全 文 ：NⅢ2003 生辆加工过程 第1卷第2期
．34． chineseJ0umalofBi叩rocessEn画rl忧打ng 2()03年11月
—一 一————一——————一——————一～——————酶法拆分手性化合物HPBE
张宪锋，郑裕国
(浙江工业大学 生物与环境工程学院，杭州310014)
摘要：R-}口BE(2一羟基一4_苯基丁酸乙酯)是一种重要的医药中间体，可以通过脂肪酶催化水解外消旋体得到。介
绍了此催化过程的机理、工艺、产物检测等，并通过酶在疏水栽体上的界面吸附对酶进行固定化，以提高酶活及对
映选择性。
关键词：酶法拆分；HPBE；酶固定化
中图分类号：Q8149 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2003)02—0034一05
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Abs衄．ct：R—HPBEisa11 mportantinteITr州ia【eofmedicine，whichcanbeobtainedbytllehydmlybcresolution
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Keywon凼：en2ymaticIesoluti叩；HPBE；eIlzyIIleiI眦10MIiz砒ion
继医药和农业之后，广泛认为工业生物催化将
是生物技术的第三个浪潮。而手性化合物的研究已
经成为立体化学、药物化学中最活跃的部分。酶催
化拆分手性化台物正是这两者的结合点。国际上手
性技术有多种，比较起来，酶法合成与拆分有其明显
的优势。重结晶法应用范围有较大限制；化学不对
称合成与拆分法需要昂贵的手性辅助试剂或手性起
始原料，且过程冗长，又易伴随分解、异构、消旋、重
排等反应；而酶法合成与拆分反应条件温和、选择性
强、副反应少、产率高、无污染，可以降低能耗、节省
资源。
脂肪酶(甘油水解酶，E．c．3．1．1．3)能催化水解
，合成很多种可溶于水或不溶于水的羧酸及酰胺，例
如水解油类和脂肪”。o，合成脂肪酸酯口’4J，生产有机
收稿日期：2003划—06
作者筒介：张光锋(I卯9．)，男，硕士，研竞方向：微生物工程。
合成中的中间体例。将脂肪酶应用于手性化台物
HPBE的拆分，利用其底物专一性、区域选择性和立
体选择性，是酶法拆分法的典型例子。
l脂肪酶酶法拆分垭)BE的过程
R一}ⅢBE是合成多种AcE(血管紧张素Ⅱ转化
酶)抑制剂的重要中间体，例如合成抗高血压药
cil“印il(西拉普利)。R—HPBE外观为无色液体，熔
点118～122℃，其分子式为：
穹HQ
／N／＼／k也∥1cH3U
万方数据
2003年J1月 张宪锋等：酶法拆分手性化合物HPBE ‘35‘———————一一—————————————————————————————用脂肪酶催化水解外消旋的HPBE，可以得到光学纯的R一}口BE和s—I邶A，其过程为‘⋯：∥贝八一
扩火一+∥☆
酯酶催化反应的速度与底物的浓度关系符合米
氏方程曲线，而脂肪酶则表现出s型曲线。脂肪酶
的一个显著特点是在疏水界面(如底物胶束、不混溶
的有机溶剂)存在时会发生话化。人们通过x一射线
结构研究已经进一步证明了这一特征‘“。酶分子活
性中心外部有一个两性n螺旋片段(又称“盖子”)，
当不存在疏水界面时，这个盖子会掩盖酶分子活性
位点，使其无法与底物接触，此时称为“封闭式”结
构；当酶接触到疏水界面时，酶的构象会发生很大变
化，“盖子”会折回，将活性中心暴露，此时酶处于活
化状态，称为“开放式”结构。81。因此脂肪酶催化的
水解反应必须在两相体系中进行。脂肪酶的催化行
为是这种“封闭式”结构和“开放式”结构之间平衡的
结果。这种平衡的微小移动，会对酶的活性和立体
选择性产生很大影响。不同的固定化载体会影响这
种平衡，因此会产生不同的活性和立体选择性。
2水溶性游离酶催化水解HPBE的研究
Panos等人“用血1a|】oP_30脂肪酶催化水解
(R，s)一HPBE，在3I。的三口圆底烧瓶中装入450rI】I_
的去离子水、50mLO．5Imol／L的磷酸盐(pH7．O)、
52．og(R，s)-HPBE，再加入o．67gA珊anoP-30脂肪
酶．在转化率50％时，用3×200rnL的二乙醚提取反
应混合物，并在45℃下浓缩，得到25．3g的R一皿BE
(48．5％产率，97％理论量，91％e．e．；比旋光度[d]；
=一78。(c1．0，乙醇)。水层调pH为2，用3×200
Ⅱ讧．的二乙醚提取，有机层用N如s04干燥并在45。c
下浓缩，得到20-8gS_2一羟基．4．苯基丁酸。水解在
55％转化率时得到22．4z的RIHPBE(43％产率，
96％理论量，99％e．e．；比旋光度[a]：=一8．4。(c
1．15，乙醇)，转化率35％时，可得到32．59的R—
HPBE(63％产率，96％理论量，52％e．e．；比旋光度
[n]：=一4．6。(c1．5，乙醇)．
此外，中科院的聂孟言等人““研究了用全甲基
环糊精作固定相气相色谱法手性拆分扁桃酸及其类
似物HPBE的过程及机理。
3几种固定化酶的比较
酶固定化后便于1_=业放大，易于制造相应的生
物反应器，得到纯品，延长使用寿命，易于再生，操作
稳定，而且可以减少酶．酶、酶．蛋白质之间的相互作
用。因此，对脂肪酶的固定化研究正成为一个激动
人心的领域、也是实现产业化的关键。
许多研究工作证实脂肪酶对疏水性载体有特别
强的亲和性¨“”J。G】oia等人“3研究了固定化
№M幽Ⅲ№月m一—"Ljpase(荧光假单胞菌脂肪酶，
简称PFL)的四种方法：用右旋糖苷琼脂糖和乙醛酰
琼脂糖共价固定PFL(分别用PFI广1、Pn，2表示)，用
辛基琼脂糖和癸辛基．sepabeE池界面吸附PFI，(分别
用PFlJ一3、P104表示)。
用固定化酶催化水解的过程：将lOg底物(R，
s．HPBE)加入到90mL、pH为7．5的磷酸盐缓冲液
中，再加入5g固定化酶载体，并激烈搅拌，在25℃
下反应，通过自动滴定保持pH值不变。用}IPLC与
紫外检测器(225nm下)检测水解的立体选择性。
色谱柱为chiracelOD—R，流动相为40％的乙腈水溶
液，流速为O．5““111in，温度为25屯。对映选择率
(E)由对映体过量(e．e．)和转化率计算。
PFL广1中酶的构象变化很小“⋯，固定化速度也
很慢，进行5h只完成40％。同时酶悬浮液的活性
基本不变，这表明酶与右旋糖苷琼脂糖之间只建立
了很有限的共价联系。而乙醛酰琼脂糖对脂肪酶具
有较强的作用““，PFL广2在1h左右完成固定化，此
时酶活约为起始时的50％，同时PF02比PFL_l的
稳定性好。PFL3与Pn4固定化速度很快，在lo
min左右完成，而且酶活约为原来的7倍(见表1)。
表l水解R．s_HPBE时固定化I)n．的比较
T拍lel Hydm】y如0fR，s_}Ⅱ电Ebydi&坨nli删oⅢi自edPFL
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