全 文 ：对羟基苯乙腈水解酶产生菌的筛选及产酶条件研究
吴明火，蔡 谦，郑裕国，沈寅初!
（浙江工业大学 生物工程研究所，杭州 !"##"$）
摘 要：以对羟基苯乙腈为唯一氮源，从土壤中筛选到 % 株腈水解酶产生菌。在初筛的过程中，用薄板层析（&’(）
对细胞转化液定性检测，高效液相色谱法（)*’(）定量分析。考察了培养时间、不同碳源对细胞酶产量的影响及在
反应过程中金属离子对细胞酶产量的影响，实验结果发现，培养时间在 +# ,左右时细胞酶产量最高，以葡萄糖为碳
源质量，质量浓度在 "- .% / "% 0 1 ’附近酶产量最高。(2- 3对细胞酶活力具有非常强烈的抑制作用，(4- 3、)0- 3、56 3
等对细胞酶活力具有明显的抑制，而 78- 3、90- 3具有较明显的促进作用，但在高浓度下促进作用减弱。
关键词：腈水解酶；腈水合酶；对羟基苯乙腈；对羟基苯乙酸
中图分类号：: ;"$ 文献标识码：< 文章编号："=+- > !=+;（-##%）#$ > ##!- > #$
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K,N420, JINLLA6A0 8AV JLRLIK64A Y &,L LMMLIK 4M I2RK2NL K6ZL，I8NX4A J42NIL，ZLK8R 64AJ 4A K,L Q6LRV 4M LASQZL
ULNL JK2V6LV Y?,LA K,L I2RK2NL K6ZL AL8N +# ,，K,L 0R2I4JL 8J I8NX4A J42NIL U6K, K,L I4AILAKN8K64A 8N42AV
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6A,6X6K64A 4M (4- 3，)0- 3，56- 3 U8J 8RJ4 4XP642J Y 72K 78- 3 8AV 90- 3 64AJ I42RV 8IILRLN8KL K,L ,QVN4RQJ6J 4M
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腈是一类重要的化合物，它广泛存在于自然界
的植物中，它的水解反应被广泛应用于氨基酸、酰
胺、羧酸及其衍生物的合成，在有机合成中占有极其
重要的地位。腈水解的方法主要有化学水解法和生
物转化法。腈的化学水解因其需要强酸或强碱 、高
温、高压等反应条件，而且副产物多、产量低、环境污
染严重，而大大地限制了它在工业上的应用。相反，
生物转化法具有条件温和、环境污染小，并能实现化
学选择性、区域选择性和对映选择性等优点。生物
转化法涉及的酶系主要有腈水合酶、酰胺酶和腈水
解酶。腈水合酶可催化腈化合物水合生成相应的酰
胺，酰胺在酰胺酶的作用下，进一步转化生成相应的
羧酸及氨气。而腈水解酶则催化腈水解一步生成相
应的羧酸［" / $］。
对羟基苯乙酸是一种重要的有机合成中间体，
其应用领域覆盖医药、农药、液晶材料等多方面［%］。
! 收稿日期：-##%B#;B#-
基金项目：国家重点基础研究发展规划项目国家“\+!”项目（54.-##!(7+"=##%）
作者简介：吴明火（"\;#B），男，硕士研究生，研究方向：微生物工程。
联系人：郑裕国，EBZ86R：S,LA0Q0] SO2K . LV2. IA，T8W：#%+"B;;!-#=!#
54P Y -##%
·!-·
生 物 加 工 过 程
(,6ALJL ^42NA8R 4M 764[N4ILJJ EA06ALLN6A0
第 ! 卷第 $ 期
-##% 年 "" 月
万方数据
目前所用的生产对羟基苯乙酸的方法均为化学合成
法。国外有文献报导能将对羟基苯乙腈水解为对羟
基苯乙酸的菌株有 !"#$#%#%%&’ (&)*+,%*［!］及 -.%*.,/
01+1’ 2*1%*.,’ "#$［%］，前者能水解对羟基苯乙腈生成
对羟基苯乙酸，但其含有腈水解酶的同时也含有腈
水合酶和酰胺酶，反应中难免有酰胺生成，不是严格
意义上的腈水解酶。后者能以苯乙腈为底物经水合
酶和酰胺酶两步反应生成苯乙酸，其底物较为广泛，
能水解一些对位或间位被卤素、羟基等取代的苯乙
腈类物质。另也有以对羟基苯乙腈为底物进行水解
酶方面的研究［&］。利用腈水解酶催化水解对羟基苯
乙腈制备对羟基苯乙酸的反应如图 ’ 所示。本文主
要叙述产对羟苯乙腈水解酶产生菌的筛选及培养时
间、碳源、金属离子等对细胞酶活力的影响。
图 ’ 对羟基苯乙腈水解酶催化的反应
()* +’ ,-. /.012)34 35 67-89/3:8;.4<8=1804)9. 4)2/)=0>. 1020=8<.9
! 材 料
’ +’ 土 样
从杭州附近及舟山、东阳、金华、合肥等地采集
土样用以菌种筛选。
’ +? 培养基
’ +? +’ 富集培养基
葡萄糖 @ * A B，C?DEFG H +& * A B，CD?EFG $ +$ * A B，
#*IFG·%D?F H +? * A B，J0K= ’ * A B，(.IFG·%D?F
? L* A B，K0K=? ’@ L* A B，对羟基苯乙腈 ’ * A B，6D % +H
M % +?。’?’ N下灭菌 ?H L)4。
’ +? +? 斜面菌种保存培养基
葡萄糖 ’H * A B，酵母膏 $ * A B，C?DEFG H +? * A B，
CD?EFG H +G * A B，#*IFG·%D?F H +? * A B，J0K= ’ * A B，琼
脂 ?H * A B，6D自然。
’ +? +$ 发酵产酶培养基
葡萄糖 ?H * A B，酵母膏 @ * A B，尿素 % +@ * A B，味
精 H +%@ * A B，C?DEFG H +@ * A B。
摇瓶培养均在 ?& N，摇床转速 ’@H / A L)4。斜面
及平板培养均在生化培养箱中 ?& N培养。
" 方 法
? +’ 菌种筛选
? +’ +’ 富集培养
称取 @ * 土样于 @H LB 水中，用玻璃珠振荡打
碎，取悬浊液 @ LB于装有 G@ LB富集培养基的三角
瓶中，置于摇床 ?& N、’@H / A L)4 培养 G M @ 9。然后
取 ’ LB 富集后的培养物于 GH LB 新鲜的富集培养
基中再进行一轮培养。培养 G M @ 9 后进行涂平板。
将培养液进行梯度稀释，选取稀释度为 ’H O %、’H O &、
’H O P、’H O ’H等 G 个梯度进行涂布，每一梯度做两个
对照，每次吸取涂布的菌悬液为 H +’ LB。涂布完毕
后置于生化培养箱中 ?& N培养，培养时间主要以长
出合适大小的单菌落为参考，一般为 $ M G 9。待长
出合适的单菌落后，根据形态上的差异随机挑取单
菌落于试管斜面并分别编号，置生化培养箱中 ?& N
培养至长满整个斜面，时间一般为 $ M G 9。
? +’ +? 目标菌株的检出
? +’ +? +’ 菌体制备
从已长好的试管斜面上挑取一环菌体至装有
$H LB 发酵产酶培养基的 ?@H LB 三角瓶中，培养
G& -后又加入 @ LB的 H +?Q的对羟基苯乙腈水溶液
进行诱导培养 ?G -。后在 P HHH / A L)4下离心 ’H L)4
收集菌体，并用生理盐水洗涤两次，离心弃上清后备
用。
? +’ +? +? 转化
用 ’H LB 6D为 % +H 的 H +? L3= A B的磷酸钠盐缓
冲液洗下菌体并倒至 @H LB 的磨口三角瓶中，再加
入 H +?Q的对羟基苯乙腈水溶液 ’H LB，置于水浴摇
床上 $H N反应 ?G - 后取样，用 ,BK 检测是否有对
羟基苯乙酸生成。
? +’ +? +$ 检测方法
定性检测方法为薄板色谱法（,BK），板为普通
硅胶板，流动相组成为 3（乙醇）R 3（水）S P@ R @，对
羟基苯乙腈和对羟基苯乙酸的 ! 5值分别为 H +&@G 和
H +@@&。定量方法为高效液相色谱法（DEBK），文献
中报道分离对羟基苯乙腈及对羟基苯乙酰胺等物质
的流动相组成为 3（甲醇）R 3（水）R 3（四氢呋喃）R 3
（乙酸）S $@ R !@ R ’ R ’［P］，但用该组成的流动相分析对
?HH@ 年 ’’ 月 吴明火等：对羟基苯乙腈水解酶产生菌的筛选及产酶条件研究 ·$$·
万方数据
羟基苯乙酸与对羟基苯乙腈的混合物效果不佳，经
调整后的组成为 !（甲醇）! !（水）! !（四氢呋喃）! !
（乙酸）" #$ ! %$ ! & ! ’，流速 ’ () * (+,，检测波长为 -./
,(，该波长为对羟基苯乙腈和对羟基苯乙酸的最大
吸收波长。
! 结果与讨论
# 0’ 筛选结果
经过大批土样的筛选，我们筛选到了能水解对
羟基苯乙腈生成对羟基苯乙酸的菌株 $ 株，其中 12
与 $34# 活力较高，前者为细菌，后者则是霉菌。以
筛选得到的 12 菌株为研究对象，进一步考察其培养
条件。
# 0- 细胞活力与培养时间的关系
将 12 先进行液体种子培养，培养基成份同斜面
培养基，但不加入琼脂。培养至对数期后按 -5的
接种量接入发酵产酶培养基中进行培养，隔一段时
间取出两瓶测其在波长为 %66 ,(下的 "# 值及 78，
将其混合后取 #6 () 的培养液离心收集细胞，生理
盐水洗涤两次后置于 78 为 . 磷酸钠盐缓冲液中进
行转化，底物对羟基苯乙腈的浓度为 6 0’5，水浴摇
床的温度为 #6 9，经 - : 取样，用离心除细胞的方
法终止反应，取上清过滤后用 8;)< 检测对羟基苯
乙酸的生成量。细胞的活力以产物的峰面积比上对
应的 "# 值表示。结果如图 - 所示。
—!—"#%66；—"—78；—#—酶活
图 - 细胞酶活力与培养时间及 78的关系
=+> 0- 1??@AB C? ADEBDF@ B+(@ C, ,+BF+EGH@ GAB+I+BJ G,K 78
从图 - 可以得知，当我们以 -5的接种量接入
处于对数生长期的种子时，菌体生长的延滞期只有
/ L $ : 左右，此后进入对数生长期，在 $6 : 左右进
入稳定期。而酶的活力在细胞增长的过程中是逐渐
增加的，在进入稳定期后细胞的酶活力基本上已达
到了最高的水平，在培养至 .6 : 左右细胞酶活力出
现了下降，在 ’$6 : 时活力已经降到了比较低的水
平，下降的主要原因可能是细胞老化及细胞中酶的
失活。培养液中的 78 在培养的前期略有上升，但
进入对数期后 78 逐渐下降，在下降的过程中，细胞
的活力还保持了较高的水平，几乎没有下降。但在
培养至 26 : 左右时，78 开始上升，而且上升的幅度
较大，在培养至 ’$6 : 时已经接近 &。在 78 上升的
过程中，细胞活力则出现了明显的下降，在 78 接近
&时，细胞的活力几乎已经是最低的水平，该酶是否
在碱性条件下不稳定还有待确认。所以我们在离心
收集菌体的时间一般在 %6 L .6 : 附近，原因是在这
时候菌的总体活力已达到最高。虽然在 /6 : 左右
细胞酶活力已接近最大，但此时的菌体浓度还没有
达到最高，所以此时总体活力还不是最高。
# 0# 碳源对细胞酶活力的影响
在配方为酵母粉 $ > * )、（M8/）-NO/ $ > * )、
P-8;O/ 6 0$ > * )、P-8;O/ 6 0$ > * )、Q>NO/ 6 0$ > * ) 的
培养基中分别加入葡萄糖、甘露醇、麦芽糖、蔗糖及
甘油作为碳源，质量浓度分别为 ’6、’- 0$、’$ 及 -6 > *
)。将 12 先进行液体种子培养，培养基成份同斜面
培养基，但不加入琼脂。培养至对数期后按 -5的
接种量接入上述含有不同碳源的液体培养基中，培
养.- :后离心收集菌体。经生理盐水洗涤两次后于
磷酸钠盐缓冲液中与底物对羟基苯乙腈混合，底物
浓度最终为 6 0’5，在水浴摇床上 #6 9转化，分别在
反应 # : 及 / : 后取样，用离心除细胞的方法终止反
应，取上清过滤后用 8;)< 分析产物的生成量。# :
取样的结果如图 # 所示，/ : 取样时葡萄糖及甘露醇
活中已有反应完全。
图 # 不同碳源对细胞活力的影响
=+> 0# 1??@AB C? K+??@F@,B AGFRC, HCDFA@H C, ,+BF+EGH@ GAB+I+BJ
·#/· 生物加工过程 第 # 卷第 / 期
万方数据
从柱形图上可以反映出甘油和麦芽糖不是产酶
的合适碳源，蔗糖在浓度比较高的时候出现了较高
的细胞活力。葡萄糖和甘露醇是产酶的合适碳源，
但在质量浓度上，葡萄糖在用量为 !" #$ % & ’及 !$ % &
’时的酶活较合适，在 !( % & ’ 及 "( % & ’ 时活力都不
高，前者可能是因为产生的细胞浓度低所致，而后者
可能是因为碳源过高而不利于酶的形成。甘露醇则
在浓度上影响稍小一点，但在质量浓度为 !" #$ % & ’
的时候酶活最高，但仍然不及葡萄糖的效果好。所
以在其它成份不改变的情况下，应选取葡萄糖为碳
源，质量浓度在 !" #$ ) !$ % & ’附近为宜。
* #+ 金属离子对转化的影响
将培养至对数期 ,- 的种子按 ".的接种量接
入 !( 个装有发酵产酶培养基 !(( /’的 $(( /’的三
角瓶中进行培养，0" 1 后离心收集菌体，用生理盐水
洗涤两次后将所有的菌体悬浮于 23 为 0 的磷酸钠
盐缓冲液中，最终体积为 "$( /’，在 $(( /’ 的三角
瓶中用玻璃珠旋转振荡，使结块的菌体充分散开，制
得均匀的菌悬液。然后分别取 !( /’ 于 $( /’ 磨口
三角瓶中进行转化，底物质量浓度为 ( #! % & ’。金属
离子的浓度分别为 ( #*** //45 & ’ 和 ( #660 //45 & ’。
所用的金属盐分别为 7475"、8%75"、79:;+、<=75"、3%>
75"、’?75、@A:;+、7=75"、B?75、C5"（:;+）*、DE75*及 DE75"
等，并于不加任何金属离子的空白作对照。在反应
至" 1和 + 1 时分别取样，离心法去细胞终止反应。
最后用 3F’7分析检测，结果如图 + 所示。
图 + 金属离子对转化率的影响
D?% #+ ,GGEHIJ 4G K?GGELEAI /EI=5 ?4AJ 4A H4AMELJ?4A L=IE
图中白色的柱状图是在不加任何离子的情况下
得到的转化率。将 3F’7的检测结果与空白进行对
比，可以发现 79" N 对酶活具有强烈的抑制作用，在
浓度为 ( #*** //45 & ’ 的情况下还能检测到少量的
对羟基苯乙酸产生，但在浓度升高至 ( #660 //45 & ’
时 3F’7 就根本不能检测到对羟基苯乙酸生成。
74" N、3%" N、B? N 等对酶活具有明显的抑制，并且抑
制现象随离子浓度的升高而加强，在 ( #660 //45 & ’
浓度下的酶活力只有原来的一半左右。<=" N、8%" N
具有较明显的促进作用，但在高浓度下促进作用减
弱。C5* N、7=" N、DE" N、DE* N、’? N 等对酶活力也具有
一定的促进作用，其中 DE" N在 ( #660 //45 & ’ 时表现
出了较明显的促进作用。另 @A" N 在所测定的浓度
下对细胞酶活力的影响不明显。+1 取样的结果显
示活性较高的几个样品 C5* N、7=" N、DE" N、DE* N、’? N
中的对羟基苯乙腈已全部转化。
! 总结
本文报道了筛选得到的一株能产对羟苯乙腈水
解酶的微生物菌株 ,-，对其产酶的条件及不同金属
离子对该细胞在催化对羟苯乙腈生成对羟基苯乙酸
影响，结果表明碳源的不同会导致酶活的明显差别。
在所比较几种碳源中，葡萄糖最适合产酶而麦芽糖
最不适合。金属离子对细胞的酶活性影响明显，
79" N对该腈水合酶有强烈的抑制而 <=" N 有一定的
促进作用。其它一些有关该腈水解酶的性质正在研
究中。
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,9L42E=A P49LA=5 4G 00" O
（下转第 ++ 页）
"(($ 年 !! 月 吴明火等：对羟基苯乙腈水解酶产生菌的筛选及产酶条件研究 ·*$·
万方数据
!!"，检测波长 #!# $%。其他谱学数据（ &’，()，
*(’）均与 +, 标样一致。上述结果表明所得甾体
产物氢化可的松已达到药典标准。
! 结 论
采用静息细胞连续两批次转化方式，液相提取
及菌丝淘析处理方法的组合，提高了生物催化剂（菌
丝）的利用率。通过 # - 实验发酵罐的新月弯胞霉
的制备实验证明，该工艺对目标产物氢化可的松净
收率可达到 ./0，达到目前国外报道先进水平［#］。
此外分离回收未能参与转化的可再利用的高价值的
甾体底物 ’)，可有效提高甾体底物利用率，降低生
产成本。具有工业应用价值。
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G<98C:%<8=> ?:83><=;
8=?=G>: 9A 11!H+DE;9JD>=B<9$ 9A @B:;9
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［.］ )3VC9E9>@V=D= W]，7$L:>9U= K7，X9@C8C::$V9 X7，:B => 6 )D$BC:@<@ 9A
@B:;9
K<9VC<% (
［\］ ,C<$8C9>V=; W]，)3VC9E9>@V=D= W]，K=V>=@C9;= ^W，:B => 6 O:83><=;
!"#$"%&#’& %"(&)& KX( 2H.!! <$ BC: ?;:@:$8: 9A!H8D8>9E:JB;<$［[］6
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［"］ R=U<@ R[ 6 (<8;9G<=> %9E:>@ 9A %=%%=><=% E;3L %:B=G9><@%［(］6 1F""，
1F\H#1F 6
［F］ ,C:$ X,，_:D C3C 8CD3$ 6 11!HCDE;9JD>=B<9$ 9A 89JB:J9>9$: GD !"#$"*
%&#’& %"(&)& + I$ZD%: M %<8;9G<=> ^:8C$9>9LD，1FF/，1#（!）：P/QHP/" 6
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（上接第 PQ 页）
［"］ )C<%9$= W)，5=V<; W<;9$，5L=> WK，:B => 6 I>:8B;9$<8 )3G@B
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1FF1，Q"\：#"/H#"P 6
·!!· 生物加工过程 第 P 卷第 ! 期
万方数据