全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月
生"物"加"工"过"程
6;CE@G@SDK2E3JDF/CDA2DL@GG^ E4CE@@2CE4
dDJ>! ,D>#
0@A>$%&%
IDC"&%>(5 7`>CGGE>&5*$ ?(5*!>$%&%>%#>%&&
收稿日期"$%&% ?%( ?&#
基金项目"科技部创新基金资助项目#%56$5$&#&%%.*5$
作者简介"李"磊#&!#%$&男&安徽颍上人&硕士研究生&研究方向"微生物与生化药学)余"蓉#联系人$&教授& 1^M3CJ"HK2DE4eGLKf&5(>LDM
采用 8!W
"
大孔离子交换树脂分离低分子肝素
李"磊&温馨蔚&雷"昊&唐万燕&余"蓉
#四川大学 华西药学院&成都 5&%%.&$
摘"要"采用+,-
$
降解法&通过控制降解过程中的 A+和时间裂解低分子肝素&并经大孔离子交换树脂/01
"
对其
进行分离纯化&用质谱法对其相对分子质量进行分析 结果表明"在 A+(h#(. ;的降解条件下&降解得到低分子肝
素 在 %h(. MDJ7Z,36J(A+!h# 的条件下吸附&. MDJ7Z,36J(A+!h# 条件下洗脱&其吸附率达 *h$g&纯化后的低
分子肝素抗凝活性为 (.h.& X7M4&比纯化前提高 &h(5 倍&效价回收率达到 !#h$.g 质谱分析表明&纯化所得低分
子肝素的平均相对分子质量为 ! .&&&5*h.#g集中分布在 * %%% j %%% 段
关键词"低分子肝素)大孔离子交换树脂)分离纯化
中图分类号"Y8.5.""""文献标志码"P""""文章编号"&5*$ ?(5*!#$%&%$%# ?%%.! ?%#
E34.7.:5F.2/2762KJ260:3654K0.;-F-0954./HG J5:42924231
.2/0O:-5/;0401./8!W
"
Z_Z@C&T ,^\CE1N@C&Z^_+3D&YP,QT3E1H3E&]XWDE4
#6DJ@4@DF<;32M3LH& 0CL;K3E XEC[@2GCBH& 6;@E4IK 5&%%.&& 6;CE3$
*H1F45:F"PM@B;DI FD2A2@A32CE4JDNMDJ@LKJ32N@C4;B;@A32CE #ZbT+$ 9HI@ADJHM@2C:3BCDE NCB; EC1
B2DKG3LCI N3GGBKIC@I>)3LBD2GA+3EI BCM@;3I 9@@E CE[@GBC43B@I IK2CE4B;@A2DL@GG>R@ADJHM@2C:@I
;@A32CE N3GAK2CFC@I 9H2@GCE /01
"
3EI 3E3JH:@I 9HM3GGGA@LB2DM@B2H>ZbT+N3GA2@A32@I KEI@2B;@
DA@23BCE4LDEICBCDEGDFA+(h# 3EI 2@3LBCDE BCM@DF. ;>Y;@3IGD2ABCDE LDEICBCDE N3G%h(. MDJ7Z,36J
3BA+!h# 3EI B;@@JKBCDE LDEICBCDE N3G. MDJ7Z,36J3BA+!h# >Y;@3IGD2ABCDE 23B@DFDFB;@I@ADJH1
M@2C:@I ;@A32CE N3G*h$g) B;@3EBCLD34KJ3EB3LBC[CBHDFB;@AK2CFC@I ZbT+N3G(.h.&X7M4& B;KGCB
CEL2@3G@I &h(5 BCM@G;C4;@2B;3E A2@1AK2CFC@I& 3EI B;@2@LD[@2H3LBC[CBH23B@N3G!#h$.g>Y;@2@GKJBDF
b0 G;DN@I B;3B3[@234@MDJ@LKJ32N@C4;BDFB;@AK2CFC@I ZbT+N3G! .&&& 3EI 5*h.#g DFN;CL; ICG1
B2C9KB@I 3MDE4B;@MDJ@LKJ32N@C4;BGDF* %%% ? %%%>
L0G K24I1"JDNMDJ@LKJ32N@C4;B;@A32CE)M3L2DAD2DKGCDE @VL;3E4@2@GCE)AK2CFCL3BCDE
""肝素#;@A32CE$是一种酸性黏多糖&广泛分布在
哺乳动物的组织中&如肺(肠黏膜(心(脾(肾(胸腺(
胎盘(肌肉和血液等 自从 &( 年肝素被证明具有
抗凝血活性后&肝素作为天然抗凝血物质受到世界
各国的重视*&+ 但长期使用肝素会有负面影响&如
出血(诱导血小板减少(皮肤坏死(脱发和骨质疏
松*$ ?(+等&其中最大的副作用是出血 而低相对分
子质量肝素#JDNMDJ@LKJ32N@C4;B;@A32CE& ZbT+$
是由普通肝素分离得到的一些组分或裂解后产生
的片段 其相对分子质量低&结构也较单一&为近
&% 年发展起来的新一代肝素类抗血栓药物&相对常
规肝素&因其具有抗凝血(抗血栓(调血脂(抗肿瘤
等功能&且生物利用度高&体内半衰期长&出血倾向
小&口服易吸收等特点而得到了更广泛的应用*.+
因此&对ZbT+制备(纯化及检测的研究具有重大
意义 目前ZbT+多是由裂解常规肝素而产生的
一系列相对分子质量较小的片段&再经分离纯化而
得到纯度较高(相对分子质量较均一的活性片段
国内外关于凝胶层析和亲和层析纯化肝素的报道
很多*# ?&&+ &亲和层析较多应用于制备纯度较高的
ZbT+
*5 ?*+
)而凝胶层析则更广泛用于 ZbT+的生
产制备*! ?&%+及一些ZbT+药物的质量控制*&&+ 目
前&凝胶层析及亲和层析纯化ZbT+的技术已经较
为成熟&具有纯化 ZbT+纯度好(抗凝活性高等优
点&但也存在成本高&操作繁琐等问题 鉴于肝素
是一种含有 0-$ ?
.
的阴离子物质&而 ZbT+也因其
分子片段的大小不同而带有不同的电荷&因此本文
根据其所带电荷量的差异而采用大孔离子交换树
脂/01
"
对ZbT+进行了一系列分离纯化&在精制
ZbT+的同时&得到相对分子质量分布集中的 Zb1
T+片段&以提供新的纯化ZbT+的方法
C?材料与方法
C=C?实验仪器和材料
S/ $P型恒温磁力搅拌器#上海雷磁新泾仪器
有限公司$&乌氏黏度计#%h.!MM&成都振源玻璃仪
器厂$&0++T$& 电热恒温水箱#北京市长风仪器
仪表公司$&<+0 (6精密 A+计#海雷磁仪器公
司$&*#& QT分光光度计#安捷伦科技上海分析仪
器有限公司$&ZR# ?$P离心机#北京医用离心机
厂$&R]6< (&6型电泳仪#北京市六一仪器厂$&
真空泵&精密电子天平#上海良平仪器仪表有限公
司$&PKBDFJ@V__型 bPZR_1Y-)质谱仪#/2Ka@2公
司$&数据采集软件 )J@V6DEB2DJ(h%&数据分析软件
)J@VPE3JHGCG(h%
粗品肝素#德阳生化制品有限公司提供$&羊血
浆#山东苍山向明生化助剂厂$&ZbT+标准品#注
射级&葛兰素史克$&ZbT+电泳对照品#常州千红
生化制药有限公司$&/01
"
大孔树脂#中蓝晨光化
工研究院$
C=A?实验方法
&>$>&"ZbT+的裂解
将 &h% 4粗品肝素钠溶于体积分数 &g乙酸溶
液 #% MZ中&加入一定量的,3,-
$
溶液&控制 A+在
$h% j.h% 范围内 常温下搅拌反应 $ j. ;&用
,3-+溶液调 A+至中性&$h# 倍体积乙醇沉淀 &!
; 丙酮脱水数次&5# i真空干燥得ZbT+粉状
粗品
&>$>$"/01
"
大孔离子交换树脂对 ZbT+的吸附
及纯化效果
称取上述 ZbT+试样溶于一定浓度 ,36J的
#% MMDJY2CG1+6J上样缓冲溶液中&恒流泵恒流吸
附 & j$ ;&吸附完全后吸取一定量上样液经+
$
0-
.
水解后测 $! EM光密度&计算树脂对试样的吸附
率*&$+ 之后用 &h& MDJ7Z,36J和蒸馏水分别淋
洗&最后用一定浓度 ,36J的 #% MMDJY2CG1+6J缓
冲溶液进行洗脱&分段收集检测&合并含有肝素的
部分&浓缩(冻干&最后进行活性及相对分子质量
分析
&>$>("平均相对分子质量的测定*&(+
由 %h# MDJ7Z,36J溶液配制肝素试样&用黏
度法测定各组分特性黏度
$
&按公式
$
l(h$ m
&%
?#
F
2
%h%5
&计算肝素平均相对分子质量)F
2
为平均
相对分子质量
&>$>."质谱分析方法
bPZR_1Y-)质谱仪#正离子反射模式$操作条
件"离子加速电压 $% ad&平均扫描 #%% 次&基质为
# 47Z
!
氰基 . 羟基肉桂酸#6+6P$&*体积分数
为 #%g 6+(6,#下同$&体积分数为 %h&g的 Y)P
#下同$+
&>$>#"肝素效价的测定
肝素抗凝活性"利用羊血浆法测定*&.+
&>$>5"琼脂糖电泳讨论
&g琼脂糖凝胶电泳&A+*h5 硼酸 硼酸盐缓冲
液 甲苯胺蓝染色&染色液和待测液按 &k&比例混
匀&上样 $%
#
Z进行电泳&电泳电压为 # d7LM
A?结果与分析
A=C?XU&"裂解条件的选择
亚硝酸法裂解的 ZbT+相对分子质量主要是
由反应体系的 A+&反应时间和 +,-
$
浓度等共同
决定 考虑到亚硝酸的毒害性&为了方便裂解后
去除,-?
$
&故本实验在 . 47Z较低浓度+,-
$
水平
上&采用正交试验考察了反应 A+(反应时间对所
得 ZbT+相对分子质量的影响&结果及分析见表
&(表 $
."第 # 期 李"磊等"采用/01
"
大孔离子交换树脂分离低分子肝素
表 C?裂解条件的正交试验数据
D5H60C?#O904.J0/F56I5F5 27I0926GJ04.Y5F.2/
试验号
因素
PA+ /时间7;
$
F
2
& (h# (h# %h&&( % ! $.$
$ (h# .h% %h&% & * $!
( (h# .h# %h&%. . * ##$
. (h% (h# %h%# & 5 !&(
# (h% .h% %h%& * 5 #.#
5 (h% .h# %h%!* % 5 &*5
* $h# (h# %h%* ! # 5&.
! $h# .h% %h%*5 $ # ((#
$h# .h# %h%*% . $*
表 A?裂解条件的正交试验结果分析
D5H60A?*/56G1.127F-024F-2;2/56F01F27
I0926;J04.Y5F.2/
方差源 P /
=
&
* %* 5 !!
=
$
5 #&& 5 5%(
=
(
# $! 5 (!
5 $ 5&! .&
""由表 & 可知&通过不同 A+和解聚时间的搭配&
可以控制 ZbT+的平均相对分子质量在. %%% j
! %%%范围内 同时&由表 $ 可知"在 A+和时间这 $
个因素中&A+对 ZbT+平均相对分子质量的影响
较大 因此&在裂解 ZbT+过程中&应更加注重对
A+条件的控制
宾文等*&#+发现在平均相对分子质量差别不大
的情况下&A+小于 (h% 时&所制ZbT+含较多小片
段)A+大于 (h% 时&所制得的ZbT+则含较多大片
段&而ZbT+抗凝活性与相对分子质量密切相关)
此外&强酸性会对 ZbT+的活性会有较大的影响
故本试验选择 A+ (h#(裂解时间 . ; 作为制备
ZbT+的裂解条件&以得到活性较高的ZbT+
A=A?8!W
"
大孔离子交换树脂分离纯化XU&"
工艺研究
$>$>&"/01
"
大孔离子交换树脂对 ZbT+吸附条
件的研究
作为酸性黏多糖&ZbT+在碱性条件下更易解
离&同时一定浓度的,36J溶液也有助于树脂对肝素
分子的吸附&因此选择 A+和 ,36J浓度的两因素三
水平进行正交试验进行验证和筛选&实验结果及分
析见表 ((表 . 其中原始肝素均为# M47MZ
表 Q?吸附条件的正交试验数据
D5H60Q?#O904.J0/F56I5F5 275H1249F.2/
试
验
号
因素
P
A+
/
$#,36J$7
#MDJ!Z
?&
$
吸附后
溶液
A+
"
#吸附后
溶液肝素$7
#M4!MZ
?&
$
吸附率7
g
& *h% % %h*& %h.% &h!
$ *h% %h(. %h*$# %h(%5 (h
( *h% %h!# %h5# %h$*! .h.
. *h# % %h.(( %h&!$ 5h.
# *h# %h(. %h(#. %h&. *h%
5 *h# %h!# %h(55 %h&#. 5h
* !h# % %h.& %h&*5 5h#
! !h# %h(. %h((! %h&.$ *h$
!h# %h!# %h(.& %h&.. *h&
表 R?吸附条件的正交试验结果分析
D5H60R?*/56G1.127F-024F-2;2/56F01F275H1249F.2/
方差源 P /
=
&
(h. .h
=
$
5h! 5h%
=
(
5h 5h&
5 (h# &h$
""由表 ( 可知"在 A+!h#(%h(. MDJ7Z,36J的条
件下&ZbT+吸附率达到 *h$g&相对大孔吸附树
脂对肝素的吸附率有了明显的提高&同时吸附过程
短&能迅速达到平衡&这是 /01
"
大孔离子交换树脂
的一大优势 由表 . 可知"在 A+和 ,36J浓度这 $
个因素中&A+对 ZbT+的吸附影响较大 同时&
/01
"
对ZbT+的离子交换吸附过程也可去除部分
不带电荷或所带电荷较少的杂质及相对分子质量
极小的ZbT+片段&以得到较纯的 ZbT+&结果见
图 & 由图 & 可知&纯化后的肝素其条带均一整齐&
没有拖尾
$>$>$"/01
"
大孔离子交换树脂对 ZbT+分离纯
化的研究
A+和,36J浓度是影响离子交换树脂分离纯化
%# 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
&%ZbT+对照品) $%/01
"
大孔离子交换树脂纯化试样)
(%纯化前ZbT+试样
图 C?XU&"电泳图
T.;=C?*;54210;06060:F429-2401.127XU&"
ZbT+的 $ 个主要因素
在碱性条件下&解离状态下的ZbT+能更好地
进行离子交换&同时结合树脂的适宜 A+范围&选择
了中性(弱碱性及强碱性 ( 个不同条件进行筛选&结
果如表 # 所示
""由表 # 可知& A+!h# 是最优的洗脱条件& 说明
表 @?9"对XU&"纯化的影响
D5H60@?)/7630/:01279"2/934.7.:5F.2/27XU&"
A+
上样质
量74
原料效价7
#X!M4
?&
$
精制肝
素质量74
精制效价7
#X!M4
?&
$
效价回
收率7g
*h% %h$&% $5h.5 %h&$ $!h#( 55h$(
*h# %h$%* $5h.5 %h&$* ((h$( **h%#
!h# %h$%( $5h.5 %h&(. ((h%* !$h#%
较高的 A+有助于ZbT+的洗脱
""肝素中存在大量的 0-$ ?
.
&且阴离子交换树脂对
0-
$ ?
.
的亲和力大于对 6J?的亲和力&因此&在常规
肝素的精制中均至少使用 ( j# MDJ7Z的,36J溶液&
以保证大部分肝素分子能被顺利洗脱 而 ZbT+
相对分子质量一般为常规肝素的 &7$ j&7(*&5+ &因
此&$ j( MDJ7Z,36J的浓度的洗脱条件应适用于
ZbT+ 不过为了保证ZbT+较为完全的洗脱&优
先选择了( MDJ7Z,36J作为洗脱条件&同时进一步
考虑 .(# MDJ7Z,36J溶液以筛选最优条件&结果如
表 5 所示
表 V?$5,6浓度对XU&"纯化的影响
D5H60V?)/7630/:0127$5,6:2/:0/F45F.2/2/934.7.:5F.2/27XU&"
$#,36J$7#MDJ!Z
?&
$
上样质量74 原料效价7#X!M4?&$ 精制肝素质量74 精制效价7#X!M4?&$ 效价回收率7g
( %h$%( $5h.5 %h&(. ((h%* !$h#%
. %h$%% $(h.. %h&$# (&h* !#h$.
# %h$% $(h.. %h&(% (&h#! !(h!%
""由表 5 可知"不同,36J的浓度对分离纯化效果
也有一定的影响&. MDJ7Z的 ,36J洗脱液的洗脱效
果优于 ( MDJ7Z,36J&但与 # MDJ7Z,36J无明显差
异 故本实验选择含 . MDJ7Z,36J的 #% MMDJY2CG1
+6J缓冲溶液#A+!h#$作为洗脱条件
/01
"
大孔离子交换树脂对ZbT+的吸附纯化
结果表明&在含 %h(. MDJ7Z,36J的 #% MMDJY2CG1
+6Z缓冲溶液# A+!h#$条件下吸附(含 . MDJ7Z
,36J的 #% MMDJY2CG1+6J缓冲溶液# A+!h#$ 条件
下洗脱&其吸附率达 *h$g&纯化后的 ZbT+抗凝
活性为 (.h.& X7M4&效价回收率达到 !#h$.g 虽
然比之凝胶层析及亲和层析所得的比活性稍低&但
ZbT+的吸附率及总体效价回收率均达到较高水
平&且成本低廉&操作性强 因此&用离子交换树脂
纯化分离纯化低分子肝素的研究对 ZbT+的大规
模生产具有重大意义
图 A?纯化试样XU&"相对分子质量分布
T.;=A?U260:3654K0.;-FI.1F4.H3F.2/27XU&"
A=Q?质谱法测定XU&"相对分子质量分布
""采用bPZR_1Y-)质谱仪对所纯化ZbT+试样
进行分析&纯化后ZbT+试样质谱图特征峰与标准
ZbT+质谱图相吻合*&*+ &相对分子质量分布结果如
图 $ 所示&纯化后ZbT+相对分子质量集中分布在
* %%% j %%%&达 5*h.#g&分离所得 ZbT+纯度较
&#"第 # 期 李"磊等"采用/01
"
大孔离子交换树脂分离低分子肝素
好&纯化效果明显
Q?结?论
&$采用 +,-
$
降解法&通过控制降解的 A+和
时间&得到了平均相对分子质量在 ! %%% 左右的
ZbT+&通过大孔离子交换树脂 /01
"
对其进行分
离纯化&使/01
"
大孔离子交换树脂对 ZbT+的吸
附率达到 *h$g(效价回收率达到 !#h$.g&纯化后
的抗凝活性为 (.h.& X7M4相对分子质量分布集
中&对ZbT+的大规模生产具有重要意义
$$本研究建立了 ZbT+的离子交换纯化联合
其相对分子质量质谱分析方法&同时具备离子交换
的快速(经济及质谱分子的准确性的优点&为更低
相对分子质量分布段的 ZbT+的高效快速纯化提
供借鉴
致谢"杨继虞教授对本研究给予悉心指导&生化工程国家重
点实验室张贵峰副研究员帮助本研究试样质谱分析&德阳生
化制品有限公司提供肝素粗品&中蓝晨光化工研究院何琦研
究员惠赠/01
"
大孔树脂&一并衷心致谢0
参考文献"
*&+"李红心>精品肝素钠的制备及效价分析*S+>陕西科技大学学
报"自然科学版&$%%#&$(##$"($1(.>
ZC+DE4VCE>ECE4*S+>S0;33EVCXEC[0LCY@L;EDJ",3B0LC^ I&$%%#&$(##$"
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*(+"ZDG@3J:DS&0@;3F@2P_>Y;2DM9DGCG3EI ;@MD2;34@*b+>$EI @I>
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*.+"张治云&凌沛学&王凤山&等>低分子肝素药理作用研究进展
*S+>食品与药品&$%%5&!#&$"*1>
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*#+"PEI@2GGDE Z-&/32DNLJCF@3YT&+DJM@2^ >PEBCLD34KJ3EBA2DA1
@2BC@GDF;@A32CE F23LBCDE3B@I 9H3FCECBHL;2DM3BD423A;HDE M3B2CV1
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*5+"6;2CGBC3E d&<;CJCAA@+&ZDNMDJ@LKJ32N@C4;B;@A32CEG
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BC[@&M@B;DI FD2M3aCE4G3M@3EI KG@B;@2@DF"X0&$%&%%%*#$$
*<+>$%&%1%(1$#>
**+"何书英&李华&杨宁>亲和色谱分离纯化 ZbT+*S+>中国生化
药物杂志&$%%5&$*#($"&*%1&*&>
+@0;KHCE4&ZC+K3&]3E4,CE4>N@C4;B;@A32CE 9H3FCECBHL;2DM3BD423A;H*S+>6;CE /CDL;@M
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*!+"03GCG@a;323E W&d@Ea3B323M3E Q&0;2C[@2O&@B3J>b@B;DIG3EI A2D1
IKLCE4JDNMDJ@LKJ32N@C4;B;@A32CE"X0&*5!*.**<+>$%&%1%(1(%>
*+"张倩&乐以伦&万昌秀>低分子量肝素的制备及纯化*S+>四川
大学学报"工程科学版&&&(#$$"(1.*>
O;3E48C3E&Z@]CJKE&T3E 6;3E4VCK><2@A323BCDE 3EI AK2CFCL3BCDE
DFJDNMDJ@LKJ32N@C4;B;@A32CE*S+>S0CL;K3E XEC[" E^40LC^ I&
&&(#$$"(1.*>
*&%+ 张万忠&胡晓东&刘宁>低分子量肝素的制备与纯化*S+>沈阳
化工学院学报&$%%(&&*#$$"&&.1&&*>
O;3E4T3E:;DE4&+K \C3DIDE4&ZCK ,CE4><2@A323BCDE 3EI AK2CFC1
L3BCDE DFJDNMDJ@LKJ32N@C4;B;@A32CE*S+>S0;@EH3E4_EGBCB6;@M
Y@L;EDJ&$%%(&&*#$$"&&.1&&*>
*&&+ I^K32ID_&b32C3E30&WDI2C4D0>+@A32CE UK3JCBHLDEB2DJCE B;@/231
:CJC3E M32a@B"CMAJCL3BCDEGCE B;@L32ICD[3GLKJ32GK24@2H*S+>W@[CGB3
/23GCJ@C23I@6C2K24C3632ICD[3GLKJ32&$%%!&$(#$$"&5!1&*.>
*&$+ 张万忠&刘伟&李文秀&等&R$%! 树脂对肝素吸附过程的研究
*S+>沈阳化工学院学报&$%%(&&*#&$"&!1$%>
O;3E4T3E:;DE4&ZCK T@C&ZCT@EVCK&@B3J>0BKIHDE 3IGD2ABCDE
A2DL@GGDF;@A32CE NCB; R$%! 2@GCE *S+>S0;@EH3E4_EGB6;@M
Y@L;EDJ&$%%(&&*#&$"&!1$%>
*&(+ 杨春雷&陶元器&曹跃琼>肝素平均分子量的粘度法测定*S+>
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