全 文 ：Mar．2008
· 28·
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
第6卷第2期
2008年3月
一株产红色素菌株及对其红色素结构的鉴定
张 梁1’2，郝名慧2，楼志华3，石贵阳1’2
(1．江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡214036；
2．江南大学 生物工程学院，无锡214036：
3．杭州师范学院 生命科学院，杭州310036)
摘要：从土壤中分离到一株产红色素的细菌[431，根据该菌株的16SrDNA序列与GenBank中已有序列比对的结
果，并结合茵落形态和常规生理生化鉴定方法对该菌株进行鉴定，结果表明：该茵在细茵分类学上属于肠杆菌科。
其与黏质沙雷氏茵(Serratiamarcescens)同源性最高，但该菌株生理生化实验中的赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶以及
精氨酸双水解酶实验与报道的曼marcescens的结果不一致，为一株新的黏质沙雷氏茵曼marcescensH31。通过紫
外光谱、质谱和核磁共振等方法分析，确定其产生的红色素为灵茵红素。
关键词：灵茵红素；红色素；16SrDNA；菌种鉴定
中图分类号：Q93-331 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2008)02—0028一05
Identificationof zymophytestraindelucidationthestructure
ofitsredpigment
ZHANGLian91一，HAOMing．hui2，LOUZhi—hua3，SHIGui．yan91，2
(1．KeyLaboratoryofIndustrialB otechnologyoftheMinistryofEducation，JiangnanUniversity，Wuxi214036，China；
2．SchoolfBiotechnology，JiangnanUniversity，Wuxi214036，China；
3．SchoolfLifeSciences。HangzhouNormal．University。Hangzhou310036，China)
Abstract：AredpigmentproducingbacterialstrainH31 wasisolatedfromsoil．Thestrainwasidentified
by16SrDNAsequenceandg neralphysiologicalandbiochemicalproperites．16SrDNAsequenceofthe
strainhadthesimilarityof99％withthatoftheSerratiamarcescensandthestrainwascategorizedtob
Enterobacteria．Whereasthegeneralphysiologicalandbiochemicalpropertiesofly ined earboxylase，or-
nithinede arboxylaseandargininedihydrolaseweredifferentfromhatoftherepoaedS．marcescens．It
WaspossiblyanewS．marcescensandWasnamedS．m们e$cen$subsp．H31．Theredpigmentwasiden-
tiffed硝prodigiosinbythemethodsfUV．LC／MSandlH．HMR．
Keywords：prodigiosin；redpigment；16SrDNA；strainidentification
开发天然色素是世界应用色素发展的总趋势，
很多天然色素具有安全可靠，没有毒副作用，色调
自然，接近天然物质等优点，天然、营养、多功能是
色素发展的趋势。天然色素如卢一胡萝卜素是人体
必需的营养物质，又如黄酮类天然色素，同时具有
一定的药理作用。随着加工行业的发展，色素的应
用也随之不断扩大，对天然色素的需求在不断的提
高。目前天然色素的获得主要有3条途径‘1|：一是
收稿日期：2007-05—19
基金项目：国家863计划重点课题资助项目(2007AAl00402)
作者简介：张梁(1978一)，男，江苏无锡人，博士，副教授，研究方向：工业生物转化与生物催化。E-mail：liangzhangl8@smaii．tom
万方数据
2008年3月 张梁等：一株产红色素菌株及对其红色素结构的鉴定 ·29·
直接提取，二是人工合成，三是利用生物技术生产。
但前两者受到资源和环境等多种因素的限制。近
年来随着生物技术的发展，利用生物技术生产天然
色素为人们开辟了广阔的领域。通过微生物资源
发酵生产红曲色素、类胡萝卜素等多种天然色素已
成为现实【2．3】。但其远不能满足现代食品工业发展
的需要，因此从自然资源中筛选具有产天然色素能
力的微生物，开发新品种的天然色素，尤其是具有
药用价值的天然色素，具有广阔的前景。
本文从土壤中筛选得到一株具有生产红色素
能力的红色短杆菌H31，并对此菌株进行菌种鉴定
的研究，在应用16SrDNA序列分析鉴定的基础上，
结合常规生理生化方法，确定了其在系统分类学上
的地位。最后通过uV、LC／MS和1H—NMR等波谱学
方法，对从该菌株中分离提取得到的玫瑰红色素进
行了结构鉴定。
1材料与方法
1．1材料
1．1．1菌株
菌株H31为本实验室从土壤中筛选并保藏。
1．1．2培养基
斜面培养基：营养琼脂培养基；种子培养基：葡
萄糖20g／L、蛋白胨10g／L、牛肉膏3g／L、氯化钠5
g／L、pH7．2—7．5。
1．1．3试剂与仪器
蛋白胨为晶美公司产品，琼脂糖为博大泰克公
司产品，TaqDNA聚合酶、核酸内切酶和连接酶均为
上海生工生物工程技术服务有限公司产品；载体购
自Promega公司；16SrDNA的细菌通用引物由北京
三博远志生物技术有限公司合成；PCR仪为Biotech
公司产品，H-700透射电镜购自日立公司。其他化
学试剂均为国产分析纯。
1．2菌株的鉴定方法
1．2．1细菌染色体DNA的提取
采用溶菌酶、SDS-蛋白酶K裂解，饱和酚沉淀
蛋白，再用异丙醇沉淀提取总DNAHl。
1．2．216SrDNA的扩增
使用细菌16SrDNA的通用引物F27(5’一
AGAG-ITI]rGATCCTGGC7I℃AG-3’)和R1522(5’-
7I’队TCC’rAG，I．ITIGCGCGC7rA-3’)进行PCR扩增。
1．2．3PCR扩增条件
反应体系：取DNA模板0．5pL，10×PCR缓冲
液5止，引物各O．5IxL，dNTPs4IxL，TaqDNA聚合
酶1灿，用双蒸水补至总反应体积为50灿。循环
参数：94℃预变性4min；94oC50s，60℃90s，72
℃60S，25个循环；72℃延伸10min。
1．2．4PCR产物的克隆和阳性克隆的鉴定
用胶回收试剂盒纯化PCR扩增产物，电泳验证
后，连接到pGEM—Teasy载体上，转化感受态E．coli
DHl0B宿主菌，经蓝白斑筛选，挑出阳性转化子，提
取质粒，酶切验证和PCR验证。
1．2．5 16SrDNA序列测定以及同源性和系统分析
将插入了16SrDNA基因的质粒进行测序(由
大连宝生物有限公司完成)。将测序结果输入NCBI
中用Blast程序交送GenBank数据库与已有序列进
行比较分析，应用DNAMAN软件构建进化树。
1．2．6菌株形态学、生理生化特征
根据《常见细菌系统鉴定手册》"1所列菌种鉴
定方法进行菌种鉴定。
1．3红色素结构鉴定方法
1．3．1色素的光谱分析
用U-3000紫外分光光度计在200～800nm波
长段扫描测得。
1．3．2色素的TOFMS分析
仪器：MircomassQ—TOFmicro质谱仪；溶剂：甲
醇；离子化方式：ESI(+)；Capillary：3000V；Sample
cone：35V；Extractionone：3．5V；Sourcetemp．：80
℃；Desolvationgas：200L／h；Pumpflow：10p。L／min；
Resolution：5000。
1．3．3色素的LC／MS分析
仪器：WatersZMD4000液质联用仪；色谱柱：
LiehrospherC18column(4．6mm×250mm)，流动
相：80％甲醇的水溶液，流速：1mL／min，柱温：30
oC；MS条件：ESI—MS锥孔电压60V，毛细管电压
3．88KV，离子源温度120℃，脱溶剂温度300℃。
1．3．4色素的NMR分析
1HNMR由Varian公司的核磁共振波谱仪Mer-
curyPlus500MHz测得，试剂为CDCl3。
2结果
2．1菌株鉴定
2．1．1菌株16SrDNA序列分析及鉴定
扩增得到的16SrDNA片段的大小为890bp，将
万方数据
· 30· 生物加工过程 第6卷第2期
测序结果输入NCBI中用Blast程序递交GenBank
数据库采用距离法与已有序列进行比较分析。根
据序列同源性分析可知，该菌株与数据库中的Ser-
ratiamarcescens有99％的同源性，与菌株H31有较
高相似性序列的系统发育树如图l所示，从系统进
化树可以看出与该菌株相似性最高的是＆marces．‘
celK$，表明该菌株与S．marcescens亲缘性最近。
H3l
SerratiamarcescensN4．1(AY5514435)
一EnterobacteriacaeaebacteriumPH31(AF513469)
’SerratiamarcescensNI．14(AY514433)
&rrat／amarcescensN1．8(AY514432)
Serrat／amarcescensRs-2(DQl12331)
--Serratkrmarce$ce珊(AY498856)
Pseudomona^fluorescensDQ439976)
rPseudomonastZuoresce,utrain3B(DQ417330)
LSerratiamarcescensAUl28S(AY04338)
Enterobacteriaceaebacerium(DQ226208)
Serratiasp．BBTR54(DQ337604)
Serratiasp．KMR一3(DQ6290261
Serrat／asp．MLO—l(AY8275771
图l 菌株H31的16SrDNA基因系统发育进化树
Fig．1Phylogenetictreesfor16SrDNAsequenceofthestrainH31
2．1．2菌种的生理生化鉴定
菌株H31革兰氏染色为阴性，短杆菌；营养琼
脂培养基上，30℃，培养20h后的菌落为红色，菌落
圆形，表面隆起，外型光滑，较黏稠，易挑起，边缘整
齐；通过透射电子显微镜观察(图2)，该菌株大小为
0．56p,m×0．93Ixm，有偏端丛生鞭毛，能运动，无芽
孢，无荚膜。
图2菌株H31透射电镜下的细胞形态(×30000)
Fig．2ThestrainH31cellmorphologyundertransmission
electronmicroscope(x30000)
进一步将该菌株与S．marcescens进行常规生理
生化特征比较，如表1所示，结果表明，菌株H31具
有发酵葡萄糖产酸不产气、V—P试验阳性以及M．R
试验阴性等特征，其在细菌分类学上属于肠杆菌
科。由常规生理生化实验并结合16SrDNA的序列
分析表明菌株H31为S．marcescens，但是该菌株生
理生化实验中的赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶以及
精氨酸双水解酶实验与报道的S．，№煳ce瑚㈨的结
果不一致，因此这是一株新的黏质沙雷氏菌Serratia
marcescensH31o
表1 菌株H31与黏质沙雷氏菌的生理生化鉴定比较
Table1 Physiologicalandbiochemicalcomparison
betweenthestrainH3l ands．marcescen$
运动性 +
革兰氏染色 一
M．R —
V．P +
H2S 一
触酶 +
脲酶 +
明胶液化试验 +
石蕊牛乳试验 +
西蒙斯氏柠檬酸盐+
乙醇的氧化 一
乙酸的氧化 一
淀粉水解 一
运动性 +
+ 肌醇
一 山梨醇
一／+ 棉籽糖
+ 鼠李糖
一 甘露醇
+ 麦芽糖
V 葡萄糖产酸
+ 葡萄糖产气
+ 乳糖发酵
+ 蔗糖发酵
ND精氨酸双水解酶
ND 鸟氨酸脱羧酶
一 赖氨酸脱羧酶
+ 苯丙氨酸脱羧酶
+ +
+ +
----
-_
一
+ +
+ +
+ +
一-●
一 一
一_-
．L 一
一4-
一 +
+ +
+一Positivereaction；一一Negativereaction；
V—variabIe：Nn一∞datum
万方数据
2008年3月 张梁等：一株产红色素菌株及对其红色素结构的鉴定 ·3l·
2．2红色素的结构鉴定
2．2．1色素的紫外扫描分析
紫外-可见光吸收图谱是鉴定色素种类的依据
之一，图3为色素的紫外扫描图谱。
200250300350400450500550600650
,,1Jnm
图3未知色素的紫外-可见光图谱
Fig．3TheUVspectrumof nknownpigment
由图3分析可知：该色素的最大吸收波长为
535nm，说明该色素的分子结构具有很大的共轭体
系，可能有很多共轭双键，苯环或类似苯环的共轭
结构，或含杂原子的一些杂环，而灵菌红素的最大
吸收波长为535nm，是含有杂环的结构，该色素的
紫外一可见光图谱与文献中报道的灵菌红素的紫外
吸收图谱一致o71。
2．2．2色素的LC／MS和NMR分析
色素粗品经硅胶柱层析和C18柱色谱层析，得
到一玫瑰红色组分，经HPLC检测，其纯度达到
97．35％，可以确定其为纯物质。色素纯品采用飞行
时间质谱TOFMS对其分析，结果如图4，从图中可
以看出，得到[M+H]的精确相对分子质量为
324．2060，由此精确相对分子质量可以计算得到其
分子式为C加H笛N，O，这与报道的灵菌红素的分子
式一致‘81。
回
325．2133
100140180220260300340380420460500
m／z
图4色素纯晶的飞行时间质谱图
Fig．4TheTOFMSoftheredpigment
图5为色素组分1的EMS—MS图谱。由图5分
析可知，在Es+图谱中有m／z324[M+H]，而在
Es．图谱中有m／z322[M-H]。据此判断该色素的
相对分子质量为323，这与TOFMS的结果一致。
1360
．．墨盟!黜啦一叩7傲．洳～一．．
3弛
253 M+1
25l
309325
一!翼{ljj13▲1簪“
／
．．●．．．i ●．．I一．●
100150200250300350400450500550
m／z
图5组分1的ESI—MS图谱
Fig．5ESI—MSspectrumofthetheredpigment
通过LC／MS还可以得到离子碎片m／z309、m／
Z294、m／z266、m／z252、m／z236、m／z161和m／z
149等，与报道的碎片数据基本一致一J。
红色素由核磁共振1H．NMR(CDCl，，TMS)分
析，其氢谱的化学位移8H结果(见表2)和已知的灵
菌红素的数据基本一致[1mu]。
表2红色素的1H．NMR数据
Table2 The
1
H—NMRdataoftheredpigment
综上所述，uV、MS和1H．NMR的结果均与灵菌
红素数据一致，由此确定该红色素结构为灵菌红素。
万方数据
· 32· 生物加工过程 第6卷第2期
2
21
3结论
H H
图6灵菌红素的结构
Fig．6Thefigureofprodigiosin
16SrDNA序列分析结果表明，该菌株与沙雷氏
菌属中＆marcescens的16SrDNA基因序列同源性
高达99％，进一步用常规生理生化鉴定发现，该菌
株具有发酵葡萄糖产酸不产气、V—P试验阳性以及
M—R试验阴性等特征，属于肠杆菌科，该结果与16S
rDNA鉴定结果相一致，但生理生化实验中的赖氨
酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶以及精氨酸双水解酶实验
与报道的S．marcescens的结果不一致，由此该菌株
可能为一株新的黏质沙雷氏菌Serratiamarcescens
H31。通过UV、LC／MS和1H—NMR等方法，对细胞
内提取得到的红色素进行鉴定，确定该玫瑰红色素
为灵菌红素(pfiodigiosin)。
灵菌红素是一类天然的三吡咯类红色素，它具
有抑制细菌、真菌和疟疾等活性，更重要的是其具
有抗肿瘤作用，因此备受学者关注¨2|。目前已有通
过化学合成灵菌红素的报道，但由于化学合成工艺
的复杂性等多种因素的限制，至今尚未能进行大规
模的生产，灵菌红素这一具有极高应用价值的活性
成分各方面的研究及应用都受到极大的限制。通
过分子生物学方法改善微生物菌株的生产性能以
及对其发酵工艺的研究，由微生物发酵法生产灵菌
红素，是解决灵菌红素来源的局限性的有效途径之
一。为此，在后续的研究中，进一步研究如何提高
S．rnarcescens的灵菌红素的产量有重要的意义。
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