全 文 ： 万方数据
2006年5月王永宏等：XenorhabdusnematophilaYL001培养基筛选和培养条件优化 ·59·
1．0％的蛋白胨培养基中不产生抑菌物质[4]，而在酵
母提取物的培养基b一]、LB培养基[8]、海水培养基[9]
和TSB培养基¨叫11中可以产生抑菌物质。因此，本
文对从陕西杨陵筛选的斯氏线虫Steinememasp
YL001的共生菌X．nematophilaYL001的基础培养基
进行筛选并对其培养条件进行研究，为该菌株的应
用研究奠定了基础。
1材料与方法
1．1试验材料
1．1．1供试共生细菌
昆虫病原线虫共生菌X．nematophilaYL001从其
寄主线虫Steinernemasp分离鉴定获得。
1．1．2指示菌
蜡状芽孢杆菌BacillusceFel．Ls，由西北农林科技
大学无公害农药研究服务中心提供。
1．1．3培养基
斜面及平板培养基：NA培养基，牛肉膏3．0g、
蛋白胨5．0g、营养琼脂20g、水1000mL、pH7．2—
7．4；
共生菌鉴别培养基：NBTA培养基，NA+(TIC
0．04g、BTB0．025g)；
摇瓶发酵培养基：YS培养基(Ahurst，1982)L5J：
NH4H2PO,0．5g、K2HP040．5g、M毋04’7H200． g、
NaCl5．0g、酵母提取物5．0g、水1000mL，pH7．0；
YSG培养基(Sundra&Chang，1993)№1：甘油5g、
酵母提取物15g、1mol／LMgS045mL、(NIL)2S042
g、1 mol／LKH2P045 mL、1mol／LK2HP045 mL、
1 mol／LNazS0410mL、水1000mL，pH7．2—7．4；
TSB培养基：胰蛋白胨17．0g、大豆胨3．0g、葡
萄糖2．5g、NaCl5．0g、K2HP042．5g、水1000mL，pH
7．2～7．4：
LB培养基：胰蛋白胨10．0g、酵母膏5g、NaCl
10．0g、水1000mL，pH7．2～7．4；
NB培养基：牛肉膏3．0g、蛋白胨5．0g、水1000
mL。pH7．2～7．4；
NB+NaCl培养基：牛肉膏3．0g、蛋白胨5．0g、
№CI10．0g、水1000mL，pH7．2～7．4；
PP3培养基：示蛋白胨(PE)20．0g、水1 00
mL，pH7．2～7．4；
PP3+NaCl培养基：示蛋白胨(PB)20．0g、NaCl
10．0g、水1000mL，pH7．2～7．4。
1．2试验方法
1．2．1共生菌的培养
将种管保存的共生菌，划线于NA培养基平板
上，28℃培养24～48h，挑取单菌落，再划线于NB．
TA培养基平板上，28℃培养24～48h，观察菌落的
颜色变化，区分初生型和次生型共生菌。菌落为蓝
色，周围培养基中的染料被吸收变为黄色的为初生
型；菌落为红色，周围培养基中的染料不被吸收而保
持蓝色的为次生型。用接种环挑取初生型菌，接种
于摇瓶发酵培养基中，28℃、180r／rain振荡培养16
h，再以5％的接种量转接于相同的培养基中(250
mL三角瓶装液50InL)，28oC、180r／min培养。
1．2．2无菌滤液的制备
共生菌按“1．2．1”方法培养72h，发酵液在
14000r／min、4℃离心10min，上清液经0．22pan的
滤膜过滤除菌，得发酵液无菌滤液。
1．2．3发酵过程参数检测
OD的测定：取不同时期的培养液，用分光光度
计在600Illn测定发酵液OD值。
DCW的测定：在一定的细胞浓度范围内，光密
度与细胞浓度成正比，因而通过建立光密度与细胞
干重的直线回归方程来测定发酵过程中的细胞干重
(DCW)。
抑菌活性测定：采用琼脂扩散法[12]测定X．ne—
matophilusYII)0I的抑菌活性。将熔化的NA培养基
冷却至45～50℃，加入指示菌(1．5％)摇均，每皿
(d=9．0cm)倒入15mL培养基，制好平板后，用打孔
器(直径7．5mm)在平板上均匀的打3个孔，每孔内加
入100ffL共生菌发酵液无菌滤液，以培养基为对照，
在28℃培养24h，测量抑菌圈的大小。抑菌活性以
产生相同抑菌圈直径的庆大霉素的含量表示。
2结果与讨论
2．1 不同培养基对XenorhabdusnematophilaYL001
生长和抑茵作用的影响
在生物农药的生产过程中，要提高微生物次级
代谢产物的产量，必须生产足够数量的菌体细胞，并
且还要求能尽量长时间维持菌体的生长。为此选择
培养基时，必须考虑培养基对菌生长的影响，既不能
使其中营养物质过多，促进菌体的过量生长，抑制抑
菌物质的合成，又不能使营养物质过少，引起菌体易
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2006年5月王永宏等：XenorhabdusnematophilaYL001培养基筛选和培养条件优化 ·61．
电图2可敬看出，不同培养基对共生菌的生长
有较大的影响。在不同培养基中，X．nematophilus
YL001的细胞干重有较大的差异，其中在NB培养基
中最大干细胞重最小，仅为4．44彩毛；在YSG培养基
中最大，为15。22影L。表明在供试培养基中，NA培
养基不利于共生菌的生长，而YSG培养基对共生菌
的生长十分有利。在不同培养基中，达到最大于细
腱重器时阚不同。
由于共生菌的胞内代谢产物也具有抑菌活性，
在筛选培养基时既要考虑发酵液抑荫活性的大小，
也要考虑缨胞懿生长爨。圭表2可以看出，YI．B01
菌株在PP3+、PP3和YSG培养基中培养时押麓活
性无明显差异，但细胞生长量有显著差异，在YSG
培养基中，DCW为15。22g／L，明显大于其它培养基
中的细脆生长量。
因此，结合共生菌在不同培养基中的抑菌活性，
综合考虑实验结果和培养基的组成，选择YSG培养
基为X．nematophilusYL001的基础培养基。
2．2初始嘏对YL001蘸株生长和抗蓠活性的影晌
pH主要影响酶活、菌对基质的利用速率和细胞
结构，从而影响菌体的生长和产物合成。在上述筛
选约基础培养基静基磁上，实验研究了遵分舅l在
4．0，5．5，7．0，8．5和10．0时对YL001菌株生长和抗
菌活性的影响，结果如网3所示。
20
15
lO
5
0
4 5．5 7 8．5 10
P珏
3。
25
20
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15毒
Q
10
5
0
一一一菌体质量浓度；一◆一抑翁圈直径
图3 pH对X．nematophilusYII)01生长和抗菌活性的影响
Fig．3EffectofpHongrowthandantibioticactivity
ofX。nematophilusYl_tⅪl
培养基初始pH在5．5～8．5范围内，菌体质量
浓度和抗菌活性差异不显著，说明该菌对pH的适
应性很好。培养基最佳初始p珏炎7。0。
2．3摇瓶装液量对13_D01菌株生长和抗菌活性的影响
装液量的不同会导致培养基中溶解氧含量的不
同，这对菌体生长和产物合成会造成影响。在250
mL三角瓶中分罴装入25、50、75、100煮125mL鹃
YSG培养基，接人静子液，培养72h，测定缨胞生长
量和抗菌活性。装液量为25mL时细胞生长量和抗
菌活性最高(图4)，说明较高的溶氧浓度有利于菌
体的生长和抗蕊物质的产生。因此，YL001菌株摇
瓶培养时的最德装液量为25mL。
3
漆
蕊
U
Q
18
15
12
9
6
3
0
25 50 75 100125
装液量／mL
篓
20窭
鼢
5
0
一-一菌体质量浓度；一◆一揶菌圈蠢径
烫4摇瓶装滚鬃对X．nematophilusYL001玺长和
抗菌活性的影响
Fig．4Effectofmediumvohlmeongrowthandantibiotic
activityofX。nematophilusYL001
2．4摇床转速对YII)01菌株生长和抗菌活性的影响
调节摇床转速是改变培养基中溶氧浓度的主要
手段，而溶氧对共生菌的生长秘抗菌活性密较大的影
赡喇3，毽既摇床转速可影麓YL001菡株黔生长帮抗
菌活性。由图5可以看出，随着摇床转速的增大，
YL001菌株的菌体质量浓度抗菌活性也逐渐增大。
YL001菌株摇瓶培养时的最佳攘床转速为220r／min。
20
，、15
一
妻10
高 5
O
80 115150185220
摇床转速／(r／min)
30
25
20
15
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5
O
一_一菌体质量浓度；一◆一抑菌圈直径
圈5摇床转速对X。nematophilusYID01生长靼
撬蓥活瞧的影璃
Fig．5Effectofshakingspeed011growthandantibiotic
activityofX．nematophilusYL001
2。5湿度对YL001菌株生长和撬菌活性的影响
由图6可以看出，温度对YL001菌株的生长和
抗菌活性有较大的影响，高温和低温均不利于其生
长和抗菌物质的产生。YL001菌株发酵的最适湿度
为28℃，就器季蘸体质量浓度达15．23g／L，撵菌鋈直
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㈣脚施c出0109y，1994，60删-721．
淀粉生物塑料开始在我国规模化生产
最近。一种以谷物、薯类等植物淀粉为原料的生物塑料由武汉华丽环保科技有限公司自主研发并开始
规模生产。该生物塑料中淀粉质量分数大于80％，使用后可l∞％豳归大崮然，对环境无毒无污染，该材料
的性能及工业生产技术达到了图际先进水平。武汉华丽公司经过多年研究，通过化学和物理方法对淀粉进
行改性和塑化，使其成为集刚性、韧性、柔性和弹性于一体的新型环保材料。据介绍，这种生物塑料的原料
是淀粉，因此生产成本低，价格比国外的同类产品低1，3；另一方面Eij于它含淀粉80％以上，因此降解性能
好，在自然环境条件下，它可以完全分解为二氧化碳和水，对环境不产生任何污染。
(贾红华)
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