全 文 ：第９卷第１期
２０１１年１月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．９Ｎｏ．１
Ｊａｎ．２０１１
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－３６７８．２０１１．０１．０１３
收稿日期：２０１０－０６－１２
基金项目：科技部资助项目（２００９ＧＪＡ１００４７）；天津市科委资助项目（０７ＺＨＸＨＮＣ０４５００和０９ＺＣＺＤＳＦ０４２００）
作者简介：张彬彬（１９８６—），女，内蒙古赤峰人，硕士研究生，研究方向：纳米生物传感器；张娟琨（联系人），教授，博士生导师，Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｉｋ＠
ｔｕｓｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
多孔硅适配子生物传感器的电化学研究
张彬彬，张娟琨，曾志鹏，李成学，刘 臖，王纪东
（天津科技大学 生物工程学院 天津市工业微生物重点实验室
教育部工业微生物重点实验室，天津 ３００４５７）
摘 要：构建１种用于快速检测四环素的新型电化学纳米多孔硅（ＰＳ）生物传感器。通过脉冲腐蚀法制得多孔硅基
片，将适配子固定于其上，这种四环素适配子能够特异性识别四环素分子，并引起阻抗值的变化。利用电化学交流
阻抗法比较固定适配子前后硅片表面阻抗值的变化，以及在体系中加入不同浓度四环素后阻抗谱的变化。选择１
个合适的等效电路对测得的阻抗数据进行拟合，获得了四环素浓度与阻抗值的变化规律。传感器的线性检测范围
为２０７９～６２３７ｎｍｏｌ／Ｌ，检测限为２０７９７ｎｍｏｌ／Ｌ。
关键词：适配子；阻抗；纳米多孔硅；四环素
中图分类号：Ｒ３９２．１１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２０１１）０１－００６１－０５
Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔｕｄｙｏｆａｐｔａｍｅｒｂｉｏｓｅｎｓｏｒｏｎｎａｎｏｐｏｒｏｕｓｓｉｌｉｃｏｎ
ＺＨＡＮＧＢｉｎｂｉｎ，ＺＨＡＮＧＪｕａｎｋｕｎ，ＺＥＮＧＺｈｉｐｅｎｇ，ＬＩＣｈｅｎｇｘｕｅ，ＬＩＵＪｕｎ，ＷＡＮＧＪｉｄｏｎｇ
（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＴｉａｎｊｉｎＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，
ＣｏｌｅｇｅｏｆＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＴｉａｎｊｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｉｇｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ３００４５７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｎｅｗｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｎａｎｏｂｉｏｓｅｎｓｏｒｗａｓｐｒｅｐａｒｅｄｂａｓｅｄｏｎｐｏｒｏｕｓｓｉｌｉｃｏｎ（ＰＳ）ｆｏｒｒａｐｉｄｄｅ
ｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ．Ｎａｎｏｐｏｒｏｕｓｓｉｌｉｃｏｎｗａｓｆａｂｒｉｃａｔｅｄｕｓｉｎｇａｎｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｅｔｃｈｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓ．
ＡｐｔａｍｅｒｓｗｅｒｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｏｎｔｈｅＰＳｓｕｒｆａｃｅ．Ｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｂｉｎｄｉｎｇｏｆｔｈｅｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｔｏｉｔｓａｐｔａｍｅｒｌｅａ
ｄｅｄｔｏａｄｅｃｒｅａｓｅｉｎｉｍｐｅｄａｎｃｅ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｉｍｐｅｄａｎｃｅｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＥＩＳ）ｗａｓｕｓｅｄｔｏｃｏｍｐａｒｅ
ｉｍｐｅｄａｎｃｅｃｈａｎｇｅｓｏｆａｐｔａｍｅｒｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｗｉｔｈｆｒｅｅＰＳ．Ｔｈｅｃｏｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｉｍｐｅｄａｎｃｅｓｐｅｃｔｒａ（Ｎｙｑｕｉｓｔ
ｐｌｏｔｓ）ｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｗｈｅｎｓｅｒｉａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｗｅｒｅａｄｄｅｄｉｎｔｏｔｈｅｓｙｓｔｅｍ．Ａｎｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ
ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｃｉｒｃｕｉｔｗａｓｕｓｅｄｔｏｆｉｔｔｈｅｏｂｔａｉｎｅｄｉｍｐｅｄａｎｃｅｄａｔａ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｄｅｃｒｅａｓｅｏｆ
ｔｈｅｉｍｐｅｄａｎｃｅｗａｓｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌｔｏｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ．Ｔｈｅｌｉｎｅａｒｒａｎｇｅｏｆｔｈｅｓｅｎｓｏｒｗａｓ
２０７９ｎｍｏｌ／Ｌｔｏ６２３７ｎｍｏｌ／Ｌａｎｄｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｗａｓ２０７９７ｎｍｏｌ／Ｌ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｐｔａｍｅｒ；ｉｍｐｅｄａｎｃｅ；ｎａｎｏｐｏｒｏｕｓｓｉｌｉｃｏｎ；ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ
纳米多孔硅（ＰＳ），具有比表面积大、在紫外线
激发下可以发射荧光、易于整合到电化学系统中等
特点。自２０世纪５０年代 Ｕｈｌｉｒ［１］和 Ｔｕｒｎｅｒ［２］第一
次发现多孔硅以来，纳米多孔硅材料在生物传感器
领域得到了广泛的应用［３－１０］。
适配子是１种独特的单链核苷酸，它可以与非
核苷酸靶目标物质进行高亲和力、高特异性的结
合［１１］，并通过指数富集配基的系统进化技术进行体
外筛选、扩增和富集［１２－１３］。在医学诊断和探测试验
中，适配子以它高效、灵敏的优点逐渐取代了抗体。
近年来，基于荧光技术［１４－１６］、电化学检测技术［１７－１９］
以及红外光谱［２０－２１］开发出的适配子生物传感器已
经有很多报道。在众多的检测方法中，由于阻抗传
感器具备免标记、快速、灵敏等特点，所以在目前的
研究中受到了很多的关注。ＥＩＳ阻抗传感器是利用
电化学工作站对构建的电极进行阻抗谱分析。在
检测系统中加入目标分子后，传感器表面的介电常
数发生变化，从而导致阻抗值的最终变化。
本文报道了一种用多孔硅材料制作的阻抗生
物传感器，将多孔硅、适配子和阻抗检测技术结合
起来，构建出一个免标记、高效且灵敏的生物传感
器。通过在纳米多孔硅表面固定四环素适配子，利
用其对四环素的特异性识别能力和电化学交流阻
抗法快速检测溶液中四环素浓度的变化，从而测定
溶液中四环素分子的含量。
１ 材料与方法
１．１ 实验材料和仪器
Ｐ（１００）单晶硅片（电阻率０１５～０２Ω·ｃｍ），
购于天津半导体研究所；０２ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７０的 ＰＢＳ
缓冲液，自配；牛血清白蛋白（ＢＳＡ），四环素，北京鼎
国生物技术有限公司；双氧水，氨水，３ 氨丙基三乙
氧基硅烷（ＡＰＴＥＳ），大连奥利凯化工有限公司；其
他试剂均为国产分析纯。
德国 ＺＡＨＮＥＲＩｍ６／６ｅｘ电化学工作站系统，北
京清大智杰科技有限公司；ＬＫ２００５Ａ型电化学工作
站，三电极系统：硅片为工作电极，Ａｇ／ＡｇＣｌ电极为
参比电极，铂电极为对电极，天津兰力科化学电子
高技术有限公司；ＨＨ Ｓ水浴锅，国胜仪器实验厂；
ＪＥＯＬＪＳＰＭ ５２００原子力显微镜，日本岛津公司；脉
冲信号发生器：ＳＵＮＧＴＥＧ２００３ＤＤＳ函数信号发生
器，石家庄数英电子科技有限公司。
１．２ 实验方法
１．２．１ 多孔硅的制备与氧化膜的形成
选择Ｐ（１００）单晶硅片，通过阳极电化学脉冲腐
蚀制备多孔硅，控制脉冲频率为２０Ｈｚ，脉冲幅度为
８ｍＶ，占空比为０５，腐蚀时间１ｈ。该腐蚀过程在
自制的聚四氟乙烯容器中进行，选择铂柱电极为阴
极，硅片为阳极。腐蚀液为Ｖ（４８％ＨＦ）∶Ｖ（无水乙
醇）∶Ｖ（Ｈ２Ｏ）＝１∶１∶２。
刚制备好的多孔硅片用去离子水冲洗，用
０５％的Ｈ２Ｏ２为电解液进行阳极氧化，处理２０ｍｉｎ，
使多孔硅表面形成一层很薄的氧化膜。然后将多
孔硅片浸入Ｖ（ＮＨ３）∶Ｖ（Ｈ２Ｏ２）∶Ｖ（Ｈ２Ｏ）＝１∶１∶１０
组成的混合溶液中，７０℃保温２０ｍｉｎ，进行亲水化
处理以改变多孔硅表面的氧化层的疏水性，同时使
多孔硅表面更加均匀。处理完毕后用蒸馏水冲洗
干净，在真空干燥箱中２００℃干燥处理１ｈ。
１．２．２ 适配子的固定化
用ＡＰＴＥＳ修饰多孔硅表面。将ＡＰＴＥＳ与去离子
水按体积比１∶１０的比例混合，用１ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ溶液
调整此混合液的ｐＨ为７０。混合液置于５３℃恒温水
浴，把制备好的多空硅片浸入上述溶液中反应３ｈ。然
后用去离子水冲洗干净，在真空干燥箱中干燥处理。
取１０μＬ２５％的戊二醛溶液铺展于上述ＡＰＴＥＳ
修饰过的多孔硅片上，室温２ｈ，使其充分反应。然后
用去离子水冲洗，室温晾干。将５ｎｇ／μＬ的四环素适
配子溶液１０μＬ铺展于修饰过的多孔硅片上，室温
过夜，使其充分反应，然后用去离子水冲洗。用
２０ｍｇ／ｍＬＢＳＡ溶液封闭多孔硅的空白位点。之后用
大量ｐＨ７０的ＰＢＳ溶液冲洗，储存于真空干燥器中。
１．２．３ 交流阻抗法测定
电化学检测采用三电极体系：用多孔硅传感器
作为工作电极，铂柱电极作为对电极，Ａｇ／ＡｇＣｌ作
为参比电极。在电化学交流阻抗法测量中，频率扫
描的范围选择００１～１００ｋＨｚ，在开路电位下从高
频１００ｋＨｚ开始扫描，扫描速度 ５ｍＶ／ｓ，在 ＺＡＨ
ＮＥＲＩｍ６／６ｅｘ电化学工作站上进行测量。
１．２．４ 待测物的检测
待测物溶液即盐酸四环素溶液由 ＰＢＳ缓冲液
配制而成。由于多孔硅材料的重复性，将待测物逐
级滴加到检测体系中，使待测物的浓度逐渐提高。
在电化学系统稳定１ｈ之后，每隔１５ｍｉｎ向体系中
滴加 １次待测物，使其浓度逐级从 ２０７９达到
２０７９ｎｍｏｌ／Ｌ，分别检测各个质量浓度对应的交流
阻抗谱。１５ｍｉｎ的时间间隔是为了保证四环素适
配子和四环素之间能充分地反应。
２ 结果与讨论
２．１ 多孔硅表面结构的表征
通过脉冲腐蚀法制备多孔硅，获得了结构稳定
且不易脱落的多孔硅结构。用原子力显微镜
（ＡＦＭ）获得的多孔硅表面结构的微观形貌如图 １
所示。从图１中可以看出明显的孔状结构。
２６ 生 物 加 工 过 程 第９卷
图１ 脉冲法腐蚀制备的多孔硅表面ＡＦＭ图（ａ）和表面结构的三维模型（ｂ）
Ｆｉｇ．１ ＴｈｅＡＦＭ ｉｍａｇｅｏｆＰＳｓｔｒｕｃｔｕｒｅｐｒｅｐａｒｅｄｂｙｐｕｌｓｅｄｃｕｒｒｅｎｔｅｔｃｈｉｎｇ（ａ）ａｎｄ３Ｄｍｏｄｅｌｏｆｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（ｂ）
２．２ 适配子固定化
将原四环素适配子（２５ｎｇ／μＬ）稀释 ５倍，取
１０μＬ滴于处理好的硅片上，即 ＤＮＡ总量为５０ｎｇ。
过夜，待完全反应后用蒸馏水冲洗，用 ＢＳＡ封闭。
将硅片表面刮下，将碎屑加入１０μＬ蒸馏水中混匀，
做琼脂糖电泳，并重复一次，实验结果如图２所示。
由图２可知，适配子被成功固定到了多孔硅表面。
１—１０μＬ适配子（５ｎｇ／μＬ），阳性对照；
２，３—固定１０μＬ适配子（５ｎｇ／μＬ）的硅片；
４—没有固定适配子的硅片，阴性对照
图２ 琼脂糖凝胶电泳图
Ｆｉｇ．２ Ａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｖｅａｐｔａｍｅｒ
ｌｏｔｉｏｎａｆｔｅｒｍｏｄｉｆｉｎｇａｐｔａｍｅｒｏｎｔｈｅＰＳｓｕｒｆａｃｅ
２．３ 适配子固定化前后多孔硅交流阻抗谱的比较
通过交流阻抗法的频率扫描测量，获得传感器表
面阻抗的Ｎｙｑｕｉｓｔ谱图（图３），其中纵坐标为阻抗值
的虚部，横坐标为阻抗值的实部。由图３可知：当对
空载硅片和修饰了四环素适配子以后的硅片进行交
流阻抗法的频率扫描时，传感器表面的阻抗值会有明
显的降低，这可能是由于四环素适配子与硅片表面
结合后，硅片表面的电荷发生了重新排布，改变了传
感器表面的介电常数，从而导致阻抗值的变化。
图３ 电化学阻抗谱
Ｆｉｇ．３ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｉｍｐｅｄａｎｃｅｓｐｅｃｔｒａ
２．４ 交流阻抗法检测四环素
在缓冲体系中加入不同浓度的盐酸四环素时，
传感器表面的阻抗值变化（图４）会明显下降；而对
照组的阻抗值却没有发生很明显的变化（图５）。将
测得的阻抗数据通过 ＺＳｉｍｐＷｉｎ软件进行阻抗拟
合，选择３个电化学元件，分别为缓冲液的电阻 ＲＬ、
多孔硅电极的电容Ｃｄ（由半导体表层空间电荷区电
容、绝缘层电容、电极表面双电层电容串联而成）以
及多孔硅电极的电荷移动电阻 Ｒｃｔ。Ｒｃｔ与 Ｃｄ并联后
再与溶液电阻ＲＬ串联构成多孔硅传感器的总阻抗，
对应的阻抗电路如图６所示。
各个拟合电化学元件的值如表１所示。从表１
可知：Ｒｃｔ远远大于 ＲＬ，也就是说相对于电极的电荷
电阻，溶液电阻几乎可以忽略。由阻抗平面图有公
式（１）。
（ＺＲｅ－ＲＬ－Ｒｃｔ／２）
２＋Ｚ２ｌｍ ＝（Ｒｃｔ／２）
２ （１）
式（１）可知，阻抗弧与阻抗实轴的交点与原点的距
离为ＲＬ。从多孔硅阻抗的复平面图（图３～图５）中
可知：阻抗弧几乎是从０开始，也就是说相对于Ｒｃｔ，
ＲＬ几乎可以忽略，与阻抗拟合的结果相一致（表１）。
３６ 第１期 张彬彬等：多孔硅适配子生物传感器的电化学研究
图４ 固定适配子的多孔硅基片吸附不同
浓度的四环素的Ｎｙｑｕｉｓｔ图谱
Ｆｉｇ．４ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｉｍｐｅｄａｎｃｅｓｐｅｃｔｒａａｆｔｅｒ
ａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
图５ 空白对照的多孔硅基片吸附不同
浓度的四环素的Ｎｙｑｕｉｓｔ图谱
Ｆｉｇ．５ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｉｍｐｅｄａｎｃｅｓｐｅｃｔｒａａｆｔｅｒ
ａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ
图６ 阻抗谱的拟合电路
Ｆｉｇ．６ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｃｉｒｃｕｉｔｅｍｐｌｏｙｅｄｆｏｒａｌｄａｔａｆｉｔｓ
表１ 拟合电路元件表
Ｔａｂｌｅ１ Ｔｈｅｅｌｅｍｅｎｔｏｆｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｃｉｒｃｕｉｔ
拟合电路元件 数值 拟合误差／％
ＲＬ ３８８６Ω １１４０
Ｃｄ ２３０３×１０－７Ｆ １０７７
Ｒｃｔ ５３５３×１０４Ω １１７８
图７为阻抗拟合值与２０７９～２０７９ｎｍｏｌ／Ｌ的
四环素浓度的变化关系图。根据阻抗的拟合值与
吸附四环素浓度的相关关系，发现当吸附四环素浓
度在２０７９～６２３７ｎｍｏｌ／Ｌ的范围内有较好的线性
关系，易于绘制标准曲线，待测物的最低检测限为
２０７９７ｎｍｏｌ／Ｌ，如图８所示。
图７ 阻抗 四环素浓度（２０７９～２０７９ｎｍｏｌ／Ｌ）的变化
Ｆｉｇ．７ ＦｉｔｉｎｇｖａｌｕｅｓｏｆＲｃｔｖｓ．ｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｆｒｏｍ
２．０７９～２０７９ｎｍｏｌ／Ｌ
图８ 阻抗 四环素浓度（２０７９～６２３７ｎｍｏｌ／Ｌ）
的线性关系
Ｆｉｇ．８ ＬｉｎｅａｒｒａｎｇｅｏｆＲｃｔｖｓ．ｔｈｅｃｏｒｒｅｐｏｎｄｉｎｇ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｔｅｔｒｄｅｙｃｌｉｎｅｆｒｏｍ
２．０７９～２０７．９ｎｍｏｌ／Ｌ
３ 结 论
构建了１种免标记的，可高效、灵敏、快速检测
四环素的新型电化学阻抗生物传感器，成功地将纳
米多孔硅材料应用到电化学生物传感器领域中。
通过脉冲腐蚀法成功地制备了纳米多孔硅，并对其
进行了表面修饰，通过ＡＦＭ以及电化学方法对其表
面进行了表征。将适配子固定到多孔硅表面，通过
其对四环素的特异性识别能力，利用电化学交流阻
抗法来检测溶液中的四环素浓度。选择合适的阻
抗电路图通过 ＺＳｉｍｐＷｉｎ软件进行阻抗拟合，获得
４６ 生 物 加 工 过 程 第９卷
了目标分子四环素与阻抗值的变化规律。传感器
的线性检测范围为２０７９～６２３７ｎｍｏｌ／Ｌ，检测限为
２０７９７ｎｍｏｌ／Ｌ。
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５６ 第１期 张彬彬等：多孔硅适配子生物传感器的电化学研究