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2013
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ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.11No.3
May2013
doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2013.03.010
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CDEFG
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HMNG
:1672-3678(2013)03-0052-07
PurificationchitosanasefromStreptomyceshygroscopious
anditscatalyticproperties
YANGLihong,CHENGShiwei,FENGZhibin,ZHOUNannan,KONGYunhong,MingYongfei
(InstituteofMicrobialEngineering,ColegeofLifeSciences,LudongUniversity,Yantai264025,China)
Abstract:ThechitosanasepurifiedfromStreptomyceshygroscopiousisolatedfromtheofshoreinYantai,
andthenpropertiesofchitosanasewereinvestigatedtoprovideatheoreticalbasisforitsapplication.The
crudeenzymeofchitosanasewasextractedbyammoniumsulfatefractionprecipitation,andtwotypesof
enzyme,(ChAandChB),wereobtainedbygelfiltractionchromatographywithSephadexG100.The
catalyticpropertiesofChAwerefurtherstudied.ThemolecularweightofChAis416kDa,whichwas
monounitprotein,andthemaximumUVabsorbanceswereat220nmand280nm.TheoptimumpHof
ChAwas5055whenchitosanwasusedassubstrateandtheoptimumtemperaturewas55℃.Thermal
stabilityexperimentshowedthat333% ofactivitywasretainedafterheatingat30℃ for1h,222% of
activitywasretainedafterheatingat40℃ for1h.TheinitialreactionrateofChAwas62×10-3
μmol/(mL·min),themaximumratewas0318μmol/(mL·min),andtheMichaelisconstantKm was
10×10-2mg/mL.Furthermore,ChAshowedrelativesubstratespecificity.K+,Na+,Li+,Mg2+,Ca2+,
Ba2+,Zn2+,Cu2+,andCo2+hadlabileefectsontheenzyme,whileMn2+couldactivatetheenzyme.The
heavymetalionsHg2+,Pb2+,Ag+,andCd2+ inhibitedtheenzymeactivity.Mn2+couldmakeamixed
activationefectontheenzyme,butZn2+displayedacompetitiveinhibitionontheenzyme
Keywords:catalyticproperty;chitosanase;bioseparation;Streptomyceshygroscopious
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SC1
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80%(NH)2SO4GH 4 5224 2066 0396 639 261
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SC1
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SephadexG 100
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Fig.1 Elutioncurvesofchitosanaseon
SephadexG100column
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ÓÔ1;Ôf9ghia,-
Fig.2 Polyacrylamidegelelectrophoresisofchitosanase
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3。
ChA
C
SephadexG 75
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5。ChA
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416×104,
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SephadexG 75
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(25000);4—
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(14400)
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Fig.3 Relationshipbetweenelutionvolum
andrelativemolecularmass
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ChA
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6
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ChA
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SC1
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50
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,
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D
4 ChA
;
SDS
Ôf9ghia,-D
Fig.4 SDSpolyacrylamidegelelectrophoresis
ofchitosanaseChA
D
5
k÷cE¿wJ@lm
Fig.5 Standardcurveoflowmolecularweight
D
6
d
T
SC1
ÓÔ1
ChA
;nKo!pD
Fig.6 UVabsorptionspectrumofChAfrom
StreptomyceshygroscopiousSC1
D
7 pH
cª~;de
Fig.7 EfectsofpHontheactivityofChA
55
!
3
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:
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SC1
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ChA
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6
8
á7
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àø÷Î
ChA
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55℃,
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55℃
PZYåi¬pqÎ
Œrs
。
D
8
zscª~;de
Fig.8 EfectsoftemperatureontheactivityofChA
àø÷Î
ChA
h¦Ýå3@46
9。
6
9
á7
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30℃
å
1h
¡Î¬Å0άh
333%,40℃
å
1h
¡Î¬Å0άh
222%,50℃
å
1h
¡Î¬#>i
,60℃
å
45min
¡Î¬#>i
。
D
9
ÓÔ1;qQ+N
Fig.9 EfectsoftemperatureonthestabilityofChA
232
Îk.Í*
、
iÝAÏ
àø÷ÎhÎk.Í\iÝAÏ
3@
,
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10
O6
11。
D
10
rÀ nss;¼+
Fig.10 InitialvelocityofChAforhydrolysisofchitosan
D
11
rÀ tuvï;¼+
Fig.11 Km ofChAforhydrolysisofchitosan
6
10
áQ;0æàø÷Î
ChA
hÎk.
Ív(
Ǻ*
)
Å
64×10-3μmol/(mL·min)。
6
11
á:ÎhiÝA
(Km)Å1×10
-2 mg/mL,
0.Í(Vmax)Å0318μmol/(mL·min)。
233
Îh+jcåÏ
5
2
ÅÎh+jcå783@
。
f
2
d
T
SC1
ÓÔ1
ChA
;½¾wIN
Table2 SubstratespecificityofchitosanaseChA
fromS.hygroscopiousSC1
+ ֤Œ
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100
85%
³é¥\àø÷
875
65%
³é¥\àø÷
551
àôp!
(CMC) 53
õø÷
(40,000) 37
5
2
á7
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ChA
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95%
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,
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,
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n@f
,
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(
tÏ
GlcN—GlcN
÷þÿ
,
ãtÏ
G1cNAc—GlcN
÷þÿ
)[15]。
¦
àø÷Î
ChA
ÔHtÏàôp!
(β 1,4
÷þÿ
)
Oõø÷
(β 1,3÷þÿ),d÷§¬åñ
Å
53%
O
37%。
ChA
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å
,
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,
Á^bRÍüý
。
234
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(Li+、Na+
O
K+)、
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(Mg2+、Ca2+
O
Ba2+)、
*VXWX
(Co2+、
Mn2+、Zn2+
O
Cu2+)
O±VXWX
(Hg2+、Ag+、
Cd2+
O
Pb2+)
§Î¬nhST3@ñ46
12、
6
13、
6
14
O6
15。
65
&
(
)
*
+
!
11
"
D12
ÁIx2&Rücª~;de
Fig.12 Efectsofmonovalentmetalions
onactivityofChA
6
12
á7
:K+、Na+
O
Li+
§ÎJjcË5
。K+
O
Na+
\
015mmol/L
PcË*ñ
Å
2076%
O
2083%,
9
Li+
\
015mmol/L
PcË*=
5122%。
D
13
2y&Rücª~;de
Fig.13 Efectsofalkalineearthmetalions
onactivityofChA
6
13
á7
:Ca2+、Mg2+、Ba2+3
d/ûVX
WX§ÎJjcË5
,
d¢
Ba2+
h\=
0075mmol/L
PcË*á=
5998%,
PWX
\=
005mmol/L
P
Mg2+
O
Ca2+
hcË*ñ
Å
426%
O
1562%,
TVXWX\ñu(cË
+\JóYÝ
。
6
14
á7
:Mn2+
§:Îj#¬5
,
TU
Mn2+
\u(#¬5^Vu(
,
P\=
0125mmol/L
¡#¬}óYÝ
,
dàáb
Mn2+
K¬å¢hʼ
[16]。
K"÷.h
,Zn2+、
Cu2+
O
Co2+
§ÎJjcË5
,
d¢
Cu2+
§Îh
cË+\Bv
,
P
Cu2+
WX\=
01mmol/L
PÎi¬
。
6
15
á7
:Hg2+、Ag+、Cd2+
O
Pb2+
§ÎJ
jcË5
,Pb2+
O
Hg2+
hcË}@BÅ;<
。
P
Pb2+
O
Hg2+
\=
01mmol/L
P>Îi¬
,
D
14
Ãz&Rücª~;de
Fig.14 Efectsoftransitionmetalions
onactivityofChA
Cd2+
\=
0125mmol/L
PÎi¬
,Ag+
\=
015μmol/LPÎi¬。
D
15
&Rüc
ChA
ª~;de
Fig.15 EfectsofheavymetalionsontheactivityofChA
235
VXWX§Î#¬KcË5h¸n
Mn2+
§àø÷Î
ChA
STh¸nÏ3@
46
16。
6
16
á7
:Mn2+
>Îk.h
Vmaxu
0
,KmO@ß,d}Åß#¬5。Mn
2+
3
άå¢Q¦hð9
,
u0íÎK+h©
On
(Km@ß),2P_u(íÎhÍ*(Vmax
u0
),
ÖT#¬\u0#¬+\u0
[16]。
D
16 Mn2+
c;þª).
Fig.16 ActivatedefectsofMn2+onChA
Zn2+
§ÎhSTh¸nÏ3@46
17。
75
!
3
# ¹Kâ{
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6
17
á7
:Zn2+
>Îk.h
KmOu0,VmaxO
^
,
ÅåcË
。Zn2+
§ÎhåcË5
,
áb
Zn2+
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,
9rsíΧ+h©On
,
ÖTcË\hu
0cË+\T"u0
,
9ÎhÍ*^
[17]。
D
17 Zn2+
c;{|).
Fig.17 InhibitedefectsofZn2+onChA
3
_
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£
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、
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,
÷°78
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