全 文 ：第７卷第３期
２００９年５月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．３
Ｍａｙ２００９
收稿日期：２００８－０９－１１
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）资助项目（２００７ＣＢ７０７８０４）；国家高技术研究发展计划（８６３计划）资助项目
（２００６ＡＡ０２０１０３）；国家自然科学基金资助项目（２０６７６０５３）；教育部新世纪优秀人才支持计划资助项目（ＮＣＥＴ－０７－０３８０）；江苏省
青年科技创新人才（学术带头人）基金资助项目 （ＢＫ２００６５０４）。
作者简介：钟传圣（１９８５—），男，江西永丰人，硕士研究生，研究方向：微生物学；饶志明（联系人），教授，Ｅｍａｉｌ：ｒａｏｚｍ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ高效转化植物甾醇为
雄甾 １，４ 二烯 ３，１７ 二酮的诱变选育
钟传圣１，饶志明１，夏海锋１，许正宏２，方慧英１，诸葛健１
（１．江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 ２１４１２２；２．江南大学 医药学院，无锡 ２１４１２２）
摘 要：采用紫外线、亚硝基胍复合诱变雄甾 ４烯 ３，１７二酮（ＡＤ）和雄甾 １，４ 二烯 ３，１７ 二酮（ＡＤＤ）的转
化产生菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ，结合平板筛选，获得一株遗传性状稳定单产 ＡＤＤ的突变菌株 Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ １１，
其ＡＤＤ质量浓度达到１２４６ｍｇ／Ｌ，比原始菌株（４８４ｍｇ／Ｌ）提高了１５０％，经初步优化后发酵液中 ＡＤＤ最高达到
１４３０ｍｇ／Ｌ，发酵液中ＡＤＤ质量占ＡＤＤ、ＡＤ两产物质量总和的比例由７０％提高到９９１％。
关键词：紫外诱变；植物甾醇；微生物转化；雄甾 １，４二烯 ３，１７二酮
中图分类号：Ｑ８１５ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０３－００４３－０４
ＭｕｔａｔｉｏｎｂｒｅｅｄｉｎｇｏｆＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．ｆｏｒｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ
ｐｈｙｔｏｓｔｅｒｏｌｉｎｔｏａｎｄｒｏｓｔ１，４ｄｉｅｎｅ３，１７ｄｉｏｎｅ
ＺＨＯＮＧＣｈｕａｎｓｈｅｎｇ１，ＲＡＯＺｈｉｍｉｎｇ１，ＸＩＡＨａｉｆｅｎｇ１，ＸＵＺｈｅｎｇｈｏｎｇ２，
ＦＡＮＧＨｕｉｙｉｎｇ１，ＺＨＵＧＥＪｉａｎ１
（１．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＪｉａｎｇｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ；
２．ＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，ＪｉａｎｇｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡｍｕｔａｎｔＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．１１ｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＵＶＮＴＧｍｕｔａｔｉｏｎａｎｄｐｌａｔｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇｆｒｏｍａ
ｐａｒｅｎｔｓｔｒａｉｎＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．ａｎｄｉｔｃｏｕｌｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｓｔｅｒｏｌｉｎｔｏａｎｄｒｏｓｔ１，４ｄｉｅｎｅ３，１７ｄｉｏｎｅ（ＡＤＤ）
ａｓｔｈｅｍａｉｎｐｒｏｄｕｃｔ．ＴｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆＡＤＤｗａｓｓｕｐｅｒｉｏｒｔｏｔｈａｔｏｆｔｈｅｐａｒｅｎｔａｌｓｔｒａｉｎ，ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａ
ｔｉｏｎｏｆＡＤＤｉｎｃｒｅａｓｅｄｆｒｏｍ４８４ｍｇ／Ｌｔｏ１２４６ｍｇ／Ｌ．ＴｈｅｈｉｇｈｅｓｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＡＤＤｒｅａｃｈｅｄ１４３０
ｍｇ／Ｌｂｙｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ．ＴｈｅｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｒａｔｅｏｆＡＤＤｏｎｓｕｍｏｆＡＤＤａｎｄＡＤｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｗａｓ
ｉｎｃｒｅａｓｅｄｆｒｏｍ７０％ ｔｏ９９１％．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＵＶｍｕｔａｔｉｏｎ；ｐｈｙｔｏｓｔｅｒｏｌ；ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ；ａｎｄｒｏｓｔ１，４ｄｉｅｎｅ３，１７ｄｉｏｎｅ
类固醇生产方式一般通过以下３个途径：１）从自
然界中直接分离；２）非甾体起始原料合成；３）从植物
和动物中分离出的类固醇中间体原料合成［１］。其中
类固醇的生产方式主要采取第３种，这种方式需消耗
大量的起始原料薯蓣皂素，造成甾体激素资源的紧
缺，因此以廉价的甾醇为原料生物转化生产激素中间
体产品，如雄甾 ４ 烯 ３，１７ 二酮（ＡＤ）和雄甾 １，
４二烯 ３，１７二酮（ＡＤＤ）已受到广泛关注［２－４］。
我国是一个农业大国，大豆来源丰富，精炼大
豆油和菜籽油的脱臭馏出物中可分离得到大量的
植物甾醇，为了有效利用这一资源，国内已开展了
相关研究［５－８］。通过微生物转化植物甾醇生产
ＡＤＤ时通常同时生成 ＡＤ，而 ＡＤＤ与 ＡＤ的理化性
状非常相似，分离纯化困难，所以筛选一株单产
ＡＤＤ的菌株尤为重要。本研究从实验室能转化植
物甾醇生成 ＡＤＤ、ＡＤ的菌株出发，经紫外线 亚硝
基胍（ＵＶＮＴＧ）复合诱变获得一株单产 ＡＤＤ的菌
株，对其生产性能进行初步优化。
１ 材料与方法
１１ 菌种
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．由江南大学工业微生物研究
中心筛选提供。
１２ 培养基
固体培养基（ｇ／Ｌ）：蛋白胨 ５，牛肉膏 ３，ＮａＣｌ
１５，琼脂２０。ｐＨ７０。
种子培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖５，蛋白胨５，牛肉膏
３。ｐＨ７０。
选择（ＳＭ）培养基（ｇ／Ｌ）［９］：ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４１５，
ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０２，Ｋ２ＨＰＯ４０４，ＫＨ２ＰＯ４０８，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ
０００５，ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０００２，ＭｎＣｌ２·４Ｈ２Ｏ００００５。
发酵培养基（１Ｌ）：在选择培养基上添加，植物
甾醇５ｇ，葡萄糖１０ｇ，蛋白胨１０ｇ，助溶剂Ｔｗｅｅｎ８０
３ｍＬｐＨ７０。
发酵条件：体积分数１２％接种量，１００ｍＬ／５００ｍＬ
三角瓶装液量，２２０ｒ／ｍｉｎ培养７ｄ［１０］。
１３ 诱变选育
１３１ 菌悬液制备
新鲜斜面菌种接种于种子摇瓶，３０℃培养至对
数生长前期，制备成１０８ 个／ｍＬ的菌悬液。
１３２ 紫外诱变
菌悬液转入灭菌培养皿（直径９ｃｍ）中，置于磁
力搅拌器上，２５Ｗ紫外灯下３０ｃｍ处分别照射０、
１５、３０、４５、６０、７５和９０ｓ后取出，照射前后的菌液各
０１ｍＬ进行适当梯度稀释后涂布于至固体培养基
上，３０℃暗培养７２ｈ后计数，计算致死率。
１３３ 亚硝基胍诱变
取一定量的菌悬液，加入适当的 ＮＴＧ溶液，使
其质量浓度为０３ｍｇ／ｍＬ，振荡混匀后反应不同的
时间，快速离心终止反应，用０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７０的磷
酸盐缓冲液洗涤离心３～５次，取０１ｍＬ菌悬液适
当稀释涂布至固体培养基上，３０℃下培养７２ｈ后计
数，计算致死率。
１３４ ＵＶＮＴＧ复合诱变
取一定量的菌悬液紫外线照射后，再用 ０３
ｍｇ／ｍＬ的ＮＴＧ作用（根据致死率曲线分别确定时
间），诱变结束后离心终止反应，取０１ｍＬ的菌悬
液适当稀释后涂布于平板固体培养基上，３０℃下培
养７２ｈ后计数。
１３５ 菌株筛选［１０］
从菌落生长状况差异较大的平板中挑取单菌
落克隆接种到 ＳＭ１（ＳＭ＋植物甾醇）、ＳＭ２（ＳＭ＋
ＡＤ）、ＳＭ３（ＳＭ＋ＡＤＤ）３种固体培养基中，３０℃培
养４８ｈ，进行初筛。选择在 ＳＭ１、ＳＭ２上长势良好、
ＳＭ３上不长或长势缓慢的菌落进行摇瓶发酵复筛，
挑选转化率较高、ＡＤＤ所占产物比例较高的菌株。
１４ 分析方法
１４１ 生物量的测定［１１］
以稀释５倍的发酵液在可见分光光度计６００ｎｍ
处的光吸收值间接表示。
１４２ 底物残留浓度的测定
根据ＬｉｅｂｅｒｍａｎＢｕｒｃｈａｒｄ显色反应检测［１２］。
１４３ 产物ＡＤＤ与ＡＤ的定量分析
色谱柱ＡｌｔｉｍａＣ１８（５μＬ，２５０ｍｍ×４６ｍｍ）；
流动相Ｖ（甲醇）∶Ｖ（水）＝７∶３；检测器ＵＶＤｅｔｅｃｔｏｒ；
检测波长２５４ｎｍ；柱温：室温；进样量 ２０μＬ；流速
０８５ｍＬ／ｍｉｎ；用外标法计算发酵液中产物ＡＤＤ、ＡＤ
的质量浓度，雄甾烯酮标准品，色谱纯，购于 Ｓｉｇｍａ
公司。
２ 结果与讨论
２１ ＵＶＮＴＧ复合诱变处理剂量的选择
紫外诱变、ＮＴＧ诱变致死率分别如图１、图２所
示。考虑致死率在 ７０％ ～８０％时菌株正突变概率
高的情况，ＵＶＮＴＧ复合诱变处理方式和剂量为：菌
悬液经２５Ｗ紫外灯３０ｃｍ处照射４０ｓ后，再由０３
ｍｇ／ｍＬ的亚硝基胍作用４５ｍｉｎ。
２２ 诱变筛选
从菌落生长状况差异较大的平板中挑取２００株
单菌落克隆接种到ＳＭ１、ＳＭ２、ＳＭ３，选择在ＳＭ１、ＳＭ２
上长势良好，ＳＭ３上不长或长势缓慢的菌落６０株进
行摇瓶发酵复筛（底物甾醇５ｇ／Ｌ），发现正突株有１９
株，其中４株转化率明显提高（表１）。分析表１发
现：７、１１号 ＡＤＤ产量提高了１５倍，５、１４号也提高
４４ 生 物 加 工 过 程 第７卷
了１倍；除７号菌株外，其他３株菌在发酵液中，ＡＤＤ
质量占ＡＤ与ＡＤＤ质量总和的比例均超过了９７％。
图１ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ的紫外致死率曲线
Ｆｉｇ．１ ＵＶｆａｔａｌｉｔｙｒａｔｅｃｕｒｖｅｏｆＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．
图２ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．的ＮＴＧ致死率曲线
Ｆｉｇ．２ ＮＴＧｆａｔａｌｉｔｙｒａｔｅｃｕｒｖｅｏｆＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．
表１ ４株正突变株的产物生成率情况
Ｔａｂｌｅ１ Ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｆｏｕｒｇｅｎｅｒａｔｉｎｇｍｕｔａｎｔｓｔｒａｉｎｓ
突变株 ρ（ＡＤＤ）
／
（ｍｇ·Ｌ－１）
ＡＤＤ摩尔
生成率／％
φ（ＡＤＤ）／
％
ＡＤＤ提高
率／％
对照 ４８４ １３８６ ７１２１
５ １０５９ ３０３４ ９７５２ １１８８６
７ １２９６ ３７３２ ９４４４ １６７８２
１１ １２４６ ３５６２ ９７２５ １５７９８
１４ １０７０ ３０６４ ９８７２ １２１０７
—此处所列值为３次试样平均值
２３ 传代稳定性实验
选取复筛得到的转化效果最好的４株菌株进行
传代稳定性实验（图３），发现１４号与１１号菌株遗
传性状比较稳定，１１号菌株产物的积累保持在
１２００ｍｇ／Ｌ，而初代发酵液中产物积累浓度最高的７
号菌株以及１４号菌株转化能力均随着传代次数的
增加而不断下降。
图３ ４株正突变株的传代稳定实验
Ｆｉｇ．３ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｏｆ４ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇｍｕｔａｎｔｓｔｒａｉｎ
２４ 底物质量浓度的选择
改变发酵液中初始底物的投加浓度，将筛选得
到的菌株 Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ１１在 ３０℃、ｐＨ７０、
２２０ｒ／ｍｉｎ条件下发酵７ｄ，产物的生成情况如图４
所示。由图４可知，ＡＤＤ的质量浓度随着底物初始
投加质量浓度的增加而提高，但是产物的摩尔生成
率呈下降趋势，当底物投加质量浓度超过 １０ｇ／Ｌ
后，发酵液中产物的质量浓度没有得到提高。当底
物投加质量浓度为８ｇ／Ｌ时，发酵液中ＡＤＤ的质量
浓度最高达到 １３０８ｍｇ／Ｌ，此时产物生成率为
２３４％，ＡＤＤ在两产物中的质量分数达９９１％。
图４ 底物质量浓度对产物生成率的影响
Ｆｉｇ．４ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ
ｓｕｂｓｔｒａｔｅｏｎｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ
２５ 助溶剂的选择
为了提高底物溶解性，常选用Ｔｗｅｅｎ８０为助溶剂，
但是Ｔｗｅｅｎ８０作为助溶剂产生的泡沫过多，发酵罐放
大发酵时需加一定浓度的消泡剂，不利于菌株的发酵
转化，有文献报道卵磷脂的助溶效果比Ｔｗｅｅｎ８０好［１３］，
遂在底物初始质量浓度８ｇ／Ｌ时选择卵磷脂为助溶剂，
结果如图５所示。由图５可知，选择卵磷脂为助溶剂
后ＡＤＤ摩尔生成率明显比Ｔｗｅｅｎ８０为助溶剂时（图４
所示）要高，当卵磷脂质量浓度为６ｇ／Ｌ时，产物摩尔生
成率达到２５１％，此时ＡＤＤ质量浓度为１４３０ｍｇ／Ｌ，占
５４ 第３期 钟传圣等：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ高效转化植物甾醇为雄甾 １，４二烯 ３，１７二酮的诱变选育
两产物总和的９９１％。
图５ 助溶剂卵磷脂对产物生成率的影响
Ｆｉｇ．５ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅｌｅｃｉｔｈｉｎｏｎｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｄｕｃｔｓ
３ 结 论
以 Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ为出发菌株，经 ＵＶＮＴＧ
复合诱变结合平板筛选，获得一株主要转化植物甾
醇为雄甾 １，４ 二烯 ３，１７ 二酮的突变菌株Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ １１。突变株生产ＡＤＤ的能力得到明
显提高，产物质量浓度由 ４８４ｍｇ／Ｌ提高到１２４６
ｍｇ／Ｌ，产物ＡＤＤ摩尔生成率达到３５６２％。当底物
初始投加质量浓度为５ｇ／Ｌ时，发酵液中ＡＤＤ质量
分数由７１２１％提高到９９１％，同时产物生成率提
高了１５０％，经过底物浓度的优化后确定，底物质量
浓度８ｇ／Ｌ时添加６ｇ／Ｌ助溶剂卵磷脂，产物质量浓
度提高到１４３０ｍｇ／Ｌ，此时产物ＡＤＤ摩尔生成率为
２５１％，ＡＤＤ质量占两产物质量总和的９９１％。
优化部分发酵条件后，发现 ＡＤＤ质量浓度提
高，但 ＡＤＤ摩尔生成率却下降，分析原因主要是高
浓度底物对细胞生长的毒害以及产物 ＡＤＤ积累到
一定程度反馈抑制 ＡＤＤ的生成。如何解决这一问
题，提高底物的转化率，还应进一步探索。
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ｔｅｃｈｎｏｌ，２００２，７７（１２）：１３４９１３５７．
６４ 生 物 加 工 过 程 第７卷