全 文 ：对羟基苯乙腈水合酶高产菌株的选育
蔡 谦，吴明火!，郑裕国，沈寅初
（浙江工业大学 生物与环境工程学院，杭州 !"##!$）
摘 要：从全省各处采集的 %# 多份土样筛选到一株产腈水合酶能力较高的菌株 &"#’，该菌株产生的腈水合酶为非
诱导酶，产酶条件优化实验结果表明，产酶培养基组成：麦芽糖 $# ( ) *，酵母膏 % ( ) *，尿素 + ,% ( ) *，味精 # ,+% ( ) *，
-$./01 # ,% ( ) *，-.$/01 # ,% ( ) *，2(301 # ,% ( ) *，45301·+.$0 "# 6( ) *，7879$ "# 6( ) *，微量元素母液 # ,: 69 ) *；最佳培
养条件为：培养温度 $: ;，摇床转速 "%# < ) 6=>，培养基起始 ?. + ,#，培养时间 % @，在优化培养条件下，" A可将 " ( ) *
质量浓度的底物对羟基苯乙腈全部转化为对羟基苯乙酰胺。
关键词：对羟基苯乙酰胺（./BC）；对羟基苯乙腈；腈水合酶
中图分类号：DE!! 文献标识码：B 文章编号："F+$ G !F+:（$##%）#! G ##!: G #1
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对羟基苯乙酰胺为合成阿替洛尔（BV5>8989）的
重要中间体［"］。阿替洛尔又叫氨酰心胺，是一种新
的!"K肾上腺素能受体阻滞剂
［$］，对心脏的!"受体有
选择的阻滞作用。B3H3Y 研究比较了!"受体阻滞剂
阿替洛尔对缺血性心脏病人的长期预后影响，与安
慰剂比较阿替洛尔可明显降低死亡、心肌梗死、心脏
病发作次数及入院率。突然减少!"受体阻滞剂用量
会使病人病情恶化。
临床研究结果表明：!"受体阻滞剂阿替洛尔能
有效预防心脏 _ 综合症患者的心绞痛症状，!受体
阻滞剂应用于临床已有 1% 年，优于硝酸酯、二氢吡
啶类。至今其临床治疗重要性有增无减，并且获得
了令人振奋的证据［!］。!受体阻滞剂治疗心绞痛，
通过降低心肌耗氧量、控制心肌缺血而预防冠心病
! 收稿日期：$##%K#:K#$
基金项目：国家重点基础研究发展规划项目（N8,$##!7S+"F##%，E+! 项目）
作者简介：蔡 谦（"E+:K），女，硕士研究生，浙江工业大学生物工程研究所，专业方向：腈水合酶筛选
研究。
联系人：郑裕国，&K6’=9：ZA5>(T(‘ ZWLV , 5@L , Q>，Y59：#%+"K::!$#F"1，4’[：#%+"K::!$#F!#
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·!:·
生 物 加 工 过 程
7A=>5X5 b8L<>’9 8R S=8?<8Q5XX &>(=>55<=>(
第 ! 卷第 ! 期
$##% 年 : 月
万方数据
发作、改善预后。阿替洛尔已成为临床最受重视的
!受体阻滞剂
［!］，是专科医院治疗心血管疾病的常
用药物。因此，对羟基苯酰胺作为合成阿替洛尔的
重要中间体同时也具有很好的市场应用前景，目前
国内外主要采用化学法合成对羟基苯乙酰胺，化学
法合成通常存在周期长，处理步骤繁复，原材料消耗
大，污染严重等问题。研制和开发用微生物法合成
对羟基苯乙酰胺，是目前亟待解决的课题，不仅可以
给医药行业带来可观的经济效益，同时也符合现代
绿色经济发展的需求，减少环境污染，保护生态平
衡。
"##$ 年，丹麦的 %&’& ()*+,-./ 0 1 2报道了能水合
非环式、环式和杂环腈以及能水合含酸性或碱性基
团腈的水合酶［3 4 5］。其中该酶能转化的底物包括对
羟基苯乙腈，同时证明苯环上对位吸电子基团取代
能促进酶的水合作用，相反吸电子基团取代会抑制
酶的水合作用［6，7］。
但目前国内外并没有直接报道以对羟基苯乙腈
为底物，用微生物法合成对羟基苯乙酰胺。
! 材料与方法
" 8" 土样
从浙江省杭州、舟山、东阳、金华等地采集供菌
种筛选。
" 8! 培养基及培养条件
" 8! 8" 富集培养基及条件
葡萄糖 "$ 9 1 :，;!<=>3 $ 879 1 :，;3 ? 8? 9 1 :，
@92>3·6 $ 8! 9 1 :，%ABC " 9 1 :，DE2>3·6
"$ F9 1 :，BABC! "G F9 1 :，对羟基苯乙腈 "$ 9 1 :，H<
6 8$ 4 6 8!。" 8$ I "$G =A 灭菌 !$ F/)。培养条件：!7
J，摇床转速 "G$ . 1 F/)，每批土样通过 ? 次富集，每
次富集时间 ? 4 3 *。
" 8! 8! 平板固体培养基及培养条件
平板培养基成分与富集培养基同，琼脂加入量
!$ 9 1 :。培养条件：!7 J，培养箱中培养 ? 4 3 *。
" 8! 8? 斜面固体培养基及培养条件
葡萄糖 "$ 9 1 :，酵母膏 ? 9 1 :，;!<=>3 $ 8! 9 1 :，
;3 $ 83 9 1 :，@92>3·6 $ 8! 9 1 :，%ABC " 9 1 :，琼
脂 !$ 9 1 :，H<自然。培养条件：!7 J，培养箱中培养
! 4 ? *。
" 8! 83 产酶培养基及培养条件
麦芽糖 !$ 9 1 :，酵母膏 G 9 1 :，尿素 6 8G 9 1 :，味
精 $ 86G 9 1 :，;!<=>3 $ 8G 9 1 :，;3 $ 8G 9 1 :，@92>3
$ 8G 9 1 :，DE2>3·6 "$ F9 1 :，B&BC! "$ F9 1 :，微量元
素母液 $ 87 FC 1 :，H< 6 8$ 4 6 8!。" 8$ I "$G =A 灭菌
!$ F/)。培养条件：!7 J，培养 G 4 5 *，摇床转速
"G$ . 1 F/)。
" 8! 8G 种子培养基及培养条件
麦芽糖 !$ 9 1 :，酵母膏 G 9 1 :，;!<=>3 $ 8G 9 1 :，
;3 $ 8G 9 1 :，@92>3 $ 8! 9 1 :，%ABC " 9 1 :，H< 6 8$
4 6 8!。" 8$ I "$G =A 灭菌 !$ F/)。培养条件：!7 J，
培养 6! K，摇床转速 "G$ . 1 F/)。
" 8? 方法
" 8? 8" 菌种初筛
将采集的土样通过 ? 次富集培养，从而得到能
在腈环境下生长的菌种，经过富集的土样再稀释不
同梯度后涂布于分离平板，挑取生长形态不同的菌
株作为复筛的对象。
" 8? 8! 菌种复筛
将初筛菌种接种于液体发酵培养基中，摇床振
荡培养 ! * 后，加入 $ 8$?L（质量分数）的对羟基苯
乙腈做为诱导，诱导培养 37K。诱导培养后的菌种
通过离心，再用生理盐水洗涤 ! 次，得到菌体在 H<
M 6 8$ 的磷酸缓冲液中转化，底物为 $ 8"L（质量分
数），转化液通过液相检测，能水合对羟基苯乙腈为
对羟基苯乙酰胺的菌株为目的菌株。离心转速为
# 8$ I "$? . 1 F/)。
" 8? 8? 检测方法
薄层色谱（N:B）检测：转化液通过离心，用毛细
管点样于硅胶板，在 !（乙醇）O !（水）M #G O G 的展开
剂中展开后，放入到碘缸中显色。通过显色的斑点
大小和浓度来初步确定转化情况。离心转速 "! 8$
I "$? . 1 F/)。
高效液相色谱（<=:B）检测：N:B 初步确定具有
活性的菌株转化液通过离心、过滤后用 <=:B 检测。
流动相为 !（甲醇）O !（水）O !（ "#$）O !（乙酸）M ?G O
5G O " O "，流速为 " F: 1 F/)，在 !63 )F条件下检测，每
针注入样品量为 !$":。离心转速 "! 8$ I "$
? . 1 F/)。
" 8? 83 酶活定义
在一定条件，" F/)转化底物得到 ""F&C 对羟基
苯乙酰胺所需的酶量为 " 个酶活单位 P。
" 结果与讨论
! 8" 菌种的分离筛选
从采集的 G$ 多份土样中，通过富集、平板初筛，
及摇瓶培养、转化复筛后共得到 7 株能水合对羟基
!$$G 年 7 月 蔡 谦等：对羟基苯乙腈水合酶高产菌株的选育 ·?#·
万方数据
苯乙腈为对羟基苯乙酰胺的菌株。其中以编号为
!"#$的菌株活性最高，" % 可将底物全部转化，同时
&’ % 检测，没有对应酸产生，说明该菌株产腈水合
酶，不含腈水解酶及酰胺酶。
& (& 诱导剂对产酶的影响
将菌株 !"#$接一环到 )# *+的种子培养基中，
培养 ’) %，然后种子培养液按接种量为 &,（体积分
数）接入到新的培养基中，培养到对数生长期，再加
入诱导剂，分别为对羟基苯乙腈、对羟基苯乙酰胺、
对羟基苯乙酸、苯乙腈、乙腈、尿素。诱导剂加量为
# (#-,（质量分数）。腈直接加入到发酵培养基中，
对羟基苯乙酸、对羟基苯乙酰胺、尿素过滤除菌加
入。每种诱导剂分别做 - 个平行。同时不加任何诱
导剂的培养基作为对照。诱导培养 ’) % 后在 ./ 0
1 (#的磷酸缓冲液中转化，底物为 # (",（质量分
数），-# *23 取样，通过液相检测（图 "）。诱导剂对
羟基苯乙酰胺、对羟基苯乙酸诱导下酶活提高，分别
为 " ()&1、" ()& 4，而乙腈诱导下酶活基本不变，同时
在不做诱导的条件下，菌株 !"# 酶活力达到 " (5 4。
& (- 金属离子对酶活的影响
腈水合酶其活性部位通常含有一个金属离子，
同时一些金属离子如 67& 8、93& 8 等对其有激活作
用，一些重金属则起到抑制作用。本实验考察了
:;& 8、:<& 8、67& 8、/7 8、=2 8、>$& 8、93& 8、?@& 8、+2 8
对菌株 !"#$的活力影响。
"：无；&：对羟基苯乙酸；-：对羟基苯乙腈；
’：对羟基苯乙酰胺；5：乙腈；A：苯乙腈；1：尿素
图 " 诱导剂影响柱形图
?27 (" !BB@CD ;B E@F将菌株 !"#$接一环到 )# *+的种子培养基中，
培养 ’) %，然后种子培养基按接种量为 &,（体积分
数）接入到 -# *+不同的新培养基中，新培养基中分
别含 # (#5 **;G K + 的金属离子 :;& 8、:<& 8、67& 8、
/7 8、=2 8、>$& 8、93& 8、?@& 8、+2 8、微量元素母液 8
?@& 8 8 :;& 8，微量元素母液浓度为 # () *;G K +。培养
到对数生长期，加 # (#-,（质量分数）的对羟基苯乙
腈作为诱导剂诱导培养 ’) %，然后在 ./ 0 1 (# 的磷
酸缓冲液中转化，底物为 # (",（质量分数），每隔 &#
*23 取样，通过液相检测，其中 ’# *23 取样结果如图
& 所示。发现在 ?@& 8、93& 8对酶有明显的激活作用，
而 :<& 8存在下酶活力降低，对酶的活性具有抑制作
用。
"：空白；&：93& 8；-：=2 8；’：67& 8；
5：+2 8；A：/7 8；1：?@& 8；)：:<& 8；L：:;& 8；"#：>$& 8
图 & 金属离子对酶活影响柱形图
?27 (& !BB@CD ;B 6@D$G M;3H $3N M3%2O2D;PH ;3 D%@ !3IJ*@
& (’ 氮源对酶活的影响
尿素作为微生物培养基的氮源，同时会起到诱
导的作用。谷氨酸钠的含氮量较高，成分稳定，有利
于实验的可重复性。蛋白胨是一种用途十分广泛的
氮源，是一种两性电解质，具有良好的缓冲作用，易
溶于水，便于细菌吸收利用。黄豆粉浸液、牛肉浸膏
和酵母膏都是典型的浸出物，主要为微生物生长繁
殖提供可溶性含氮物质、核酸降解物、维生素以及无
机盐类等等。
将 " (& (’ 培养基中 & (5 7 K + 尿素替换为谷氨酸
钠、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏和黄豆粉作不同氮源影
响实验。菌株 !"#$ 种子经过 ’) % 培养，以 &,（体
积分数）的接种量接入到分别含以上不同氮源的培
养基中，氮源含量均为 5 7 K +。培养到对数生长期，
加 # (#-,（质量分数）的对羟基苯乙腈作为诱导剂，
诱导培养 ’) %，然后在 ./ 0 1 (# 的磷酸缓冲液中转
化，底物为 # (",（质量分数），-# *23 取样，用液相色
谱检测（图 -）。从图 - 中可以看出，以尿素作为氮
源，菌株 !"#$活力高，以蛋白胨作为其生长时的氮
源活力最低。
·’#· 生物加工过程 第 - 卷第 - 期
万方数据
!：对照 "；#：对照 ""；$：黄豆粉；%：蛋白胨；
&：酵母膏；’：尿素；(：牛肉膏；)：味精
图 $ *源影响柱形图
+", -$ .//012 3/ 4"253,04 506375106 34 280 .49:;0
# -& 碳源对酶活的影响
分别以尿素、柠檬酸、葡萄糖、甘油、乳酸、蔗糖
和麦芽糖作为不同碳源。菌株 .!<= 种子培养 %) 8
后，按 #>（体积分数）的接种量接入到分别含以上
不同碳源的培养基中，碳源均为 #< , ? @。培养到生
长对数期，加 < -<$>（质量分数）的对羟基苯乙腈作
为诱导剂，诱导培养 %) 8 后在 AB 为 ( -< 的磷酸缓
冲液中转化，底物为 < -!>（质量分数）。$< ;"4 取
样，通过液相色谱检测（图 %）。从图 % 中可以看出，
采用不同的碳源时，菌株的活力表现出很大的差异。
以麦芽糖和柠檬酸作为碳源，菌株的酶活力明显高
于其他 & 种碳源条件下培养的酶活力。其中以甘油
作为碳源，菌株的酶活力低，转化能力差。
!：无；#：尿素；$：柠檬酸；%：葡萄糖；
&：甘油；’：乳酸；(：蔗糖；)：麦芽糖
图 % C源影响柱形图
+", -% .//012 3/ 1=5D34 506375106 34 280 049:;0
# -’ 小结
实验对菌株 .!<= 培养的 C、* 源，金属离子及
诱导剂影响进行了考察。实验表明在不同 C、* 源
条件下培养，菌株的酶活表现出很大的差异，以麦芽
糖作为 C 源、尿素作为 * 源培养的活性高，在尿素
和酵母膏同时存在作为 * 源培养时，菌种生长快，
活性最高。该菌株在不经诱导的条件下其酶活达到
! -& E。尿素、对羟基苯乙酸、对羟基苯乙酰胺和苯
乙腈对其都有一定的诱导作用，金属离子 +0# F、
G4# F、H,#及 I=# F对菌株 .!<= 的酶活有明显的激活
作用，C7# F则对其有抑制作用。
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