全 文 ：Mar．2008
· 22·
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
第6卷第2期
2008年3月
一株分枝杆菌降解胆固醇制备AD(D)的转化条件
王 敏，温 竹，王丽娟，申雁冰，王洪臣
(天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学 生物工程学院，天津300457)
摘要：通过分枝杆茵(Mycobacteriumsp．)M3限制性降解胆固醇侧链获得了产物雄甾_4一烯．3，17-二酮(AD)和雄
甾．1，4．二烯-3，17一二酮(ADD)。优化了胆固醇的投料时间、投料方式、培养基初始pH和葡萄糖浓度等工艺参数。
将羟丙基母．环糊精(HP毋．CD)应用于转化反应中，确定了HP币一cD的最佳添加时间和添加量，使AD(D)生成率由
初始对照的30％提高到60％，转化至72h时AD(D)生成率达48％，是同期对照的4．0倍，生成率与生成速率均得
到显著提高。在添加HP召．cD的最佳转化条件下，AD(D)生成率达到70％，是初始对照的2．3倍。
关键词：雄甾-2．2烯．3，17一二酮；胆固醇；生物转化；分枝杆菌
中图分类号：TQ460．38 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2008)02—0022—06
Thebioconversionconditionsofcholesterolcleavage
byMycobacteriumsp．M3
WANGMin，WENZhu，WANGLi-juan，SHENYan—bing，WANGHong—chen
(LaboatoryofMicrobialPh rmacy，CollegeofBiotechnology，TianjinUniversityofScience＆Technology，
TianjinKeyLaboratoryofIndustrialM crobiology，Ti觚jin200457，China)
Abstract：CholesterolcanbecleavagedbyMycobacteriumsp．M3toandrost-4一ene-3，17-dioneAD(D)
andandrosta一，4一diene-3，17-diorle(ADD)．Fermentationparameterssucha substrateadditiontime，ini-
tialpH．andconcentrationofglucoseinthefermentationculturewereoptimized．Theconversionratef
AD(D)hadbeenraisedto60％fromtheoriginal30％inthepresenceofHP币一CD，anditwag4times
tothecontrastwhentheconversiontimewas72h．theconversionratea dspeedofAD(D)hadbeenob．
viouslyraised．Intheoptimizedcon itions，theconversionratefAD(D)reachestto70％，anditWag
2．3timesoftheoriginalones．
Keywords：androsta-l，4一diene-3，17一dione；cholesterol；bioconversion；Mycobacteriumsp．M3
微生物将甾醇C．17位长链断裂得到的C一17酮
化合物，其中雄甾4-烯-3，17-二酮(androst-4-ene-3，
17．dione，简称AD)和雄甾一1，4一二烯_3，17-二酮(an-
drosta．1，4．diene-3，17一dione，简称ADD)最为重要。
AD和ADD是甾体药物重要的中间体，对AD和
ADD的活性部位进行结构改造，可以合成出多种甾
体药物⋯。随着甾体药物应用量逐年增加，原料薯
蓣皂素供应量Et趋紧张，各国均积极寻找新资源。
20世纪50年代，美国Upjohn公司首先利用侧链上
有双链的大豆甾醇和麦角甾醇为原料生产出AD和
ADD，并以此作为合成甾体药物的中间体旧J。20世
纪70年代初，日本的有马启利用微生物降解胆固醇
收稿日期：2007-11-23
基金项目：国家自然科学基金资助项目(200776111)；天津市应用基础研究重点资助项目(043802511)
作者简介：王敏(1971一)，女，天津人，教授，研究方向：生物制药。E·mail：minw@tlmt．edu．cn
万方数据
2008年3月 王敏等：一株分枝杆菌降解胆固醇制备AD(D)的转化条件 ·23·
成功生产了ADD，受到制药公司的重视日J。20世纪
80年代，我国从蕃麻和剑麻的液汁中提取皂苷元，
作为乙酸地塞米松和倍他米松的起始原料，但至今
尚未在生产上应用H】。近年来，自然界广泛存在的
动植物甾醇受到了大量关注，逐渐成为甾体药物的
新资源之一，其中胆固醇和口．谷甾醇较为突出∞“J。
本文利用对植物甾醇侧链有较强降解能力的一
株分枝杆菌(Mycobacteriumsp．)M3，对胆固醇进行生
物转化得到了AD(D)，表明该菌种对于甾体底物具
有较广泛的适应性，有一定的生产价值；并且将羟丙
基一B一环糊精(HP-f1．CD)应用于胆固醇的侧链降解转
化反应中，提高了底物的转化率和转化速率。
1材料与方法
l-1仪器和药品
Agilent高效液相色谱仪；GC-7890II气相色谱
仪(TECHCOMP公司)；Uvmini-1240紫外可见分光
光度计(岛津仪器(苏州)有限公司)；胆固醇(湖南
祁东同庆生化厂)；ADD与AD(BR，Sigma)；HP够一
CD(西安德立生物化工有限公司，取代度6．52，羟
丙氧基含量32．35％)。
1．2菌种和培养基
1．2．1菌种分枝杆菌(Mycobacteriumsp．)M3，天
津科技大学微生物制药研究室保藏。
1．2．2斜面培养基磷酸氢二钾0．5s／L，硫酸镁
O．5g／L，柠檬酸铁铵0．05s／L，柠檬酸2g／L，硝酸
铵2g／L，碳酸钙10g／L，甘油20g／L，葡萄糖5g／L，
琼脂20g／L。
1．2．3发酵培养基葡萄糖10g／L，柠檬酸2g／L，
柠檬酸亚铁铵0．05g／L，硫酸镁0．5g／L，磷酸氢二
钾0．5r,／L，磷酸氢二铵3．5g／L，胆固醇的吐温80
溶液100mL，蒸馏水900mL，pH7．0。胆固醇的吐
温80溶液配制方法为：采用吐温80在100℃高温
乳化底物10rain，然后定容至100mE(吐温80质量
分数为10％)，121℃与培养基单独灭菌20min，在
菌种培养20h后加入培养基中。
1．3菌种培养
斜面菌种29℃培养4—5d，至呈橙黄色时，加
入0．5％的吐温80溶液洗下菌体，轻轻搅拌成混悬
液，控制DD鳓为1．0±0．2。吸取7mL混悬液转移
至装有90mL发酵培养基的500mL摇瓶中，29℃，
110r／rain振荡培养20h。
1．4产物AD(D)的生物转化
在培养了20h的菌体培养液内投入胆固醇的
吐温80溶液，使其终质量分数为0．1％，29℃，110
r／min振荡转化至168h。
1．5 HP田．CD的添加方式
称取摩尔量是胆固醇不同倍数的HP-fl-CD，各
加蒸馏水配成5mL溶液，115℃灭菌15min(控制
发酵培养基总体积为100mE)，冷却后添加到不同
培养时期的菌液中。
1．6样品处理与产物(底物)鉴定
1．6．1样品处理取1mL转化液用2倍体积的乙
酸乙酯萃取，离心除沉淀后取上清液1mL，自然风
干，加入10mL流动相，12000r／min离心10min，
得到待测样品，送HPLC分析AD(D)含量。
采用上述方法处理转化液后加入100灿乙酸
乙酯，得到待测样品送GC分析底物含量。
1．6．2薄层层析鉴定(TLC)硅胶GF捌薄板，展
开相为口(乙酸乙酯)：t，(石油醚)(60—90℃)=
3：7，层析结束后在紫外灯下观察AD(D)斑点，胆固
醇通过在薄板上喷以50％的硫酸加热显色可见。
经计算得到Rf8ub=O．63，R岫=0．38，RfA叻=O．25。
1．7转化率的分析与计算
1．7．1AD(D)的高效液相定量分析(HPLC)色谱
柱为Phenomenex(2．50toni×4．60millC18柱)；流速
为1mL／min；流动相为t，(甲醇)：z，(水)=80：20；检测
器为UVDetector；波长为254rim；进样量为20¨L。
AD(D)摩尔生成率(％)=
fX—ADDM—．ubVJ+燮1×100％
＼M^Dom。b’M^D，n，。bJ
式中X为HPLC测得的产物质量浓度；d为稀释倍
数；V为投料后转化液的体积；m。曲为y体积内底物
的投加量；肘讪、肘．DD与肘^D分别为底物、ADD与AD
的相对分子质量。
1．7．2胆固醇的气相色谱检测(GC)T2000色谱
工作站；检测器：氢火焰离子检测器；色谱柱：sE-54
型(15m×0．25mm×0．25p,m)填充型毛细管柱
(TECHCOMP公司)；载气：氮气lmL／min；进样口
温度：300℃；检测器温度：300℃；柱温：260℃；进
样量：1“L。
胆固醇的转化率(％)=l1一等l×100％
式中x’为GC测得的转化后胆固醇的质量浓度；X
为初始胆固醇的质量浓度；d为稀释倍数。
万方数据
·24· 生物加工过程 第6卷第2期
2结果与讨论
2．1分枝杆菌M3的生长曲线
将培养好的斜面菌种接种到发酵培养基中，定
时取样，测定培养液的DD锄。由图1可以看出，分
枝杆菌M3在发酵培养基内培养40～90h菌体处于
对数生长期，90h以后达到稳定期。
1
1
l
§0
《0
0
0
圈1分枝杆菌M3的生长曲线
Fig．1GrowtheurveofMycobacteriumsp．M3
2．2胆固醇投料时间对转化结果的影响
在菌体培养的不同时间投料，考察投料时间对
产物生成的影响，结果如图2所示。在分枝杆菌M3
的培养初期(0～40h)，胆固醇的投料时间对产物的
生成影响不大；60h时菌体处于对数生长期，此时
投料更利于AD(D)的生成。
2．3胆固醇投料方式对转化结果的影响
胆固醇几乎不溶于水，加热易聚集‘7。。依据参
图2胆固醇投料时间对AD(D)生成率的影响
Fig．2Effectsofaddingtimesofcholesterol
onconversionrate
考文献并结合本实验室条件，考察了6种胆固醇投
料方式对转化结果的影响。(1)吐温喁。9】80乳化
法：a吐温80溶液高温乳化胆固醇并超声振荡后同
培养基一同灭菌进行转化；b吐温80溶液高温乳化
胆固醇后同培养基分开灭菌后投料；(2)C乙醇溶解
胆固醇并超声振荡后投料(乙醇终体积分数为
4％Do])；(3)添加HP毋．CD进行转化：d胆固醇直
接加入培养基中灭菌后，将摩尔量是胆固醇1倍的
HP-fl—CD加入其中；e用b方法投料时将摩尔量是
胆固醇l倍的HP-fl—CD加入培养基中；(4)f胆固
醇直接添加到培养基中共同灭菌。
表I结果说明：方法b、e胆固醇转化率较高，即
吐温80乳化胆固醇并与培养基分开灭菌的投料方
式利于胆固醇的转化，同时加入HP-fl-CD，可提高胆
固醇的转化率。
表1 不同投料方式胆固醇的溶解状态及转化率的比较
TableThecomparisonofconversionresultsofcholesterolatdifferentaddingways
万方数据
2008年3月 王敏等：一株分枝杆菌降解胆固醇制备AD(D)的转化条件 ·25·
2．4发酵培养基初始pH对转化结果的影响
pH是菌体生长和产物生成重要的状态参数。
pH影响跨膜pH梯度，影响膜的通透性，进而影响
菌体生长与产物的生成，他是生物转化成败的关键
因素之一【11|。由图3可以看出，发酵培养基初始
pH为7．5时，有利于AD(D)生成。
柏
堡
畲30
o
暴20
铬
删10
O
6．5 7．O 7．5 8．0
初始pH
图3发酵培养基初始pH对AD(D)生成率的影响
Fig．1EffectsofinitialpHonconversionrateinthe
fermentationculture
2．5发酵培养基中葡萄糖浓度对转化结果的影响
葡萄糖作为碳源其合适的浓度是实现生物转
化的关键之一。他能够被菌体迅速利用，加速菌体
生长。但过多的葡萄糖会加速菌体呼吸，以至培养
基中溶氧不足而影响酶的活性【l2I。同时葡萄糖浓
度又与转化过程中pH的变化密切相关哺J，调整其
浓度并检测转化过程中pH及AD(D)生成率的变
化，结果如图4及表2所示。葡萄糖质量浓度为13
g／L时AD(D)生成率较高。葡萄糖质量浓度大于5
g／L时，转化过程中pH略有降低，但对AD(D)生成
率影响不大。
5 7 9 11 13 19
p(glucose)／(g·L-1)
图4发酵培养基中葡萄糖浓度对AD(D)生成率的影响
Fig．4Effectsofglucoseconcentrationon heconversion
rateintllefermentculture
表2发酵培养基中葡萄糖浓度对转化过程中的pH和AD(D)生成率的影响
Table2 EffectsofglucoseconcentrationonpHa dbioconversionrateinthefermentculture
注：·一培养168h时AD(D)的生成率。
2．6 HP-fl-CD对AD(D)生成率的影响
将HP-fl—CD应用于生物转化，其包结作用能够
增加难溶药物在水中的溶解度¨31，利于难溶性底物
的生物转化。
2．6．1 HP-fl—CD的添加量对转化结果的影响投
料时添加摩尔量是胆固醇0．5，1，2，3倍的HP召一
CD，考察不同摩尔比例的HP-fl—CD对AD(D)生成
率的影响，以材料与方法中所述转化条件为初始对
照，结果如图5所示。添加HP-B．CD后，产物AD
(D)的生成率达54％，较初始对照的30％提高了
24％。同时，添加HP够一CD后AD(D)的生成速率
也显著提高。添加摩尔量是胆固醇0．5，1，2，3倍的
HP-fl—CD，转化至72h时，AD(D)生成率分别是同
期对照的3．8、4．0、3．2、3．8倍。
此结果与本研究室孟婧壶就醋酸可的松(CA)
生物转化为醋酸泼尼松(PA)的研究结果相似。当
∞
∞
∞
∞
m
o
％，一一。一口v)静餐划
万方数据
· 26· 生物加工过程 第6卷第2期
添加n(HP-fl-CD)：n(cA)=1：1的HP-fl-CD时，可
显著提高CA转化前期的转化速率，4h时CA转化
率达到60％，是同期对照的12倍¨4|。
2．6．2HP-f1．CD添加时间的选择图6的结果表
明，56h至80h添加HP-fl—CD，此时菌体处于对数
生长期，转化结果较好，AD(D)生成率达60％。90
h后已进入稳定期，此时添加HP-fl-CD，AD(D)生成
率出现下降。
60
辞50
畲40
口
S30
罄20
矧10
0
t／h
+n(HP-p-CD)：Ⅱ(胆固醇)如．5：1+对照
--·-n(H脚．．cD)：n(胆固醐=2：l4-n(I-IP—户cD)：n(胆固醇)=1：1
—一n(H呷．．CD)：n(胆固醇)-3：l
图5 5HP-归-CD的添加比例对AD(D)生成率的影响
Fig．5EffectsofdifferentmoalrsofHP-fl-CD
ontheconversionrate
图6 HP哥CD添加时问对AD(D)生成率的影响
Fig．6EffectsofaddingtimesofHP-fl-CDonthe
conversionrate
在单因素试验的基础上，进行正交试验。其因素
水平和正交试验结果如表3和表4所示。从结果分
析表中可知，各工艺条件对转化结果的影响大小顺序
为B，D，c，A，其中培养基初始pH对转化结果影响最
显著。最佳的转化工艺条件为A3B：C，D3，即发酵培
养基初始pH为7．5，HP-fl-CD的添加时间为80h，培
养基葡萄糖质量分数为1．3％，60h投料。以最佳条
件进行验证试验，AD(D)生成率达到70％。
表3 L9(34)因素水平表
Table3 L9(34)factorsandlevels
因素
水平 A B C D
!l塑整2尘 叁壁堕羞茎塑塑出 足(塑!!竺!曼2[!墨：垦：12 11鋈塑旦!壁垒里2』1
1 40 7．0 7 56
2 60 7．5 13 68
3 80 8．0 19 80
表4正交试验结果分析表
Table4 Resultsandanalysisoforthogonaldesignexperiments
竺兰兰!(墼螽!尘叁壁堕塞羔垫塑里旦巳(照竺!旦竖墨(曼：坠：：211鋈塑!坚兰≥璺望2尘竺竺兰：：兰
l 40 7．0 0．7 56 59
2 40 7．5 1．3 68 63
3 40 8．0 1．9 80 62
4 60 7．0 1．3 80 60
5 60 7．5 1．9 56 65
6 60 8．0 O．7 68 57
7 80 7．0 1．3 68 61
8 80 7．5 0．7 80 67
9 80 8．0 1．9 56 58
·一培养168h时AD(D)的生成率。
万方数据
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3结论
利用分枝杆菌(Mycobacteriumsp．)M3降解胆
固醇制备AD(D)的生物转化过程中，考察了底物胆
固醇投料时间、投料方式、发酵培养基初始pH、葡萄
糖浓度及HP-fl—CD添加情况等工艺条件对转化结
果的影响。采用吐温80高温乳化胆固醇后同培养
基分开灭菌的投料方式，确定了最佳转化条件：投
料时间为60h，发酵培养基初始pH为7．5，p(葡萄
糖)为13g／L，菌体培养至80h时添加与胆固醇摩
尔比为1：1的HP田一CD进行转化。在最佳转化条件
下AD(D)生成率达到70％，是初始生成率(30％)
的2．3倍。
参考文献：
[1]杨英，姜少通．微生物降解甾醇侧链转化雄甾．4一烯-3，17-二酮
的研究进展[J]．微生物学通报，2006，33(6)：142．
[23ArlmaK，NagasawaM。B eM，eta1．Microbialtrandormationof
steroh}I：decomposition缸cholesterolbymicroorganisms[J]．A鲥
BidChem，1969，33：1636．
[3]NagasawaM，Wat nabeN，HashibaH，eta1．Microbialtran$for-
mationofsterolsIISubstrateSpecificityforcleaviongsteroids e
chainsbyArthrobacter,impk[J]．A—BiolChem，1970，
34：798．
[4]徐诗伟，法幼华．A环饱和甾体的微生物转化作用Ⅲ．倍他美
松中间体l叩-甲基-5a—A9(11)．孕甾烯邳，17a，21-三羟基一
20一酮-21-醋酸酯的△l，4作用[J】．微生物学报，1984，24(1)：
46-49．
[5]张辉．姜文勇，牟宏晶．大豆甾醇的微生物降解及酶抑制剂的
选择[J】．哈尔滨理工大学学报，2000，5(4)：75-78．
[6]周维善，庄治平．甾体化学进展[M]．北京：科学出版社，
2002：349．
[7]WovchaMG．Bioconversionofsitostemlousefulsteroidalnter-
mediatesbymutantsofMycobacte—umfortuitum[J]．BiochimBio-
physAct，1978(5)：1308．
[8]张丽青，卞恩培，王又．分枝杆菌(Mycobacteriumsp．M12)降解
胆固醇侧链的研究[J】．药科学报，1992，27(12)：903-907．
[9]王敬一，殷芝华，周维善．B-谷甾醇侧链的降解：A4一雄甾烯-3。
17一二酮的生成[J]．药学学报，1991，27(1)：22-25．
[10]叶丽，李增霞，陈倩，等．分枝杆菌降解口一谷甾醇制备雄甾-1，
4-二烯．3，17一二酮[J]．复旦学报：医学版，2002，29(4)：280．
[11]褚炬。李友荣．现代工业发酵调控学[M]．北京：化学工业出版
社。2002：20．
[12]陈希杨．简单节杆菌脱氢研究[D]．杭州：浙江工业大学，
2002：40．
13]高恩君，张丹．环糊精及其衍生物在生物领域的应用[J]．当代
化工，200l。30(2)：67．
[14]盂婧矗．环糊精及其衔生物对甾体化合物c1．2脱氢反应的影
响[D】．天津：天津科技大学，2007：65-66．
一一¨rd■I_-—一¨一h-，呻-Ip—州HH-“n●H-一l●I¨√Ⅲh_—一■-，_H-，mI●"，岫●m，■l¨．，■～F。■_P，■¨_，■～p，畸¨¨，■■_栅●-·，■～_卅¨●●，‘‰_，一●●_一¨_，■●_，q●●p一●●_一●I_，1“-√■●I-，■●●H一●●_，嘲¨√■¨_，■“-，■～--“q¨。一Hr，■H_，岫h__■●～，■●l-—一～-，■●●_·
中国2007年已有10家生物发电厂建成投产
自2006年12月中国第一家生物发电厂——山东省单县生物发电厂建成发电以来，由龙基电力公司提
供先进技术、国能生物发电公司投资建设的生物发电厂，陆续建成了山东省高唐、垦利生物发电厂，河北省
威县、成安生物发电厂，江苏省射阳生物发电厂，黑龙江省望奎生物发电厂，吉林省辽源生物发电厂，河南浚
县、鹿邑生物发电厂等生物发电厂建成并网发电，源源不断地为社会提供清洁能源。
生物发电以其CO：零排放的特点，受到世界各国的青睐。生物发电产业在中国健康快速发展，为节能
减排开辟了一条新路。以单县生物发电厂为例，装机容量为2．5万kW，年消耗秸秆近20万t，年发电量指标
1．6亿kW·h，可实现工业产值1亿余元。截至2007年底，这家电厂已发电2亿多kW·h。与同等规模燃
煤电厂相比，一年可节约标准煤9万余t，减少CO：排放10万余t。目前已并网发电的10家生物发电厂，年
总装机容量达到25万kW，如运营正常，一年可发“绿色电力”16亿kW·h以上，节约标准煤90万余t，减少
C02排放100万余t。
(张春鹏)
万方数据