全 文 ：第７卷第４期
２００９年７月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．４
Ｊｕｌｙ２００９
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１７６２－３６７８．２００９．０４．００８
收稿日期：２００８－１０－２１
基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０５００３８４）
作者简介：吕新萍（１９８３—），女，山东烟台人，硕士，研究方向：酶工程学；朱启忠（联系人），教授，Ｅｍａｉｌ：ｈｚｚｑｚ＠ｓｄｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
白毒鹅膏菌液体培养特性及不同
生长时期胞外酶活性
吕新萍，朱启忠，董翠玲
（山东大学威海分校 海洋学院，威海 ２６４２０９）
摘 要：用马铃薯葡萄糖琼脂液体培养基培养白毒鹅膏菌，测定培养过程中的ｐＨ变化、蛋白质含量２项生理指标
与６种胞外酶的活性。结果表明：在整个培养过程中，６种胞外酶均有酶活，但不同酶的活性差异较大，产酶高峰也
不尽相同，淀粉酶于第５ｄ达到峰值（１９８Ｕ）；羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶和滤纸纤维素酶的酶活变化趋势相
近，分别为１９９、１９９、１９８Ｕ；愈创木酚氧化酶与邻苯二酚氧化酶的酶活分别在第１０ｄ、第１１ｄ达到峰值，分别为１８２、
５８Ｕ。蛋白含量和ｐＨ随时间变化，且与酶活力有关。
关键词：白毒鹅膏菌；液体培养；胞外酶
中图分类号：Ｑ９３９．５ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０４－００３６－０４
ＬｉｑｕｉｄｃｕｌｔｕｒａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＡｍａｎｉｔａｖｅｒｎａａｎｄｉｔｓ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒｅｎｚｙｍｅｓ
ＬＸｉｎｐｉｎｇ，ＺＨＵＱｉｚｈｏｎｇ，ＤＯＮＧＣｕｉｌｉｎｇ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＯｃｅｎｏｇｒａｐｈｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＷｅｉｈａｉＢｒａｎｃｈｏｆＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｉｈａｉ２６４２０９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｄｙｎａｍｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎｓｏｆｔｗｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｄｉｃｅｓａｎｄａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｓｉｘｋｉｎｄｓｏｆｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒｅｎｚｙｍｅｓｄｕｒ
ｉｎｇｔｈｅｐｏｔａｔｏｄｅｘｔｒｏｓｅｙｅａｓｔｍｅｄｉｕｍｌｉｑｕｉｄｃｕｌｔｕｒｅｏｆＡｍａｎｉｔａｖｅｒｎａｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｄｕｒ
ｉｎｇｔｈｅｗｈｏｌｅｃｕｌｔｕｒｅｔｈｅｓｉｘｅｎｚｙｍｅｓｈａｖｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｔｈｅｉｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｐｅａｋｓｗｅｒｅａｌｓｏｄｉｆｅｒｅｎｔ．Ａｍｙｌａｓｅｒｅａｃｈｅｄ
ｔｈｅｐｅａｋｉｎｔｈｅｆｉｆｔｈｄａｙ（１９８Ｕ）．Ｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｎｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｕｌａｓｅ，ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｉｎｅｃｅｌｕｌａｓｅ，ａｎｄ
ｆｉｌｔｅｒｐａｐｅｒｃｅｌｕｌａｓｅｓｈｏｗｅｄｓｉｍｉｌａｒｔｒｅｎｄｓ（１９９Ｕ，１９９Ｕ，１９８Ｕ）．Ｇｕａｉａｃｏｌｏｘｉｄａｓｅａｎｄｃａｔｅｃｈｏｌｏｘｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ
ｒｅａｃｈｅｄｔｈｅｍａｘｉｍａｐｅａｋｉｎｔｈｅ１０ｔｈｄａｙ，ａｎｄｔｈｅ１１ｔｈｄａｙ（１８２Ｕ，５８Ｕ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ
ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｐＨｖａｌｕｅｃｈａｎｇｅｄｗｉｔｈｔｈｅｔｉｍｅａｎｄｉｔｉｓｒｅｌａｔｉｖｅｗｉｔｈｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｍａｎｉｔａｖｅｒｎａ；ｌｉｑｕｉｄｃｕｌｔｕｒｅ；ｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒｅｎｚｙｍｅ
白毒鹅膏菌（Ａｍａｎｉｔａｖｅｒｎａ）又名白毒伞、白帽
菌（四川）、白罗伞（云南）、白鹅膏、春生鹅膏，属鹅
膏菌科鹅膏菌属，属树木的外生菌根菌［１－２］。早在
１８９５年，Ｐａｔｏｕｉｌａｒｄ就对我国四川的白毒鹅膏菌作
过记载［３］。鹅膏菌属菌类，价值大、应用范围广，在
生物防治、开发新特效药如抗肿瘤药、抗菌及抗病
毒药、镇静或麻醉药等领域具有潜在的应用价值。
尤其是抗菌药物的筛选，目前已将 Ａｍａｎｉｔａ作为首
选研究对象。
白毒鹅膏菌在液体培养条件下的特性及胞外
酶活性方面的研究尚未见报道。本文对白毒鹅膏
菌液体培养过程中的胞外蛋白含量、ｐＨ、胞外酶活
性（羧甲基纤维素酶、多酚氧化酶、愈创木酚氧化
酶、淀粉酶、滤纸纤维素酶、微晶纤维素酶）等８项
指标进行了连续１６ｄ的定时测定，为其生理生化研
究及其进一步的有效利用提供了一定的理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 实验材料
１．１．１ 供试菌种
白毒鹅膏菌（Ａｍａｎｉｔａｖｅｒｎａ）菌株由山东威海玛
珈山上一木桩采集并分离培养而来。
１．１．２ 固体培养基（ｇ／Ｌ）
马铃薯 ２００，葡萄糖 ２０，琼脂 ２０，ＫＨ２ＰＯ４３，
ＭｇＳＯ４１５，ＶＢ００１。
１．１．３ 液体培养基（ｇ／Ｌ）
马铃薯２００，葡萄糖 ２０，酵母膏 ５，ＫＨ２ＰＯ４３，
ＭｇＳＯ４１５，ＶＢ００１。
１．２ 菌丝体培养方法
向装有５０ｍＬ液体培养基的２５０ｍＬ三角瓶中接
入２８℃培养６ｄ的平板菌种（用无菌打孔器打成
１０ｍｍ菌片）３片，２８℃、１１０ｒ／ｍｉｎ，恒温振荡培养。
１．３ 分析方法
１．３．１ 粗酶液制备
从菌丝培养之日起，每天定时准确量取１０ｍＬ
培养液，４０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，上清液即为粗
酶液。
１．３．２ 酶活测定［４］
酶活定义：以每 ｍｇ蛋白每 ｍｉｎ使 ＯＤ值增加
０００１作为一个酶活单位（Ｕ）。
１．３．３ ｐＨ测定
采用ＰＨＳ ３Ｃ数字酸度计测定。
１．３．４ 胞外蛋白含量的测定［５］
考马斯亮蓝法测定胞外蛋白含量。取质量浓
度（ｍｇ／ｍＬ）为００１、００２、００４、００６、００８、０１的
牛乳清蛋白溶液各００８ｍＬ，蒸馏水００２ｍＬ，加入
５ｍＬ考马斯亮蓝溶液，充分混匀，２ｍｉｎ后于５９５ｎｍ
测定光吸收值，作标准曲线。
以０１ｍＬ蒸馏水作空白对照，取培养液
００８ｍＬ，蒸馏水００２ｍＬ，考马斯亮蓝５ｍＬ，测
５９５ｎｍ处的吸收值，每组３个重复，取平均值。
２ 结果与分析
２．１ 白毒鹅膏菌液体培养生长规律
采用优化的培养基和工艺条件，考察白毒鹅膏
菌液体培养过程中培养基ｐＨ的变化与胞外蛋白含
量，实验结果分别如图１、图２所示。
图１ 发酵液ｐＨ随时间变化
Ｆｉｇ．１ ｐＨｏｆｆｌｕｉｄｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈｔｉｍｅ
图２ 胞外蛋白质随时间变化
Ｆｉｇ．２ Ｃｈａｎｇｅｓｏｆｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈｔｉｍｅ
由图 １可知，培养基中 ｐＨ变化不大（５５２～
６５６），说明白毒鹅膏菌在液体发酵中很少产生酸
类或碱类物质，喜欢生长在偏酸的环境。
胞外蛋白质是菌丝体生长过程中产生并分泌
到外界环境中的各种水解酶，如淀粉酶、纤维素酶、
蛋白酶以及木质素降解酶等。因此，液体培养过程
中胞外蛋白质质量浓度的变化（图２）表明了菌丝体
生长过程中胞外酶的种类及数量的变化，也说明菌
丝体生长过程中对外界有机营养物分解利用能力
的变化［６］。在整个发酵过程中，发酵液中蛋白质量
浓度在 １～８ｄ时由 ９５６ｍｇ／ｍＬ内迅速增为
１７１９ｍｇ／ｍＬ，随后增长缓慢。到第１１ｄ蛋白质含
量达到最大，此后基本稳定。
２．２ 白毒鹅膏菌产淀粉酶能力
微生物的酶几乎都是分泌性的，而其淀粉酶以
Ｃａ２＋为必需因子并作为稳定因子，既作用于直链淀
粉，亦作用于支链淀粉，具有重要意义。图３为白毒
鹅膏菌产淀粉酶的产酶曲线。
由图３可知，在整个发酵过程中，淀粉酶的活性
７３ 第４期 吕新萍等：白毒鹅膏菌液体培养特性及不同生长时期胞外酶活性
图３ 淀粉酶活性随时间变化
Ｆｉｇ．３ Ｃｈａｎｇｅｓｏｆｄｉａｓｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｗｉｔｈｔｉｍｅ
在菌丝生长初期较高，第５ｄ即出现产酶高峰（１９８
Ｕ），此后逐渐下降。说明白毒鹅膏菌在液体培养条
件下培养前期利用淀粉较多，而在生长后期利用淀
粉则较少。
２．３ 白毒鹅膏菌产羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶
和滤纸纤维素酶能力
白毒鹅膏菌在培养条件下能产生羧甲基纤维
素酶（ＣＭＣａｓｅ）、微晶纤维素酶（ＭＣａｓｅ）和滤纸纤维
素酶（ＦＰａｓｅ），具体情况见图４。
图４ 羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶和滤纸
纤维素酶的活性随时间变化
Ｆｉｇ．４ ＣｈａｎｇｅｓｏｆＣＭＣａｓｅ，ＭＣａｓｅ，ａｎｄ
ＦＰａｓｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｗｉｔｈｔｉｍｅ
由图４可见，液体培养过程中微晶纤维素酶、滤
纸纤维素酶、羧甲基纤维素酶的活性均出现了明显的
消长变化过程。滤纸纤维素酶活性高峰出现最早，第
６ｄ即出现产酶高峰（１９９Ｕ）。羧甲基纤维素酶产酶
高峰出现在第７ｄ（１９９Ｕ），且维持的时间很短，此后
迅速下降，在６～１０ｄ内酶活性一直很低。在第１１ｄ
又出现一个小高峰，这说明在该培养条件下，至少能
产生２种不同的半纤维素酶物质。微晶纤维素酶的
活性高峰也在第７ｄ出现（１９８Ｕ），与羧甲基纤维素
酶活性相近，变化趋势也类似。
２．４ 白毒鹅膏菌产愈创木酚和多酚氧化酶曲线
由图５可知：愈创木酚氧化酶和多酚氧化酶的
活性高峰期到来较晚（愈创木酚氧化酶第１２ｄ，多
酚氧化酶第１０ｄ），要在纤维素酶和半纤维素酶活
性降到较低水平时才出现，说明白毒鹅膏菌利用木
质素要比纤维素和半纤维素晚［７］。白毒鹅膏菌液
体培养过程中愈创木酚氧化酶活性开始较低，１０ｄ
后迅速增高，到第 １２ｄ时达到峰值，其活性值从
１７６Ｕ增至１８２Ｕ，此后酶活性急速下降，到第１６ｄ时
降至１４１Ｕ。多酚氧化酶活性在整个液体培养过程
中活性较低，第１０ｄ为最大峰值（５８Ｕ）。对整个液
体培养过程而言，与木质素降解相关的多酚氧化酶
活性并不高，而愈创木酚酶和漆酶（以前测得）活性
较高（１８２Ｕ，２０９Ｕ），说明白毒鹅膏菌在液体培养
过程中可以对木质素进行降解。
图５ 愈创木酚氧化酶与多酚氧化酶活性的变化
Ｆｉｇ．５ Ｃｈａｎｇｅｓｏｆｇｕａｉａｃｏｌｏｘｉｄａｓｅａｎｄｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ
ｏｘｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｗｉｔｈｔｉｍｅ
３ 结 论
从白毒鹅膏菌的产酶曲线来看：几种胞外酶中
酶的活性高峰期以淀粉酶最早（第５ｄ），其次是纤
维素酶（第７ｄ），最后是多酚氧化酶（第１０ｄ）和愈
创木酚氧化酶（第１２ｄ），这表明白毒鹅膏菌对培养
基中碳水化合物的利用顺序为可溶性糖、淀粉、纤
维素、木质素。
从几种胞外酶的酶活高低来看，纤维素酶活性较
高（１９９Ｕ），可以利用它来降解纤维素进行生物转化，
这对于解决能源危机、环境污染和粮食短缺均有重要
意义。同时愈创木酚酶活性也较高（１８２Ｕ），可以用
来降解木质素等物质。
参考文献：
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１５１８．
国外动态
法国开发出分子诊断检测新技术
法国技术人员开发出一种分子诊断检测技术，该技术可通过检测人乳头瘤病毒来预防宫颈癌。检测人
乳头瘤病毒的分子诊断技术可用来检测具有早期癌病变可能的子宫颈损伤。这些方法与细胞学检查（子宫
颈巴氏涂片）配合使用，有助于确定哪些妇女具有不正常的细胞学结果（ＡＳＣＵＳ，即意义不明确的非典型鳞
状细胞），然后再对这些妇女进行宫颈镜检查，切片化验，并进行治疗。
法国生物梅里埃公司推出的这种ＮｕｃｌｉＳＥＮＳＥａｓｙＱＨＰＶ试剂正是基于这种创新观念的检测方法，可以
从在全世界导致宫颈癌的５种最常见的人乳头瘤病毒（ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３和ＨＰＶ４５）当中直接
检测到高致癌风险的基因表达。利用这种特异的检测方法，医生便掌握了一种具有高度医学价值的检测技
术，从而大大改善对病人的治疗效果。
Ｅ６／Ｅ７ｍＲＮＡ检测的临床价值在医学界逐渐得到广泛的承认，丹麦最近已在全国性的宫颈癌筛查指南
当中写入了这种技术的使用。
乌克兰政府致力于扩大生物能源生产
２００９年乌克兰将有一系列生物燃料企业投产。目前乌有５０家生物燃料企业，可年产２５万 ｔ生物柴
油。计划在顿涅茨克州建设生物柴油厂，年产量为３０万ｔ；赫梅尔尼茨克州的一家公司引进捷克投资，改建
糖厂，可年产７５万 ｔ生物柴油。目前已有４家酒精生产厂转为生产生物乙醇，年产量达到３６万 ｔ。２００９
年还有６家酒精企业将转向生产生物乙醇。其中，基辅州的一家名为“КоронАгро”的公司计划在切尔卡瑟
州建厂生产生物乙醇，年产量为３０万ｔ。
（朱宏阳）
９３ 第４期 吕新萍等：白毒鹅膏菌液体培养特性及不同生长时期胞外酶活性