全 文 ：第 １３卷第 ４期
２０１５年 ７月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ４
Ｊｕｌ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０４􀆰 ０１０
收稿日期：２０１４－０４－２９
基金项目：国家自然科学基金（１００７４０１６）
作者简介：李思莹（１９９１—），女， 广东化州人，研究方向：酶学与酶工程；黄卓烈（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｈｕｏｌｉｅｈ＠ ｓｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
海芋过氧化氢酶的分离纯化及其性质
李思莹，黄卓烈，郑华章，黄丹丹
（华南农业大学 生命科学学院，广东广州 ５１０６４２）
摘　 要：为了探索海芋（Ａｌｏｃａｓｉａ ｍａｃｒｏｒｒｈｉｚａ）过氧化氢酶的分子结构和酶学性质，提取海芋新鲜叶片、叶柄和块茎的
粗酶进行活力比较和同工酶分析。 用 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ２００凝胶过滤层析法将粗酶分离纯化，以 ＰＡＧＥ电泳对酶纯度鉴
定。 结果表明：海芋过氧化氢酶较单一，没有同工酶。 经层析法进行分离获得电泳纯的过氧化氢酶，其活力回收率
为 ４０􀆰 ８３％，纯化倍数为 ８􀆰 ８８倍。 十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰氨胶凝电泳（ＳＤＳ ＰＡＧＥ 电泳）分析结果发现：该酶
由 ５条肽链组成，全酶相对分子质量为 ２􀆰 ６２１ １×１０５。 酶学性质研究结果表明：该酶最适反应温度 ４０ ℃，最适 ｐＨ
为 ７􀆰 ５。 在 ２５～４５ ℃和 ｐＨ ６􀆰 ０～９􀆰 ０下，该酶能保持较强的催化活力，稳定性较好。 在最适条件下，该酶的 Ｋｍ 值为
１６􀆰 ４３ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，对底物的亲和力较好。 甲醇、乙醇和异丙醇对此酶活力有显著的抑制作用。
关键词：海芋过氧化氢酶；分离纯化；酶活力；酶学性质
中图分类号：Ｑ５５　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０４－００５２－０６
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｏｃａｓｉａ ｍａｃｒｏｒｒｈｉｚａ ｃａｔａｌａｓｅ
ＬＩ Ｓｉｙｉｎｇ，ＨＵＡＮＧ Ｚｈｕｏｌｉｅ，ＺＨＥＮＧ Ｈｕａｚｈａｎｇ，ＨＵＡＮＧ Ｄａｎｄａｎ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１０６４２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｃａｔａｌａｓｅ，ｃｒｕｄｅ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｌｅａｖｅｓ，ｐｅｔｉｏｌｅｓ， ｔｕｂｅｒ ｏｆ
Ａｌｏｃａｓｉａ ｍａｃｒｏｒｒｈｉｚａ． Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｉｓｏｚｙｍｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｏｒｇａｎｓ．
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ２００ ｇｅｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｐｕｒｉｆｙ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ． Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
（ＰＡＧＥ） ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｐｕｒｉｔｙ． Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｉｓｏｚｙｍｅ ｏｆ ｃａｔａｌａｓｅ ｉｎ Ａｌｏｃａｓｉａ
ｍａｃｒｏｒｒｈｉｚａ． Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ４０􀆰 ８３％ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｗａｓ ８􀆰 ８８ ｆｏｌｄｓ． Ｉｔ ｗａｓ
ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｂｙ ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃａｔａｌａｓｅ ｉｎ Ａｌｏｃａｓｉａ ｍａｃｒｏｒｒｈｉｚａ ｗａｓ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ５ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｔｈｅ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｔｈｉｓ ｃａｔａｌａｓｅ ｗａｓ ２􀆰 ６２１ １×１０５ ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ４０ ℃ ａｎｄ ｔｈｅ
ｏｐｔｉｍａｌ ｐＨ ｗａｓ ７􀆰 ５． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ Ｋｍ ｏｆ ｔｈｉｓ ｃａｔａｌａｓｅ ｗａｓ １６􀆰 ４３ ｍｍｏｌ ／ Ｌ． Ｔｈｅ
ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｍｅｔｈａｎｏｌ，ｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｌｏｃａｓｉａ ｍａｃｒｏｒｒｈｉｚａ ｃａｔａｌａｓｅ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ；ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ
　 　 海芋（Ａｌｏｃａｓｉａ ｍａｃｒｏｒｒｈｉｚａ （Ｌ．） Ｓｃｈｏｔｔ）又名野
芋、狼毒、尖尾和野芋头等［１］，属天南星科海芋属植
物，是一种民间中草药，具有重要的药用价值和经
济价值。 国内外在海芋的开发利用方面做了许多
工作。 隋亚光［２］用海芋治疗慢性萎缩性鼻炎，结果
表明不仅能减轻症状，且有治愈的可能。 亦有报道
以海芋为主治疗慢性支气管炎 ３７ 例［３］。 海芋还可
以抗肿瘤［４］。 国外报道海芋可用于治疗钩端螺旋
体病、毒蛇咬伤和毒蜂蛰伤［５］。 此外，海芋叶资源
丰富，易于种植，营养价值较高，１ ｋｇ 叶粉干物质含
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粗蛋白质 ２４４􀆰 １ ｇ，赖氨酸 １１􀆰 ９ ｇ，蛋氨酸 ４􀆰 ４ ｇ，代
谢能 ４􀆰 ９２ ＭＪ［６］，是一种新的饲料资源。 过氧化氢
酶（ｃａｔａｌａｓｅ，ＣＡＴ）是一类广泛存在于动物、植物和
微生物体内的末端氧化酶。 此酶分子结构中含有
铁卟啉环，１ 个分子酶蛋白中含有 ４ 个铁原子［７］。
典型的 ＣＡＴ又称单功能血红素 ＣＡＴ，几乎存在于所
有真核生物和原核生物的呼吸组织中［８］。 过氧化
氢酶是在生物演化过程中建立起来的生物防御系
统的关键酶之一［８］。
在生物体内有些生物化学反应会产生大量的
Ｈ２Ｏ２。 这种 Ｈ２Ｏ２可以转变成为各种氧自由基。 这些
氧自由基能够破坏 ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白质和酶分子，使这
些大分子断裂，从而失去生物活性。 而过氧化氢酶的
生物学功能是催化细胞内代谢过程形成的过氧化氢
分解，防止氧自由基的形成，从而保护了生物大分子
的结构与功能。 现在，过氧化氢酶已经成为农业、乳
制品业、造纸业和环保产业中有应用价值的酶之
一［９］。 笔者对海芋各器官的过氧化氢酶进行分离和
纯化，并对其分子结构、相对分子质量、催化动力学和
酶学基本性质等进行探索，以便对其有较清楚的
了解。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料与试剂
材料：新鲜海芋的叶片、叶柄和块茎采摘于华
南农业大学校园。
主要试剂：Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２００、标准蛋白质样品和
牛血清白蛋白， Ｓｉｇｍａ 公司； Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ、
ＮａＨ２ＰＯ４·２Ｈ２Ｏ、甲叉双丙烯酰胺、考马斯亮蓝 Ｒ
２５０和 Ｈ２Ｏ２等，国产分析纯试剂；考马斯亮蓝 Ｇ
２５０和考马斯亮蓝 Ｒ ２５０，Ｆｌｕｋａ公司。
１􀆰 ２　 主要仪器与设备
５８１０Ｒ 型冷冻离心机，德国 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 公司；
ＰＢ １０型酸度计，德国赛多利斯公司；磁力搅拌器、
分光光度计、紫外检测仪、垂直板电泳槽和电泳仪
等为国产仪器。
１􀆰 ３　 方法
１􀆰 ３􀆰 １　 粗酶液的提取
新鲜海芋材料用蒸馏水洗干净，擦干。 分别称
取一定质量的叶片、叶柄和块茎，剪碎置研钵中，加
入适量 ４ ℃下预冷的 ｐＨ ７􀆰 ５ 磷酸缓冲液和少量石
英砂研磨成匀浆后，置于 ４ ℃冰箱中静置 １０ ｍｉｎ，用
４层纱布过滤，取上清液在 ４ ℃下 １２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离
心 １５ ｍｉｎ，上清液即为过氧化氢酶粗提液。 ４ ℃下
保存备用。
１􀆰 ３􀆰 ２　 海芋各器官过氧化氢酶活力的比较
配制 ３ ｍＬ反应体系（粗酶液 ０􀆰 ２ ｍＬ、０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ
Ｈ２Ｏ２ ０􀆰 ３ ｍＬ 和磷酸缓冲溶液 ２􀆰 ５ ｍＬ），在 ３７ ℃、
ｐＨ ７􀆰 ５条件下，于波长 ２４０ ｎｍ 处测定海芋各器官
过氧化氢酶的活力。 以每分钟吸光值变化 ０􀆰 ０１ 所
需要的酶量定义为 １单位（Ｕ）。
１􀆰 ３􀆰 ３　 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ） 分离过氧化
氢酶同工酶
取粗酶液 ３ ｍＬ，浓缩至 １ ｍＬ，加入等体积的
４０％（质量分数）蔗糖溶液混匀，并加入 ２ 滴 ０􀆰 ５％
（体积分数）溴酚蓝作为电泳指示剂。 聚丙烯酰胺
凝胶的浓缩胶质量分数 ５％，分离胶质量分数 １２％。
上样量 ３０ μＬ。 样品在浓缩胶时用 １２０ Ｖ 电泳 １ ｈ，
当样品进入分离胶后用 １６０ Ｖ 电泳 ３􀆰 ５ ｈ。 电泳后
脱胶，将凝胶用预冷的蒸馏水稍加冲洗，然后于体
积分数 ０􀆰 ０３％ Ｈ２Ｏ２中浸泡 ２０ ｍｉｎ。 倾去该浸泡液，
用预冷的蒸馏水稍加冲洗后，将凝胶置于 ２％ ＦｅＣｌ３
与 ２％ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ） ６体积比为１ ∶ ４ 的混合液中浸泡，
直至在凝胶上的暗绿色背景下出现黄白色区带［１１］。
１􀆰 ３􀆰 ４　 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ２００凝胶过滤柱层析分离过氧
化氢酶
用 ｐＨ７􀆰 ５磷酸缓冲液 ０􀆰 ２ ｍｏｌ ／ Ｌ平衡 Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ２００层析柱。 取 ２０ ｇ 叶片提取粗酶液，浓缩至 １０
ｍＬ，上样 １ ｍＬ。 用 ｐＨ７􀆰 ５磷酸缓冲液 ０􀆰 ２ ｍｏｌ ／ Ｌ洗
脱，每 ６ ｍｉｎ 收集 １ 管，每管收集 ４ ｍＬ；测定各管过
氧化氢酶的活力和蛋白含量；收集活力最高的一管
酶液，４ ℃冰箱保存。
１􀆰 ３􀆰 ５　 ＰＡＧＥ电泳鉴定纯度
用 ＰＡＧＥ电泳对该酶纯度进行鉴定，分离胶的
质量分数为 １２％，每孔加样量为 ２０ μＬ。 电泳后用
考马斯亮蓝 Ｒ ２５０溶液染色。
１􀆰 ３􀆰 ６　 ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳测定酶的相对分子质量
用十二烷硫酸钠（ＳＤＳ） ＰＡＧＥ 电泳测定该酶各
肽链的相对分子质量，计算全酶的相对分子质量。 分
离胶质量分数为 １２％。
１􀆰 ３􀆰 ７　 蛋白质浓度测定
蛋白质浓度测定参照 Ｂｒａｄｆｏｒｄ［１２］的方法，以牛
血清白蛋白为标准样品。
１􀆰 ３􀆰 ８　 过氧化氢酶的酶学性质研究
１）酶的反应动力学研究　 配制浓度 １０、２０、２５、
５０、８０和 １００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ的过氧化氢底物，分别取 １ ｍＬ
３５　 第 ４期 李思莹等：海芋过氧化氢酶的分离纯化及其性质
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
底物配制成 ３ ｍＬ 反应体系，在 ３７ ℃、ｐＨ ７􀆰 ５ 条件
下测定 ＣＡＴ酶活力，采用 Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ Ｂｕｒｋ 的双倒
数作图法［１３］计算该酶的 Ｋｍ 值和 Ｖｍａｘ值。
２）酶的最适温度和温度稳定性 　 分别测定该
酶在 ２０～ ７５ ℃、ｐＨ ７􀆰 ５ 条件下酶的活力变化，以探
索酶的最适 ｐＨ。 另外将酶液分别放置在 ２５～７５ ℃
下孵育 １ ｈ后测定酶活力，计算相对酶活力并确定
该酶的温度稳定性。
３）酶的最适 ｐＨ 和 ｐＨ 稳定性 　 分别测定 ｐＨ
４􀆰 ５～１０􀆰 ５、３７ ℃条件下的酶活力变化，探索酶的最
适 ｐＨ。 另外将酶液分别在 ｐＨ ４􀆰 ５ ～ １０􀆰 ５ 的缓冲液
中 ４ ℃下放置 ２ ｈ，然后测定酶活力，研究其 ｐＨ 值
稳定性。
４）一些有机溶剂对酶活力的影响 　 分别将甲
醇、乙醇、异丙醇与磷酸缓冲液和酶液混匀，混匀后
有机溶剂的体积分数分别为 ０、１０％、２０％、３０％、
４０％、５０％和 ６０％，在 ４ ℃下放置 １ ｈ，然后在 ３７ ℃
下测定该酶的活力，计算比活力。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 海芋各器官过氧化氢酶活力的比较
海芋各器官过氧化氢酶活力见表 １。 由表 １ 可
知：海芋叶片、叶柄和块茎均含有过氧化氢酶的活
力，其中叶片的酶活力最高，其次是叶柄，块茎的酶
活力最低。 但从比活力来看，则是叶柄的比活力最
高，块茎的比活力最低。
２􀆰 ２　 海芋各器官的过氧化氢酶同工酶电泳分析结果
海芋各器官过氧化氢酶同工酶分离结果见图
１。 由图 １可知：海芋叶片、叶柄和块茎均显示单一
条带，它们的过氧化氢酶均没有同工酶。
２􀆰 ３　 海芋叶片过氧化氢酶的分离纯化及纯度
图 ２为用 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ２００分离海芋叶片过氧化
氢酶的洗脱曲线。 由图 ２ 可知：经过 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ
２００凝胶过滤层析后，在第 ３０ 管之前的分部液中，
　 　 　 　 　
表 １　 海芋各器官的酶活力比较
Ｔａｂｌｅ １　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ
ｏｒｇａｎｓ ｏｆ Ａｌｏｃａｓｉａ ｍａｃｒｏｒｒｈｉｚａ
器官 活力 ／ （Ｕ·ｇ－１） 比活力 ／ （ｍｍｏｌ·ｇ－１·ｍｉｎ－１）
叶片 ６６􀆰 ４２ １０３􀆰 ５２
叶柄 ４􀆰 ３０ １７５􀆰 １８
块茎 １􀆰 ９４ ２３􀆰 ９８
图 １　 海芋各器官过氧化氢酶同工酶 ＰＡＧＥ图谱
Ｆｉｇ􀆰 １　 ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｓｏｚｙｍｅｓ ｏｆ Ａｌｏｃａｓｉａ
ｍａｃｒｏｒｒｈｉｚａ ｃａｔａｌａｓｅ
蛋白质质量浓度曲线出现明显的 ２个峰。 过氧化氢
酶活力出现了 １个明显的主峰，该主峰与蛋白质的
第一个峰重合。
表 ２为海芋叶片过氧化氢酶分离纯化表。 由表
２ 可知：经 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ２００ 分离后， 回收率为
４０􀆰 ８３％，过氧化氢酶被纯化了 ８􀆰 ８８倍。
图 ２　 海芋叶片过氧化氢酶 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ２００凝胶过滤层析
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｏｃａｓｉａ ｍａｃｒｏｒｒｈｉｚａ ｂｌａｄｅ ｃａｔａｌａｓｅ
ｂｙ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ２００ ｇｅｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
表 ２　 海芋叶片过氧化氢酶的分离纯化表
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｔａｌａｓｅ ｏｆ Ａｌｏｃａｓｉａ ｍａｃｒｏｒｒｈｉｚａ ｂｌａｄｅ
纯化步骤 ｍ（总蛋白） ／ｍｇ
总活力 ／
Ｕ
比活力 ／
（Ｕ·ｇ－１） 回收率 ／ ％ 纯化倍数
粗酶液 ５２４􀆰 ５９ ４２ ６１３􀆰 ６５ ８１ ２３０ １００􀆰 ００ １􀆰 ００
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２００ ２４􀆰 １２ １７ ４００􀆰 ００ ７２１ ３９０ ４０􀆰 ８３ ８􀆰 ８８
４５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
　 　 取第一峰的第 ５ 支管的分部液进行浓缩后，作
为样品进行 ＰＡＧＥ 电泳，用考马斯亮蓝 Ｒ２５０ 溶液
染色后，结果如图 ３所示。 由图 ３可知：样品显示为
单一条带，表明分离纯化后第 ５ 管的过氧化氢酶已
达到电泳纯，后续的实验可用此样品进行。
图 ３　 分离后的海芋叶片过氧化氢酶的 ＰＡＧＥ电泳图谱
Ｆｉｇ􀆰 ３　 ＰＡＧＥ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ
ｃａｔａｌａｓｅ ｏｆ Ａｌｏｃａｓｉａ ｍａｃｒｏｒｒｈｉｚａ ｂｌａｄｅ
２􀆰 ４　 海芋叶片过氧化氢酶的相对分子质量
将达到电泳纯的过氧化氢酶样品进行 ＳＤＳ
ＰＡＧＥ电泳，测定其相对分子质量，电泳结果见图 ４。
由图 ４可知：海芋过氧化氢酶由 ５ 条肽链组成。 经
过对 ５条肽链进行计算分析，每条肽链的相对分子
质量分别为 １􀆰 ５１２ × １０４、３􀆰 ８８７ × １０４、 ５􀆰 ３４４ × １０４、
７􀆰 ２１５×１０４和 ８􀆰 ３５３×１０４，因此该酶分子的相对分子
质量为 ２６􀆰 ２１１×１０４。
Ｍ—标准品；Ｓ：海芋过氧化氢酶：ａ～ ｅ： ５条肽链
图 ４　 海芋叶片过氧化氢酶的 ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳
Ｆｉｇ􀆰 ４　 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ ｏｆ
Ａｌｏｃａｓｉａ ｍａｃｒｏｒｒｈｉｚａ ｃａｔａｌａｓｅ
２􀆰 ５　 海芋叶片过氧化氢酶的酶学性质
２􀆰 ５􀆰 １　 海芋叶片过氧化氢酶的催化动力学
图 ５为海芋叶片过氧化氢酶纯酶双倒数法的反
应动力学图，根据图 ５ 可以求得该酶的最大反应速
率（Ｖｍａｘ）为 ２０４􀆰 ０８ μｍｏｌ ／ （ｍｇ·ｍｉｎ），表观米氏常数
（Ｋｍ）为 １６􀆰 ４３ ｍｍｏｌ ／ Ｌ。
图 ５　 双倒数作图法测定米氏常数
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｋｍ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ
２􀆰 ５􀆰 ２　 酶的最适温度与温度稳定性
图 ６为海芋叶片过氧化氢酶在不同温度下的反
应活力。 由图 ６可知：海芋叶片过氧化氢酶的最适
反应温度为 ４０ ℃；在 ３０～５５ ℃范围内，该酶的相对
酶活力均保持在最适温度下反应活力的 ８０％以上。
图 ６　 温度对酶活力的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
图 ７为海芋叶片过氧化氢酶的热稳定性的曲线
图。 由图 ７可知：海芋叶片过氧化氢酶在 ２５ ～ ４５ ℃
范围内的热稳定性较好，孵育 １ ｈ 后，相对酶活力保
持在 ７５％以上；而 ６０ ℃孵育 １ ｈ 后，相对酶活力为
１０􀆰 ７１％，７０ ℃孵育 １ ｈ后，该酶失去活力。
图 ７　 海芋叶片过氧化氢酶的热稳定性
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｔａｌａｓｅ ｏｆ Ａｌｏｃａｓｉａ
ｍａｃｒｏｒｒｈｉｚａ ｂｌａｄｅ
５５　 第 ４期 李思莹等：海芋过氧化氢酶的分离纯化及其性质
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
２􀆰 ５􀆰 ３　 海芋叶片过氧化氢酶的最适 ｐＨ 与 ｐＨ 稳
定性
图 ８为不同 ｐＨ对海芋叶片过氧化氢酶催化活
力的影响。 由图 ８ 可知：海芋叶片过氧化氢酶的最
适 ｐＨ为 ７􀆰 ５，在 ｐＨ ６􀆰 ０ ～ ８􀆰 ５ 范围内，该酶的相对
酶活力均保持在最适 ｐＨ反应活力的 ８０％以上。
图 ８　 ｐＨ对酶活力的影响
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
图 ９为海芋叶片过氧化氢酶的 ｐＨ 稳定性。 由
图 ９ 可知：海芋叶片过氧化氢酶在 ｐＨ ６􀆰 ０ ～ ９􀆰 ０ 范
围内，４ ℃条件下孵育 ２ ｈ 后，相对酶活力均保持在
８０％以上。 在此范围之外，其相对酶活力变化趋势
不大，均保持在 ５０％以上，由此说明该酶的酸碱耐
受性较好。
图 ９　 海芋叶片过氧化氢酶的 ｐＨ稳定性
Ｆｉｇ􀆰 ９　 Ｔｈｅ ｐＨ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃａｔａｌａｓｅ ｏｆ Ａｌｏｃａｓｉａ
ｍａｃｒｏｒｒｈｉｚａ ｂｌａｄｅ
２􀆰 ５􀆰 ４　 一些有机溶剂对酶活力的影响
图 １０为不同浓度的甲醇、乙醇和异丙醇对海芋
叶片过氧化氢酶活力的影响曲线。 由图 １０可知：甲
醇、乙醇和异丙醇对海芋叶片过氧化氢酶均有较强
的抑制作用。 其中，甲醇的抑制作用较乙醇、异丙
醇的强，体积分数为 ５０％时，酶活力完全丧失。
有机溶剂导致酶催化活力减少的因素主要概
括为 ５个方面：①扩散限制和立体障碍；②非水介质
中酶的结构；③构象的可变性；④底物解析和过渡
图 １０　 有机溶剂对酶活力的影响
Ｆｉｇ􀆰 １０　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｏｍｅ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ ｏｎ
ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
态中间物的稳定性；⑤ｐＨ状态。 其他有机溶剂对此
酶活力的作用效果还有待进一步的深入研究。
３　 结论
笔者较详细地研究了海芋的过氧化氢酶。 该
酶的活力回收率为 ４０􀆰 ８３％、纯化倍数为 ８􀆰 ８８ 倍。
该酶的相对分子质量为 ２􀆰 ６２１ １×１０５。 该酶最适作
用温度为 ４０ ℃，在 ２５～４５ ℃范围内孵育 １ ｈ 后，相
对酶活力保持在 ７５％以上，热稳定性较低。 最适作
用 ｐＨ为 ７􀆰 ５，在 ｐＨ ６􀆰 ０～９􀆰 ０范围内，４ ℃条件下孵
育 ２ ｈ 后，相对酶活力均保持在 ８０％以上。 该酶的
酸碱耐受性较好。 最适条件下， Ｋｍ 值为 １６􀆰 ４３
ｍｍｏｌ ／ Ｌ，说明海芋叶片的过氧化氢酶对过氧化氢的
亲和力较好。
甲醇、乙醇、异丙醇对海芋叶片过氧化氢酶均
有较显著的抑制作用，三者的体积分数为 １０％时，
该酶的相对活力均降至 ８０％以下。 其中，甲醇的抑
制作用较乙醇、异丙醇的强，体积分数为 ５０％时，酶
活力完全丧失。
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