多糖的HPLC分析
经HPLC分析，分离得到的两个组分都为单一
吸收峰，这表明两个成分为均一成分。其相对分子
质量分别为：CPSl2．56×104，CPS29．91×104。
3．2多糖的结构研究
在确定所分离得到的两个样品为纯品后，再对
其进行相应的单糖组成分析。
3．2．1样品中主要单糖相对摩尔比
根据2．3．1节中所述方法，得到样品的单糖组
成如下：
CPSl为／7,(葡萄糖)：n(甘露糖)：n(半乳糖)：
n(阿拉伯糖)=46：36：18：1；CPS2为n(葡萄糖)：
n(甘露糖)：n(半乳糖)：n(半乳糖酸)：n(木糖)：
n(阿拉伯糖)：n(鼠李糖)=30：25：14：4：3：3：1。
3．2．2红外光谱分析结果
CPSl和CPS2在3550～100cm一均有0．H伸缩
振动吸收峰，1663cm-1和l638cm。1处有强吸收峰为
多糖分子中1，C=0的伸缩振动吸收峰。840cm。的吸
收峰证明连接甙键为d一型；810cm～、872cm。1附近的
吸收峰可知两种多糖分子中均含有甘露聚糖。
3．3单糖连接方式分析
多糖组成中的单糖构成是多糖性质的一个重
要指标，也影响其活性的重要原因。通过部分酸水
解结及甲基化图谱可以得到其结构的重要信息，为
它们的活性研究打下基础。
3．3．1部分酸水解试验
对样品进行部分酸水解，其结果见表1。
表1 CPSI、CPS2部分酸水解样品的单糖组成
Table1 TheresultofpartacidhydrolysistoCPSI，CPS2
注：CPS2主链及支链上均有葡萄糖醛酸及半乳糖醛酸，限于篇幅，不列入表格中。
万方数据
．72· 生物加工过程 第6卷第1期
3：3．2甲基化试验
样品CPSl、CPS2在酸水解试验后，又对样品分
一
别进行了甲基化试验，其结果分别见图2和图3。
I 3
一JJ _．J^_L一
5 10 15 20 25 30 35
t／min
图2 CPSl甲基化GC／MS图谱
Fig．2GC／MAStestofCPSI
2
图3 CPS2甲基化C,C／MS图谱
Fig．3GC,／MAStestofCPS2
图2中糖苷键类型分别为：I、2号峰代表Hexp
l_+的特征峰；3号峰代表以，“Hexp的特征峰；
4号峰代表PeIlf1_+的特征峰；5、6号峰代表-+6
Hexpl_的特征峰；7号峰代表．+3，6Hexp1-+的
特征峰；8号峰代表—o，卅Hexp的特征峰；9号峰
代表叫。6Hexpl一的特征峰。
图3中糖苷键类型分别为：1号峰代表Hexp1
_+的特征峰；2号峰代表q，“Hexp的特征峰；3
号峰代表PeIlf1_的特征峰；4、5、6峰代表．+6
Hexpl一的特征峰；7号峰代表一3，6Hexp1-+的
特征峰。Hexp表示吡喃型己糖，Penf表示呋喃型
戊糖。
3．4多糖活性研究
CPSl和CPS2在12．5～200pg／mL的浓度范
围内对2．5恤g／mL的CDDP(顺铂)诱导的vero细
胞损伤有明显保护作用(P<0．01)；随浓度增加其
作用愈趋明显，以50斗g／mL，100I乩g／mL的作用较
好。结果见表2。
表2虫草多糖对肾细胞的保护活性
Table2 TheactivityofprotectionofCPSlandCPS2totheverocell
注：扣P
万方数据
2008年1月 范卫强等：虫草多糖的分离、纯化和初步药效活性研究 ·73·
vero细胞培养48h后形态规则，呈多角形铺路
石状，折光性强，轮廓不清。不同浓度的虫草多糖
作用48h后，细胞形态变化不大。CDDP1．25阻g／
mL作用48h后细胞数量减少，部分细胞开始变圆。
CDDP2．5iLLg／mL，5．0I山g／mL组细胞数量明显减
少，多数细胞变圆，皱缩，少量漂浮。CDDP10．0
∥nlL，20．0I山g／mL组细胞数量严重减少，残存少
量细胞，细胞变圆，漂浮，表明veto细胞的生长受到
了影响。经不同浓度的CPSl、CPS2处理后的vero
细胞再加人顺铂(质量浓度为2．5p,g／mL)，则细胞
的数量明显增加，细胞形态明显改善。
4结论
虫草多糖由中性和酸性两种多糖组成，两者均
为单一对称峰，相对分子质量分别为2．56×104和
9．91×104，都是含葡萄糖、甘露糖、半乳糖的杂
多糖。
采用部分酸水解及GC-MS等手段对虫草多糖
中单糖的键型、连接方式及主链、支链的单糖各键
型的比例进行了研究。由研究结果推测，CPSl单糖
连接方式：①高度分支的葡甘露半乳聚糖；②主链
含甘露糖，成1“糖苷键，另有很少量葡萄糖分支
点在4，2，3位。③侧链：主要含葡萄糖，半乳糖，含
微量阿拉伯糖。CPS2单糖连接方式：①高度分支的
酸性葡甘露半乳聚糖；②主链含葡萄糖，甘露糖，半
乳糖，且成1．+6糖苷键：_÷6位与葡萄糖1一位相
连，—岖位甘露糖1-+位相连，—岖位与半乳糖l_÷位
相连，三者的摩尔比约为62．4：24．2：11．6③分支
点主要在3位。④侧链：阿拉伯糖，鼠李糖，半乳糖
醛酸，木糖；也可能有少量葡萄糖，半乳糖；有较多
的非还原末端糖基与葡萄糖的1一位相连。
同时，通过细胞培养的结果可看出CPSl和
CPS2对肾细胞都有一定的保护作用。
多糖的药理活性与多糖的一级结构、高级结构
有关，而与高级结构的关系可能更密切。笔者对冬
虫夏草多糖的结构研究仅限于一级结构的测定，认
为应加强空间构象的研究。多糖的高级结构、侧链
的连接位置、分支密度以及糖链间糖苷键的结合方
式均与药理活性有关，多糖的聚活度、相对分子质
量等也影响其活性。虫草多糖的构效关系研究还
不是很深入，有待进一步加强。
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