全 文 ：第6卷第4期
2008年7月
生物加工过程
ChineseJo山1lalofBioproce8sEngineerirlg
Julv2008
· 19·
除虫菊内生镰孢茵Y2发酵
条件优化及其抑菌活性
易晓华，冯俊涛，韩立荣，李永强，张 兴
(西北农林科技大学 无公害农药研究服务中心，陕西省生物农药工程技术研究中心，杨凌712100)
摘要：从除虫菊叶中筛选到1株内生真茵凡船矗册叩．Y2，对其进行了基础培养基的筛选及培养条件优化研究。
结果表明，Y2菌株的较佳发酵培养基为：每L培养基中含有麦芽糖lOg、蛋白胨6g、KH2P0。2g、Kcllg、嘲
O．02g、Mgs04·7H20lg；较佳发酵条件为：初始pH8．5，250mL三角瓶装液100nlL，摇床转速180r／lllin，培养温
彪8．0℃。接种量2l％。在此条件下与原始发酵条件相比，Y2茵株发酵液对番茄灰霉病茵茵丝生长抑制率达
98．6％，提高了6．8％；对其孢子萌发抑制率迭95．4％，提高了16．1％；其茵丝生长量(干质量)达8．9r75ⅡIg／mL，增
加了7．8％。
关键词：除虫菊；内生真茵；基础培养基；筛选；条件优化
中图分类号：TQ920．6 文献标志码：A 文章编号：1672—3678(2008)04一ool9—06
Optimizingfe珊entationconditio璐andantibioticactivity
ofstrainY2fhm毋彤砌旭册c跏删而归西池mTreV．
YIXiao—hua，FENGJun-tao，HANLi—rong，LIYong—qiang，ZHANGXing
(Eflgine甜Ilg衄d‰llll砒DgyRe∞aI．chCe呲er0fBiopesticide0fSh舳n】‘iPro“nce，Re∞arch锄dDeVel叩Ⅲem
CenterofBi叽ati帆alPe8ticide，Nonll唧tA加c dnlral锄dF0嘣哪uniV哪畸，Y肌班ng712100，Chj腿)
A搬眦t：Ane doph)rticfungusof 叽inY2舶mleavesof即#^形mc妇m^咖Zi肼I7Irev．w砸iden曲ed
鸽fko矗肼Isp．，舳dinvestigationonoptiIIlalincubationconditio啮锄d锄tibioticacti、ri哆wereconduc-
ted．TheresIlltshowedt}latb够icllltu聆mediaw remaltose10g，peptone6g，KH2P042g，KCll g，
FeS040．02g，MgS04·7H201 gperliter．711leoptimalincubati蚰conditio鹏ofin tialpH，mediumVol—
umeinn鹤k，shakirIgspeed，temperatu陀，蛐dinoculali∞啪untwere8．5，100mL，180r／IIlin，28
℃，alld21％，respectively．Undertlle叩tiInalcondition，tlIebiom舾sweig}It锄dtlleantibiotic卸tiV时
were8．975mg／mL龃d98．6％，tlIusinclle鹪ing7．8％卸d6．8％，respectiVely，compariedwitlltIle∞
oftlIeinitialconditions．
Keywords：P，赢mci聊删吨向玩mTbev．；end叩hyticfung ；ori百nalmedium；screenirIg；o州IIlization
从天然产物中筛选生物活性成分或先导化合物 是研究创制新药的有效途径之一。内生真菌不仅种
收稿日期：2007．1l-14
基金项目：国家“十五”科技攻关重大专项资助项目(2002BA516A04)
作者简介：易晓牟(1972一)，女，四川垫江人．博士，研究方向：天然产物研究与开发。
联系人：张 兴。教授，博士生导师。E·叫Iil：峨1952@126．o∞。
万方数据
·20· 生物加工过程 第6卷第4期
类及数量庞大，而且能产生多种次生代谢物质，这些
代谢产物具有多种化学结构，在医药和农业上具有广
泛的生物活性⋯；内生真菌还可通过人工接种被导入
不同的植物并可通过宿主的种子进行遗传，这些特征
使得内生真菌有望作为生物农药的新来源。
胁n—Hmsp．Y2菌株是从除虫菊叶中分离得
到的1株内生真菌，其发酵滤液对番茄灰霉病菌等
6种病原真菌的菌丝生长有较好的抑制作用，且对
黄瓜霜霉病和番茄灰霉病有较好防效，具有一定的
应用潜力BJ。虽然微生物具有合成某种产物的潜
力，但要想在生物反应器中最大限度地合成所需产
物却非易事。发酵是一种复杂的生化过程，发酵好
坏涉及诸多因素，除了菌种的生产性能，还与培养
基的配比、原料的质量、灭菌条件、种子质量、发酵
条件和过程控制等有密切关系∞J。为了进一步了
解发酵培养基中关键营养成分及发酵条件对Y2菌
株菌丝生长及抑菌活性物质的影响效果，提高抑菌
物质的含量，笔者根据内生真菌生长所需营养要素
的基本原则及其发酵的一般规律，结合相关文献报
道与前期试验，对Y2菌株发酵培养基进行了优化。
1材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1供试菌株
内生真菌Y2菌株从新鲜除虫菊叶中分离得
到，保藏于西北农林科技大学无公害农药研究服务
中心。
1．1．2指示菌
番茄灰霉病菌肋t彤如c讹九∞，由西北农林科技
大学无公害农药研究服务中心提供。
1．1．3斜面及平板培养基
PDA培养基HJ。
1．1．4种子培养基
马铃薯葡萄糖培养基(PD)HJ。
1．1．5摇瓶发酵培养基
马铃薯葡萄糖培养基(PD)㈨，GM培养基‘51；
cSA培养基№1；豆芽汁蔗糖琼脂培养基(Dz)№1；J础b
培养基‘71；察氏培养基(CS)‘81；YPs培养基‘91；No．9
培养基‘m1；无机盐淀粉培养基(WD)‘4|。
1．2 F．sp．Y2发酵培养及发酵滤液制备
将种管保存的Y2菌株，先转接到PDA培养基上
培养5—7d，待菌落长满皿，打取直径4姗的菌饼，接
种于不同液体培养基中(15个菌饼／瓶，150r-·L／瓶，每
次处理3瓶)，25℃，130r／rIlin下振荡培养7～10d后，
作为种子备用；将上述条件下培养的Y2菌株发酵液在
4℃、9000r／IIlin下离心20rIlin，吸取上清液经0．22
¨肌的滤膜过滤，得无菌滤液，以供生测用。
1．3，．叩．Y2生长量测定
取1．2中离心后的沉淀(菌丝)，45℃烘干至
恒质量，分别称其质量，取3次重复的平均值。
1．4抑菌活性测定
采用孢子萌发法和生长速率法¨¨测定Y2菌株
发酵液对番茄灰霉病菌孢子萌发和菌丝生长的抑
制作用，每处理重复3次，取其平均值计算抑制率。
1．5 C源和N源的筛选
在基础培养基筛选的基础上，保持其中N源
(或C源)和无机盐不变，以不同的C源(或N源)
代替原培养基中的c源(N源)，并且用量保持不
变，制备发酵滤液；在筛选出的C源和N源的基础
上，再分别对其用量和无机盐的用量进行选择，以
Y2菌株的菌丝生长量和对番茄灰霉病菌的菌丝生
长抑菌率为指标，对基础培养基进行优化。
2结果与分析
2．1 培养基对Y2菌株菌丝生长量及其发酵产物
抑菌活性的影响
在不同培养基中，Y2菌株的菌丝生长量有较
大的差异(图1)，其中在cs培养基中最大，培养到
第9天，菌丝干质量达到827．3g，表明该培养基对
Y2菌株的生长十分有利；而Y2菌株在其他8种培
养基中生长时，菌丝生长量明显低于CS培养基，培
养到第9天，菌丝干质量在O．675—3．897g／L。在
不同培养基中，Y2菌株菌丝干质量达到最大的时间
也不同，但大多都是在培养到7—9d，继续培养到
11d，菌丝干质量反而有所下降。
培养基
图l 不同培养基对Y2菌株茵丝生长量的影响
Fig．1E‰tof删北岫叫growtIlofY2
9
8
7
6
5
4
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万方数据
2008年7月 易晓华等：除虫菊内生镰孢菌Y2发酵条件优化及其抑菌活性 ·21·
Y2菌株在不同培养基中培养所得的发酵液对
番茄灰霉病菌的菌丝生长抑制作用不同(图2)，其
中在CS培养基中的抑菌作用最强，发酵培养第10
天的抑制率达91．8％，在YPs培养基中的抑制作用
相对最弱，发酵培养第10天的抑制率仅为39．3％，
在其他6种培养基中第10天的抑制率在70％一
90％之间。Y2菌株在同一培养基中不同时间的抑
菌能力也不同，随培养时间的延长，抑菌活性增强，
在第10天抑菌能力最大，以后抑菌活性基本不变。
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图2不同培养基对内生真菌抑菌活性的影响
Fig．2E胝t0fmedi山加舯曲io如avtivityofY2
综合考虑Y2菌株在不同培养基中的菌丝生长
量和抑菌活性情况，选择CS培养基为基础培养基。
2．2 C源和N源的筛选
C源，按菌丝体利用快慢而言，分为迅速利用的
C源和缓慢利用的C源。前者(如葡萄糖)能较迅
速地参与代谢、合成菌丝体和产生能量，并产生分
解代谢产物(如丙酮酸等)，因此有利于菌丝体生
长，但有的分解代谢产物对产物的合成可能产生阻
遏作用；后者多数为聚合物(也有例外)，为菌丝体
缓慢利用，有利于延长代谢产物的合成，也为许多
微生物药物的发酵所采用。例如，乳糖、蔗糖、麦芽
糖、玉米油及半乳糖分别是青霉素、头孢菌素c、盐
霉素、核黄素及生物碱发酵的最适C源。因此选择
最适C源对提高代谢产物产量很重要p1。
不同C源对Y2菌株抑菌活性的影响不同(图3)。
试验中分别以葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖、麦芽
糖、D一果糖、蔗糖和玉米粉为供试C源，结果表明，
当分别以果糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖为C源时，抑菌
活性均在90％以上，且以麦芽糖为最高，其发酵液
对番茄灰霉病菌的菌丝生长抑制率为96．97％；而
利用其他3种碳源时抑菌活性均低于90％。
N源分迅速利用的N源和缓慢利用的N源。
前者如氨基(或铵)态N的氨基酸(或硫酸铵等)和
玉米浆等；后者如黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉等
C源种类
图3不同C源对Y2菌株抑菌活性的影响
Fig．3Screenjng0fcarbonsourcesfor
Ⅱle{色肋entationmedi岫
蛋白质。快速利用的N源容易被菌丝体所利用，促
进菌丝体生长，但对某些代谢产物的合成产生调节
作用，影响产量。缓慢利用的N源对延长次级代谢
产物的生产期，提高产物的产量是有好处的。但N
源的浓度过大，也容易促进菌丝体生长，使养分过
早耗尽，以致菌丝体过早衰老而自溶，从而缩短产
物的生产期。因此，微生物发酵培养要选择适当的
N源和浓度¨J。
试验中分别以大豆蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、胰
蛋白胨、酵母膏、尿素、鱼粉、豆饼粉和棉饼粉为供
试N源。不同N源对Y2菌株抑菌活性的影响结果
见图4。由图4可知，Y2菌株在利用大豆蛋白胨、
蛋白胨、棉饼粉、鱼粉作为N源时，发酵滤液抑菌活
性均较利用NaNO，时高。因此，选择麦芽糖作为C
源、蛋白胨作为N源替代原cs培养基中的C源(蔗
糖)和N源(NaNO，)。
喜
薹
图4不同氮源对Y2菌株抑菌活性的影响
Fig．4Sc煳iIlgofIlitro萨n∞ur啪lbf
tlIe1．emlentati∞medium
在上述筛选出的C源和N源的基础上，分别对
无机盐的用量、N源、C源进行选择(图5—7)。由
万方数据
·22· 生物加工过程 第6卷第4期
图5—7可见，无机盐增加到2倍量时，发酵产物对
番茄灰霉孢子萌发的抑制率由2．86％剧增到
92．86％，之后随着无机盐的量继续成倍增加，抑制
率几乎不变，超过5倍以后抑制率反而降低；N源蛋
白胨的量逐渐增加，其发酵液的抑菌活性逐渐升
高，当蛋白胨的量为6g时抑制率达到最大，随后蛋
白胨的量增加，抑制率反而下降；麦芽糖的添加量
在10g时Y2发酵液抑制率达到最大，往后麦芽糖
的量逐渐增加，抑制率反而逐渐降低。
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图5不同无机盐量对Y2生长和抑菌活性的影响
Fig．5E‰tofinorg蚰ic8alt§contenton
growth蚰dantibioticac 、rity0fY2
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图6不同蛋白胨量对Y2生长和抑菌活性的影响
Fig．6E艉ct0fpeptom§contem伽growth
锄d锄曲iotic““ty0fY2
圈7不同麦芽糖含量对Y2生长和抑菌活性的影响
Fig．7E丘＆tofmalto∞百contentong哪曲
帅d柏曲i撕cactivitiv0fY2
综合考虑上述试验结果，Y2菌株产生活性物质
的培养基以每L培养基中含有麦芽糖10g、蛋白胨
6g、KH2P042g、KCll g、FeS040．02g、Mgs04·
7H201 g为宜。
2．3发酵条件优化
2．3．1初始pH对Y2菌株生长和抑菌活性的影响
在发酵过程中，pH是变化的，这与微生物的活
动有关，也与有机酸如乳酸、丙酮酸或乙酸的积累
有关，pH的变化会影响各种酶活、菌对基质的利用
速率和细胞的结构，从而影响菌的生长和产物的合
成p1。图8为pH对Y2生长和抑菌活性影响数据。
由图8可知，培养基初始pH在4．0—8．5内，Y2菌
株的菌丝生长量和抑菌活性呈逐渐上升趋势，在pH
8．5时达到最大，在pH8．5—13内则呈下降趋势。
因此，选择培养基较佳初始pH为8．5。
誊
囊
圈8 pH对Y2生长和抑菌活性的影响
Fig．8E丘＆tofpH∞F0砒haIld肌tibioticacti、dt)，ofY2
2．3．2摇瓶装液量对Y2菌株生长和抑菌活性的
影响
装液量对Y2菌株菌丝生长较小而对抑菌活性
影响较大(图9)。装液量为250mL三角瓶装25—
100mL发酵液时，Y2菌株发酵液抑菌活性相当，均
达到90％以上，而菌丝生长量随装液量的增加而增
加，在100mL时最大。综合考虑大量培养时发酵液
和菌丝的收率，选择Y2菌株摇瓶培养时的较佳装
液量为每250mL中装液100mL。
2．3．3 摇床转速对Y2菌株生长和抑菌活性的
影响
由图10可以看出，随着摇床转速的增大，Y2菌
株的菌丝生长量和抑菌活性也逐渐增大，当转速增
大到180r／min时，菌丝生长量和抑菌活性达到最
大，但当继续增大转速时，菌丝生长量和抑菌活性
反而下降。因此，Y2菌株摇瓶培养时的较佳摇床转
速选择为180r／lIlin。
加∞舳∞∞∞∞
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万方数据
2008年7月 易晓华等：除虫菊内生镰孢菌Y2发酵条件优化及其抑菌活性 ·23·
堡
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装液量，mL
图9摇瓶装液量对Y2生长和抑菌活性的影响
ng．9E腑ctofmediumvolumeongrowth
mld肌tibioticac “够0fY2
图10摇床转速对Y2生长和抑菌活性的影响
Fig．10E能ctofshakingspeedongrowth
锄d卸曲i嘶c枷“ty0fY2
2．3．4温度对Y2菌株生长和抑菌活性的影响
温度对微生物的影响是多方面的。首先，温度
影响酶的活性。在最适温度范围内，随着温度的升
高，菌丝体生长和代谢加快，发酵反应的速率加快。
当超过最适温度范围以后，随着温度的升高，酶很
快失活，菌丝体衰老，发酵周期缩短，产量降低旧]。
由图ll可知，温度对Y2菌株的生长和抑菌活
性有较大影响，高温和低温均不利于其生长和抑菌
物质的产生，24—32℃的温度范围比较适合Y2菌
株的生长和抑菌物质的产生，尤其在28℃时，Y2菌
株的菌丝体干质量和对番茄灰霉病菌孢子萌发抑
制率达均达到最大，分别为435．1g／L和94．25％，
因此，选择28℃为较佳培养温度。
蔷
囊
温度，℃
圈ll温度对Y2生长和菌活性的影响
Fig．1lEffectof empenat山汜ongrow山
allda而biotic∞tiv畸0fY2
2．3．5接种量对Y2菌株生长和抑菌活性的影响
接种量是指移种的种子液体积和发酵液体积
之比。随着接种量的增加，Y2菌株的菌丝体生长量
和抑菌活性呈上升趋势(图12)。接种量小于13％
时，随着接种量的增加，菌丝体生长量增势较快；接
种量在13％一21％时，菌丝体生长量增势缓慢，在
接种量为21％时，菌丝体生长量达到最大，继续增
加接种量，菌丝体生长量不再增加；随着接种量的
增加，Y2菌株发酵液的抑菌活性也逐渐增加，当接
种量小于13％时，抑菌活性增加较快；接种量在
13％～21％时，抑菌活性增加缓慢；当接种量为
21％时，抑菌活性达到最大，继续增大接种量，抑菌
活性反而降低。这可能是由于种子量多，种子液中
含有大量胞外水解酶类，有利于基质的利用，并且
生产菌在摇瓶内迅速占优势，从而减少杂菌生长的
机会；但接种量过大，也可能使菌种生长过快，培养
液黏度增加，导致溶氧不足，影响产物合成的缘
故¨J。综合考虑菌丝体生长量和抑菌活性，选择
21％为较佳接种量。
，
■
●
望
鲫
姒
刊
2．4优化条件与原始条件摇瓶培养的比较
根据以上实验结果，得到Y2菌株的摇瓶培养
较佳条件列于表l。
表1 Y2菌株摇瓶发酵较佳条件
7I’able 0ptimalfe咖entati∞conditionfY2
一．-1．掌棚半删
7
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4
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万方数据
·24· 生物加工过程 第6卷第4期
采用表l中所列优化条件与原始条件进行对比
实验，结果表明，与原始条件相比较，优化条件下Y2
菌株发酵液抑菌活性有了一定程度提高，对番茄灰
霉病菌菌丝生长抑制率提高了6．8％，对其孢子萌
发抑制率提高了16．1％，菌丝生长量(干质量)增加
了7．8％(表2)。这说明培养条件的优化效果是明
显的。
表2优化条件与原始条件的摇瓶发酵试验结果比较
眺le2 Compa瑚i∞0f瑚lllt8betwe阴丽gillal
condition锄doptir|lalcondition
条件气篙譬_淼嚣
优化条件 8．975 95．4 98．6
初始条件 8．273 82．2 92．3
3结论
通过以上研究发现，营养及培养条件对内生真
菌Y2菌株的生长和抑菌活性有较大的影响。察氏
培养基作为该菌的基础培养基，适宜于其生长和抑
菌物质的产生；通过对基础培养基的优化，Y2菌株
产生活性物质的培养基以每L培养基中含有麦芽
糖10g、蛋白胨6g、KH2P042g、KCllg、FeS04
0．02g、Mgs04·7H201g为宜。Y2菌株的较佳摇瓶
发酵条件为：初始pH7．O，装液量250mL三角瓶中
装100InL发酵液，摇床转速180r／rrIin，培养温度
28．0℃，接种量2l％，在此条件下菌丝体生长量和
抑菌活性分别达到8．975m∥mL和98．6％，较原始
培养条件分别增加了7．8％和6．8％。本研究结果
为该菌的进一步研究提供了有意义的基础参数。
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